Przykładowe ćwiczenia z wybranych technik chemii białek

Rozdział 11
Przykładowe ćwiczenia z wybranych technik chemii białek
11.1. Spektrofotometryczne oznaczanie stęŜenia białek
Szybką (bezpośredni odczyt), prostą (bez konieczności dodawania odczynników) i
niedestrukcyjną (całkowity odzysk białka) metodą oznaczania stęŜenia białek w roztworach
jest pomiar absorbancji w zakresie ultrafioletu (UV). Pomiarów dokonuje się w tzw. bliskim
(280 nm) lub dalekim ultrafiolecie (205 nm). W pierwszym przypadku wykorzystujemy fakt
istnienia w białkach aminokwasów aromatycznych, głównie tryptofanu oraz tyrozyny i w
mniejszym stopniu cysteiny. Teoretyczną zaleŜność wartości absorbancji danego białka od
ilości powyŜszych reszt moŜna przedstawić równaniem:
A [1 mg/ml] = (5550nTrp + 1490nTyr + 125nCys)/M,
gdzie n odpowiada ilości reszt odpowiednich aminokwasów, M to masa molowa białka, zaś
5550, 1490 i 125 są wartościami współczynników absorbcji danych aminokwasów przy 280
nm. W powyŜszym wzorze nie uwzględniono reszt fenyloalaniny ze względu na zbyt niski
udział tego aminokwasu w ogólnej absorbancji białka dla tej długości fali. Fałdowanie białek
często w znacznym stopniu wpływa na własności absorbcyjne reszt aminokwasowych i
dlatego teŜ przedstawiona zaleŜność ma charakter teoretyczny i kaŜde białko posiada
indywidualny, praktycznie wyznaczony współczynnik absorbcji, charakterystyczny dla
danego pH i siły jonowej. Warto teŜ pamiętać, Ŝe współczynniki absorbcji są najczęściej
podawane w trzech jednostkach stęŜeniowych: jak wyŜej w mg/ml lub teŜ g/100g roztworu
%
(procentowy współczynnik absorbcji, A1
1cm ) albo w mol/litr (molowy współczynnik
absorbcji, ε). Większość białek ma przy długości fali 280 nm współczynnik absorbcji w
zakresie 0.5-2 dla stęŜenia 1 mg/ml.
Absorbancja roztworów białek w dalekim ultrafiolecie wynika z silnego absorbowania przez
wiązanie peptydowe światła o długości fali 190 nm. PoniewaŜ pomiar absorbancji przy tej
długości fali sprawia trudności techniczne (odpowiedni materiał konstrukcyjny kuwety,
konieczność prowadzenia pomiarów w gazie obojętnym), w praktyce dokonuje się pomiarów
przy mniej kłopotliwej długości 205 nm. Większość białek posiada przy stęŜeniu 1 mg/ml
wartość absorbancji przy 205 nm rzędu 30-35 i dlatego teŜ pomiar stęŜenia białka przy tej
długości fali jest bardzo czuły. NaleŜy pamiętać jednak, Ŝe nie jest to pomiar selektywny
tylko na wiązanie peptydowe poniewaŜ takie aminokwasy jak Trp, Phe, Tyr, His, Cys, Met i
Arg posiadają teŜ znaczący udział w absorbancji przy 205 nm. Ograniczeniem jest równieŜ to,
Ŝe pomiar absorbancji przy 205 nm nakłada wymagania odnośnie składu roztworów w
których białka są rozpuszczone, wiele pospolitych buforów jak np. octan, cytrynian czy
mrówczan istotnie absorbują światło przy tej długości fali.
Szczególnym przypadkiem białek, których nie moŜna oznaczać drogą pomiaru absorbancji w
ultrafiolecie są białka barwne, zawierające chromofory. Takie ugrupowania chemiczne w
ogromnej większości bardzo intensywnie absorbują światło w zakresie ultrafioletu,
całkowicie tłumiąc własności absorbcyjne łańcucha polipeptydowego. StęŜenie tych białek
mierzy się wówczas przy długościach fal charakterystycznych dla absorbcji chromoforu,
często w świetle widzialnym. Trzeba jednak pamiętać, Ŝe współczynnik absorbcji wielu
chromoforów nie jest zmienny i często zaleŜy od stopnia utlenienia, pH czy siły jonowej.
Przykładowym białkiem rozpatrywanym na niniejszych ćwiczeniach będzie cytochrom c. W
białku tym redukcja i utlenianie Ŝelaza hemowego (Fe3+ + e- ↔ Fe2+) prowadzi do zmian w
widmie absorbcyjnym. Ilościowe oznaczenie zawartości cytochromu polega na pomiarze
absorbancji roztworów zarówno formy zredukowanej jak i utlenionej przy 550 nm. Ilość
cytochromu oblicza się wykorzystując róŜnicę zmierzonych wartości absorbancji.
11.1.1. Pomiar stęŜenia albuminy wołowej
Wykonanie
Do kuwety kwarcowej odmierzyć 970 µl 10 mM buforu fosforanowego pH 7,4 i 30,8 µl
roztworu albuminy wołowej (BSA) o stęŜeniu 32,5 mg/2 ml. Wymieszać i zmierzyć
absorbancję przy 280 nm względem wody. Kuwetę przepłukać woda, odmierzyć 800 µl
buforu fosforanowego jak wyŜej, dodać 50 µl roztworu albuminy o nieznanym stęŜeniu i
ponownie zmierzyć absorbancję.
Opracowanie wyników
BSA zawiera 2 reszty tryptofanu, 20 reszt tyrozyny oraz 35 reszt cysteiny. Na podstawie
tych wartości obliczyć teoretyczny współczynnik absorbcji procentowej A1% (masa
1cm
molowa BSA wynosi 68 kDa). Następnie na podstawie wyniku pomiaru absorbancji
preparatu BSA o znanym stęŜeniu obliczyć współczynnik doświadczalny. Porównać obie
wartości z literaturowym procentowym współczynnikiem doświadczalnym wyznaczonym
wagowo i wynoszącym 6,14. Przedyskutować rozbieŜności. Na podstawie wyniku
pomiaru absorbancji nieznanej próbki obliczyć stęŜenie BSA w badanym roztworze w
jednostkach mg/ml.
11.1.2. Pomiar stęŜenia cytochromu c
Wykonanie
1. Wykreślenie widma absorbcyjnego
Do kuwety plastikowej odmierzyć 1 ml 0,1 M buforu fosforanowego pH 7,4, dopełnić
wodą do 3 ml po czym dodać kilka kryształków ditionianu sodu Na2S2O4 i na tak
przygotowanej ślepej wykalibrować spektrofotometr. Próbkę pomiarową przygotować
identycznie, dodając dodatkowo 0,1 ml roztworu cytochromu c o stęŜeniu 20 mg/ml i
odpowiednio zmniejszając objętość dodawanej wody. Po wymieszaniu wykreślić widmo
absorbcyjne w zakresie 540-560 nm. Z wykresu odczytać połoŜenie i wartość szczytowej
absorbancji formy zredukowanej cytochromu.
2. Oznaczenie stęŜenia cytochromu c
Przygotować próbę ślepą odmierzając do kuwety 1 ml buforu fosforanowego, 0,1 ml 0.01
M roztworu K3Fe(CN)6 i 1,9 ml wody. Nastawić spektrofotometr na maksimum
absorbancji zredukowanej formy cytochromu i dokonać zerowania instrumentu. W drugiej
kuwecie przygotować identycznie próbkę pomiarową, dodając 50 µl roztworu cytochromu
c o nieznanym stęŜeniu i zmniejszając o taką samą objętość ilość dodawanej wody. Po
wymieszaniu zmierzyć wartość absorbancji, doprowadzić cytochrom do formy
zredukowanej poprzez dodanie kilku kryształków ditionianu sodu i ponownie dokonać
pomiaru absorbancji. W celu skontrolowania, czy cytochrom uległ całkowitej redukcji
ponownie dodać do obu kuwet ditionianu i dokonać zerowania oraz pomiaru absorbancji.
Pomiar nie powiniem wykazać róŜnic.
Opracowanie wyników
StęŜenie cytochromu c w badanym roztworze obliczyć z następującego wyraŜenia:
c [mol/l]= ((Azred - Autl) * l * f) / ε
gdzie:
Azred, Autl - wartość absorbancji przy 550 nm form zredukowanej i utlenionej,
l - grubość warstwy roztworu w cm,
f- współczynnik rozcieńczenia,
ε - molowy współczynnik absorbcji równy 2.11*104 M-1cm-1
Wynik podać w mg/ml. Na podstawie wartości maksimum absorbancji zredukowanej
formy cytochromu c obliczyć wartość molowego współczynnika absorbcji przy
wyznaczonej długości fali. Masa cząsteczkowa cytochromu c wynosi 12, 27 kDa.
11.2. Oznaczanie grup aminowych z uŜyciem odczynnika TNBS
Kwas 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowy (TNBS) reaguje selektywnie z grupami α- i εaminowymi białek i peptydów. Podczas przeprowadzanej w zasadowym środowisku reakcji
dochodzi do wymiany grup siarczynowych TNBS na oznaczane grupy aminowe. Po reakcji
wymiany mieszaninę doprowadza się do pH obojętnego buforem zawierającym nadmiar
jonów siarczynowych, które tworzą z powstałymi trinitrofenyloaminami pomarańczowe
związki kompleksowe oznaczane spektrofotometrycznie przy 420 nm.
NO2
NO2
NO2
:NH2R
SO3-
NO2
NO2
NO2
Grupy
trinitrofenylo-α-aminowe
NHR + SO32- + H+
i
trinitrofenylo-ε-aminowe
tworzą
kompleksy
o
współczynnikach absorbcji molowej przy 420 nm odpowiednio 22 000 i 19 200 M-1cm-1.
PoniewaŜ zgodnie z prawem Lamberta-Beera współczynniki te są addytywne, to znając ilość
odpowiednich grup aminowych w białku czy peptydzie moŜna obliczyć teoretyczną
absorbancję molową ich trinitrofenylowych pochodnych, która z kolei po pomiarze
absorbancji pozwala na wyznaczenie stęŜenia białka (lub peptydu). TNBS reaguje równieŜ z
grupami tiolowymi, lecz ze względu na niską wartość współczynnika absorbancji molowej
takiej pochodnej (2 250 M-1cm-1) oraz fakt, Ŝe większość cystein w natywnych białkach
występuje w postaci mostków disiarczkowych, pomija się ten składnik przy obliczeniach.
Tym niemniej, gdy udział wolnych cystein w oznaczanym białku lub peptydzie jest znaczny
naleŜy go oczywiście uwzględnić.
Oznaczając przy uŜyciu TNBS grupy aminowe białek lub peptydów o znanej sekwencji
moŜemy wyznaczyć ze znaczną dokładnością ich stęŜenie. Metoda te ma równieŜ i
zastosowanie w badaniach struktury i dynamiki cząsteczek białkowych. Przykładowo, kreśląc
krzywe zaleŜności absorbancji (a tym samym ilości reagujących grup aminowych) od czasu i
interpretując kształt tych krzywych metodami matematycznymi jesteśmy w stanie określić
dostępność grup aminowych (a więc ich lokalizację na powierzchni lub we wnętrzu
cząsteczki białka) oraz zdefiniować istnienie w badanym białku określonych przestrzennie
klas grup aminowych.
Wykonanie
1. Do sześciu probówek odmierzyć kolejno 7, 10 i 15 µl roztworu lizozymu z jaja kurzego
(nawaŜka 14,6 mg/mi) oraz 5, 10 i 15 µl roztworu wołowego chymotrypsynogenu A
(nawaŜka 15 mg/mi). KaŜdą probówkę dopełnić wodą do 250 µl. Przygotować dwie
próby „ślepe” zawierające jedynie po 250 µl wody.
2. Do wszystkich probówek dodać po 250 µl buforu boranowego (pH 9,5) i 10 µl roztworu
TNBS (1,1 M) i natychmiast wymieszać.
3. Próbki inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.
4. Do wszystkich probówek dodać po 1 ml buforu fosforanowo-siarczynowego (0,1 M
kwaśny fosforan sodu z dodatkiem 1,5 mM siarczynu sodu), zamknąć, wymieszać i
zmierzyć absorbancję przy 420 nm wszystkich próbek względem wody.
Opracowanie wyników
1. Obliczyć teoretyczne współczynniki kompleksów siarczynowych badanych białek. Za
absorbancję do obliczeń przyjąć wartości zmierzone pomniejszone o średnią z wartości
absorbancji dwóch próbek ślepych.
2. Na podstawie obliczonych współczynników absorbcji molowych lizozymu i
chymotrypsynogenu obliczyć średnie stęŜenia białek w molach na litr [M] oraz w
miligramach na mililitr [mg/ml].
3. Przedyskutować moŜliwe przyczyny ewentualnych odstępstw uzyskanych wartości od
danych wagowych.
Sekwencje białek:
Lizozym (14,3 kDa):
MRSLLILVLCFLPLAALGKVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQA
TNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSDG
NGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRL
Chymotrypsynogen A (25,5 kDa):
CGVPAIQPVLSGLSRIVNGEEAVPGSWPWQVSLQDKTGFHFCGGSLINENWVVTAAHCGV
TTSDVVVAGEFDQGSSSEKIQKLKIAKVFKNSKYNSLTINNDITLLKLSTAASFSQTVSA
VCLPSASDDFAAGTTCVTTGWGLTRYTNANTPDRLQQASLPLLSNTNCKKYWGTKIKDAM
ICAGASGVSSCMGDSGGPLVCKKNGAWTLVGIVSWGSSTCSTSTPGVYARVTALVNWVQQ
TLAAN
11.3. Ilościowe oznaczanie grup tiolowych w białkach za pomocą
odczynnika Ellmana
Odczynnik Ellmana [kwas 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoesowy), w skrócie DTNB] jest
najpowszechniej uŜywanym odczynnikiem do oznaczania wolnych grup tiolowych (-SH).
Reakcja oznaczania jest czuła, szybka i zarazem bardzo prosta. PoniewaŜ istotne jest, by
grupy -SH były w formie zjonizowanej reakcję przeprowadza się w pH lekko zasadowym.
DTNB reaguje z taką zjonizowana grupą tworząc tionitrobenzoesową pochodną białka oraz
barwny anion tionitrobenzoesowy (TNB) o maksimum absorbcji przy 412 nm.
PoniewaŜ
na
kaŜdą
grupę
-SH
przypada
utworzenie
jednej
cząsteczki
kwasu
tionitrobenzoesowego to znając absorbcję molową tego związku przy 412 nm ( 13 600 M-l
cm-l) jesteśmy w stanie wyznaczyć stęŜenie grup -SH w badanym białku przez prosty pomiar
spektrofotometryczny. Reakcja z DTNB moŜe być przeprowadzana zarówno w warunkach
denaturujących (pozwalając na wyznaczenie całkowitej liczby wolnych grup -SH w białkach)
jak i w środowisku nie denaturującym (moŜemy wówczas oszacować liczbę grup tiolowych
wyeksponowanych na powierzchni białka).
Odczynnik Ellmana moŜna równieŜ wykorzystać do wyznaczenia ilości mostków
disiarczkowych w białkach. Reakcja ma wówczas przebieg dwuetapowy. Najpierw DTNB
całkowicie utleniamy w roztworze siarczynu sodu do tionitrosulfobenzoesanu (TNSB):
Po czym powstały tionitrosulfobenzoesan poddajemy w buforze zawierającym nadmiar jonów
siarczynowych reakcji z białkiem zawierającym oznaczane mostki disiarczkowe:
Dochodzi wówczas do reakcji analogicznej jak przy oznaczaniu grup -SH: na kaŜdą parę
mostków disiarczkowych powstaje jeden anion TNB.
Wykonanie
1. Do trzech probówek odmierzyć kolejno po 30, 40 i 50 µl roztworu owalbuminy (nawaŜka
13 mg/ml). Zawartość probówek dopełnić do 1 ml 0,1 M buforem Tris-HCl o pH 8,0.
2. Przygotować trzy analogiczne jak wyŜej próbki, lecz dopełnić je buforem zawierającym
dodatkowo 1 % siarczanu dodecylu sodu (SDS).
3. Przygotować próby „ślepe” zawierające odpowiednio 1 ml buforu bez SDS lub 1 ml
buforu z SDS.
4. Do kaŜdej probówki dodać po 40 µl 0,1 M roztworu DTNB, natychmiast wymieszać i
inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej.
5. Zmierzyć absorbancję próbek przy 412 nm względem odpowiednich prób ślepych.
Opracowanie wyników
1. Obliczyć ilość grup -SH przypadających na jedną cząsteczkę natywnej i na jedną
cząsteczkę zdenaturowanej owalbuminy.
2. Przedyskutować uzyskane wyniki.
Sekwencja białka:
Owalbumina (42,75 kDa) :
GSIGAASMEFCFDVFKELKVHHANENIFYCPIAIMSALAMVYLGAKDSTRTQINKVVRFD
KLPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLRDILNQITKPNDVYSFSLASRLYAEERYPILPEYLQC
VKELYRGGLEPINFQTAADQARELINSWVESQTNGIIRNVLQPSSVDSQTAMVLVNAIVF
KGLWEKAFKDEDTQAMPFRVTEQESKPVQMMYQIGLFRVASMASEKMKILELPFASGTMS
MLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEERKIKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMAM
GITDVFSSSANLSGISSAESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGSAEAGVDAASVSEEFRA
DHPFLFCIKHIATNAVLFFGRCVSP
Podkreślone cysteiny 73 i 120 są połączone mostkiem disiarczkowym.
11.4. Ilościowe oznaczanie
elektroforetyczną
grup
tiolowych
w
białkach
metodą
Grupy tiolowe w białkach i peptydach moŜna oznaczać równieŜ metodą elektroforetyczną,
która w porównaniu do opisanej wyŜej metody z DTND jest od 10 do 100 razy czulsza i nie
wymaga zastosowania spektrofotometru. Ponadto metoda elektroforetyczna jest niezastąpiona
w przypadku, gdy jest nam potrzebna informacja na temat ilości reszt cysteiny
przypadających na cząsteczkę badanego polipeptydu, a równocześnie nie znamy jego masy
cząsteczkowej lub teŜ posiadamy preparat o niedokładnie oznaczonym stęŜeniu. Wadą
metody elektroforetycznej jest jej praco- i czasochłonność.
Metoda polega na poddaniu cystein badanego białka reakcji z mieszaniną kwasu
jodooctowego z jodoacetamidem. Kwas jodooctowy modyfikuje grupy –SH do kwaśnych
grup karboksymetylowych –SCH2COO-, zaś jodoacetamid przekształca grupy –SH w
obojętne
grupy
karboksyamidometylowe
–SCH2CONH2.
Jeśli
badany
łańcuch
polipeptydowy poddamy działaniu nadmiaru mieszaniny kwasu jodooctowego oraz
jodoacetamidu, uŜywając róŜnych proporcji tych odczynników względem siebie, to
odczynniki te będą konkurowały między sobą w reagowaniu z dostępnymi wolnymi resztami
–SH. Otrzymamy w rezultacie mieszaninę zmodyfikowanych cząsteczek białka posiadających
0, 1, 2, ... i n kwaśnych grup karboksymetylowych oraz n, n-1, n-2,.... i 0 obojętnych grup
karboksyamidometylowych (gdzie n to liczba wolnych reszt –SH w białku). Gdy mieszaninę
taką rozdzielimy elektroforetycznie to uzyskamy zespół prąŜków pochodzących od grup
cząsteczek róŜnorodnie zmodyfikowanego białka, róŜniących się między sobą kolejno
ładunkiem jednego ugrupowania kwaśnego. Liczba prąŜków bezpośrednio obrazuje liczbę
wolnych grup tiolowych w badanym łańcuchu polipeptydowym.
Metodę w powyŜszym kształcie, przeprowadzaną w natywnych buforach, stosuje się do
bezpośredniego określenia liczby dostępnych grup –SH w białku. Poprzez odpowiednie
modyfikacje moŜna ją jednak rozszerzyć o oznaczanie liczby grup niedostępnych na
powierzchni cząsteczki oraz do określenia liczby grup tiolowych zaangaŜowanych w
tworzenie mostków disiarczkowych. W pierwszym przypadku po prostu oblicza się róŜnicę w
ilości wyznaczonych grup tiolowych dla białka poddawanego reakcji w obecności
denaturującego 8 M roztworu mocznika i bez niego. Podobnie, w celu określenia ilości
mostków -S-S-
reakcje przeprowadza dwukrotnie: raz po uprzedniej redukcją białka i
ponownie bez tej redukcji, a następnie oblicza się róŜnice miedzy uzyskanymi liczbami reszt
–SH, która określao ilości grup zaangaŜowanych w tworzenie wiązań.
Przedstawiona poniŜej procedura zawiera opis metody pomiaru całkowitej ilości reszt
cysteinowych w cząsteczce białka, czyli obejmuje procedurę jego denaturacji oraz redukcji
ewentualnych mostków disiarczkowych.
Wykonanie:
1. Denaturacja, redukcja i alkilacja białka:
Do probówki zawierającej 200 µg sojowego inhibitora trypsyny (STI) dodać po 10 µl
następujących roztworów: 1 M Tris-HCl o pH 8,0; 0,1M EDTA, 1 M ditiotreitiol (DTT).
Następnie dodać 1 ml 8 M roztworu mocznika, zawartość probówki wymieszać i
inkubować 1 godzinę w temp. 37ºC. Przygotować świeŜe roztwory alkilujące: A: 0,25 M
jodoacetamid w 0,25 M Tris-HCl o pH 8,0; B: 0,25 kwas jodooctowy w 0,25 M Tris-HCl o
pH 8.0, C: 10 µl A + 10µl B; D: 10 µl A + 30 µl B i E: 10µl A + 90 µl B. Do pięciu
kolejnych probówek odpipetować po 10 µl roztworów A do E, dodać po 40 µl roztworu
zdenaturowanego i zredukowanego białka, wymieszać i inkubować 15 minut w temp.
pokojowej.
2. Analiza elektroforetyczna:
Do pięciu probówek ze zmodyfikowanym białkiem dodać po 12,5 µl buforu próbkowego
(50 % glicerol w wodzie ze szczyptą błękitu bromofenolowego) i zawartość probówek
wymieszać. Przygotować szóstą próbkę zawierającą wszystkie formy zmodyfikowanego
białka poprzez zmieszanie ze sobą porcji 8 µl z probówek 1-5. Na kolejne sześć ścieŜek
Ŝelu elektroforetycznego nakładać po 40 µl przygotowanych w ten sposób próbek. śel
zagęszczający spolimeryzować z buforu zawierającego 0,063 M Tris-HCl o pH 6,8; 2,4 %
akrylamidu i 0,075 % bisakrylamidu, zaś Ŝel rozdzielający spolimeryzować z buforu 0,037
M Tris-HCl o pH 8,8; 7,5 % akrylamidu i 0,23 % bisakrylamidu. Do obu Ŝeli dodać przed
polimeryzacją mocznik do końcowego stęŜenia 6 M. Elektroforezę prowadzić w buforze
elektrodowym 0,025 M Tris; 0,192 M glicyna o pH 8,3 w kierunku elektrody dodatniej,
przy napięciu 50 V w Ŝelu zagęszczającym i 100 V w Ŝelu rozdzielającym. Po
elektroforezie Ŝel barwić 20 minut w 0,025% roztworze Coomassie Brillant Blue G-250 w
3,5% HClO4. Odbarwiać w 7% kwasie octowym. Ze względu na nietrwałość uzyskanego
wybarwienia Ŝelu, jego obraz natychmiast po odbarwieniu przerysować w skali 1:1 na
kartce papieru.
Opracowanie wyników:
STI jest białkiem o masie cząsteczkowej około 18 kDa, zawierającym 4 reszty cysteiny. Są
one
połączone
dwoma
mostkami
disiarczkowymi.
Opisać
uzyskany
obraz
elektroforetyczny tego białka: zaznaczyć prąŜki białka całkowicie karboksymetylowanego
i karboksyamidometylowanego oraz form pośrednich. Na podstawie uzyskanej ilości
prąŜków podać ilość wszystkich reszt cysteinowych w STI. Czy jest ona zgodna z
oczekiwaniami? Jeśli nie to podać moŜliwe przyczyny uzyskania takiego nieprawidłowego
wyniku. W doświadczeniu uŜyto trzech róŜnych proporcji kwasu jodooctowego do
jodoacetamidu. Czy system taki sprawdzi się w przypadku białek zawierających np.
kilkanaście cystein?
11.5. Fragmentacja łańcucha polipeptydowego po resztach tryptofanu za
pomocą odczynnika BNPS-skatole
W ćwiczeniu przedstawiono przykładową procedurę chemicznej fragmentacji łańcucha
polipeptydowego. Podobnych metod opracowano wiele, a ich wspólną cechą jest selektywna
modyfikacja określonych łańcuchów bocznych konkretnych aminokwasów prowadząca do
zerwania przyległego wiązania peptydowego. Metody chemicznego trawienia róŜnią się
oczywiście pomiędzy sobą rodzajem stosowanego do fragmentacji odczynnika, stopniem jego
specyficzności w stosunku do danego ugrupowania bocznego aminokwasu, wydajnością
trawienia oraz ewentualnym powstawaniem kłopotliwych produktów ubocznych. Trzeba
równieŜ zaznaczyć, Ŝe bardzo waŜną cechą przesądzającą o uŜyteczności danej metody
chemicznej fragmentacji białek jest pozostawienie po trawieniu N- i C-końcowych
aminokwasów wynikowych peptydów w niezmodyfikowanej formie, umoŜliwiającej na
przykład ich sekwencjonowanie.
Szczególnie uŜytecznymi w chemii białek są odczynniki trawiące łańcuch polipeptydowy po
rzadko występujących aminokwasach, dające tym samym długie peptydy. UŜyteczność ta
wynika po prostu z braku alternatywnych, wystarczająco specyficznych enzymów
proteolitycznych trawiących na długie fragmenty.
Jednym z najrzadziej występujących
aminokwasów w białkach jest tryptofan a stosunkowo wysoka reaktywność jego pierścienia
indolowego stwarza wiele moŜliwości chemicznych modyfikacji prowadzących do
rozerwania sąsiadującego wiązania peptydowego. Najczęściej stosowana jest oksydatywna
halogenacja pierścienia indolowego za pomocą organicznych odczynników zawierających
brom. Przykładem takiego odczynnika jest BNPS-skatole, czyli 3-bromo-3-metylo-2-(2’nitrofenylosulfofenylo)-indolenina. Odczynnik ten, oraz mechanizm reakcji trawienia został
opisany w rozdziale 8 (rys. 8-3 i 8-6). Przy stosowaniu tej metody fragmentacji białka, naleŜy
pamiętać, Ŝe jeśli trawiona próbka posiada w swym składzie wiązanie peptydowe Asp-Pro to
ze względu na stosowane tutaj długie czasy inkubacji białek w kwaśnym pH moŜe dojść do
jego przerwania, poniewaŜ. wiązanie to jest szczególnie wraŜliwe na kwaśną hydrolizę.
Wykonanie:
1. Trawienie białka i ekstrakcja produktów ubocznych:
Do probówki odmierzyć 250 µl roztworu albuminy wołowej (2 mg/ml) w 80% kwasie
octowym. Dodać 1 mg BNPS-skatole, probówkę zamknąć i inkubować w ciemności w
temperaturze pokojowej. Po 1, 5, 10 i 24 godzinach pobierać porcje po 50 µl które
natychmiast poddać procedurze usunięcia nadmiaru odczynnika trawiącego oraz usunięcia
produktów ubocznych reakcji poprzez ekstrakcję octanem etylu. Ekstrakcję prowadzić w
następujący sposób: do 50 µl pobranej frakcji dodać 50 µl wody, wymieszać i dodać 100
µl octanu etylu. Następnie intensywnie wytrząsać do momentu powstania mlecznoŜółtej
emulsji i zawiesinę wirować 2 minuty przy 13 000 x g. Górną warstwę zawierającą
produkty uboczne oraz nie przereagowany BNPS-skatol usunąć za pomocą pipety,
ponownie dodać 100 µl octanu etylu i operację ekstrakcji powtórzyć. Otrzymane frakcje
wodne zawierające strawione białko poddać liofilizacji.
2. Analiza elektroforetyczna uzyskanych peptydów:
Zawartość kaŜdej probówki zawierającej zliofilizowane strawione białko rozpuścić w 25
µl wody. Z kaŜdej probówki pobrać po 10 µl roztworu, przenieść do nowej probówki i
wymieszać z 30 µl redukującego buforu denaturującego zawierającego SDS. Do piątej
probówki dodać 5 µl wyjściowego nie strawionego roztworu BSA (2 mg/ml) i 15 µl buforu
denaturujacego, a do szóstej 10 µl handlowej gotowej (zwierającej bufor z SDS)
mieszaniny białek-markerów mas cząsteczkowych. Wszystkie probówki gotować 5 minut
na
łaźni
wodnej
i
nałoŜyć
kolejno
do
studzienek
poliakrylamidowego
Ŝelu
elektroforetycznego SDS-PAGE w układzie Laemliego (patrz: „Analiza instrumentalna w
biochemii” A. Kozik, M. Rąpała-Kozik, I. Guevara-Lora, Seria Wydawnicza IBM UJ,
2001, str. 259-261). Elektroforezę prowadzić przy napięciu 100 V do momentu osiągnięcia
przez barwnik indykatorowy górnej granicy Ŝelu rozdzielającego i później 200 V do
momentu osiągnięcia przez barwnik końca płytki (30-40 minut). Po elektroforezie Ŝel
barwić 20 minut w 0,025% roztworze Coomassie Brillant Blue G-250 w 3.5% HClO4.
Odbarwiać w 7% kwasie octowym. Ze względu na nietrwałość uzyskanego wybarwienia
Ŝelu jego obraz natychmiast po odbarwieniu przerysować w skali 1:1 na kartce papieru.
Opracowanie wyników:
BSA jest białkiem o masie 66 433 Da liczącym 582 aminokwasy. Zawiera dwie reszty
tryptofanylowe w pozycjach 133 i 212. Fragmentacja całego łańcucha po resztach
tryptofanu doprowadzi wiec do powstania trzech fragmentów: N-końcowego o masie 15
410 Da, środkowego o masie 9 255 Da i C-końcowego o masie 41 804 Da. W swej
sekwencji BSA zawiera równieŜ dwa wiązania peptydowe Asp-Pro: jedno pod koniec
wyŜej wymienionego peptydu N-końcowego i drugie pośrodku peptydu C-końcowego. Na
podstawie uzyskanego obrazu elektroforetycznego oraz mas cząsteczkowych białek
standardowych oszacować w przybliŜeniu masy cząsteczkowe wszystkich prąŜków
obecnych w ścieŜkach zawierających strawione białko i dokonać próby ich identyfikacji.
Czy wszystkie wiązania peptydowe po resztach tryptofanu zostały strawione? Czy moŜna
powiedzieć, Ŝe trawienie było specyficzne? Czy moŜna określić w jakich miejscach
cząsteczki białka dochodziło do preferencyjnego trawienia? Jakie moŜna zaproponować
sposoby zwiększenia wydajności tej reakcji fragmentacji?