Metody molekularne i immunologiczne stosowane w diagno− styce
advertisement
Wiadomoœci Parazytologiczne 2008, 54(3), 187–197 Copyright© 2008 Polskie Towarzystwo Parazytologiczne Metody molekularne i immunologiczne stosowane w diagno− styce grzybic Molecular and immunological methods applied in diagnosis of mycoses Katarzyna Kuba Zakład Biologii i Parazytologii Lekarskiej, Katedra Biologii i Genetyki Medycznej, Uniwersytet Medyczny, Pl. Gen. J. Hallera 1, 90−647 Łódź; E−mail: [email protected] ABSTRACT. The diagnosis of fungal infections remains a problem for the management of fungal diseases, particular− ly in the immunocompromised patients. Systemic Candida infections and invasive aspergillosis can be a serious pro− blem for individuals who need intensive care. Traditional methods used for the identification and typing of medically important fungi, such as morphological and biochemical analysis, are time−consuming. For the diagnosis of mycoses caused by pathogenic fungi faster and more specific methods, especially after the dramatic increase in nosocomial in− vasive mycoses are needed. New diagnostic tools to detect circulating fungal antigens in biological fluids and PCR−ba− sed methods to detect species or genus−specific DNA or RNA have been developed. Antigen detection is limited to se− arching only one genus. Molecular genetic methods, especially PCR analysis, are becoming increasingly important as a part of diagnostics in the clinical mycology laboratory. Various modifications of the PCR method are used to detect DNA in clinical material, particularly multiple, nested and real−time PCR. Molecular methods may be used to detection of nucleic acids of fungi in clinical samples, to identify fungal cultures at the species level or to evaluate strain hetero− geneity differences within the species. This article reviews some of the recent advances in the possibility of molecular diagnosis of fungal infections. Key words: PCR, fungal infections, identification, Aspergillus, Candida W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat znacznie wzrosła liczba infekcji wywołanych przez grzyby chorobotwórcze. Grzybice powierzchniowe i ukła− dowe stały się zjawiskiem powszechnym. Według danych statystycznych prewalencja zarażeń grzyba− mi u pacjentów po transplantacji szpiku kostnego zwiększyła się z 15% do 25% przypadków, a u pa− cjentów po transplantacji narządów wewnętrznych z 5% aż do 42% [1, 2]. Spośród szeregu czynników sprzyjających roz− wojowi grzybic istotne znaczenie mają niedobory immunologiczne, wynikające zarówno z uwarunko− wań genetycznych, jaki i wywołane przez różne czynniki etiologiczne. Szczególnie narażoną grupę na tego typu infekcje, stanowią pacjenci z choroba− mi autoimmunologicznymi, AIDS, białaczką limfo− blastyczną lub szpikową [3–6]. Ponadto czynnikami sprzyjającymi powstawaniu grzybic są również: po− wszechne stosowanie antybiotyków o szerokim za− kresie działania i leków steroidowych, obecność cewników w żyle centralnej, żywienie pozajelitowe, ostra niewydolność nerek, cukrzyca i długotrwała hospitalizacja [7]. Grzybice uogólnione i układowe to zakażenia o szczególnie ciężkim przebiegu. Czynnikami etio− logicznymi tych infekcji są najczęściej grzyby z ro− dzajów Candida i Aspergillus, a także Cryptococ− cus, Mucor, Rhizopus i Fusarium [7–13]; grzyby te odgrywają również dużą rolę w zakażeniach we− wnątrzszpitalnych i wywołują grzybice o szczegól− nie ciężkim przebiegu, zagrażające nie tylko zdro− wiu, ale i życiu chorego. Dotyczą pacjentów ze 188 znacznie obniżoną odpornością, znajdujących się w stanie neutropenii, po zabiegach operacyjnych, przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macie− rzystych, transplantacji narządów wewnętrznych, czy chemioterapii. Oportunistyczne zarażenia grzy− bami cechuje wysoka śmiertelność, obejmująca na− wet do 95–100% przypadków. Na podstawie danych statystycznych wykazano, że śmiertelność u pacjen− tów po transplantacji szpiku kostnego zakażonych grzybami z rodzaju Candida wynosi około 50%, a u pacjentów zakażonych Aspergillus – aż 90%. W przypadku grzybic inwazyjnych szybka diagnoza i rozpoczęcie leczenia przeciwgrzybiczego są czyn− nikami decydującymi o powodzeniu terapii. Ciągłemu wzrostowi częstości zachorowań na grzybice układowe powinien towarzyszyć dyna− miczny rozwój metod diagnostycznych, pozwalają− cych na wczesne wykrycie i jednoznaczną identyfi− kację patogenu. Tradycyjne metody diagnostyczne, oparte głównie na analizie cech fenotypowych grzy− bów chorobotwórczych, nie zawsze spełniają sta− wiane przed nimi zadania i wymagają czasu. Skrócenie czasu oczekiwania na wyniki badania po− zwoliłoby na wcześniejsze rozpoczęcie skutecznej i odpowiedniej terapii. Dlatego też, alternatywą dla tradycyjnych metod laboratoryjnej diagnostyki grzybic, powinny być metody molekularne, analizu− jące genotyp patogenów, co pozwala na dokładną identyfikację gatunków o dużej zmienności fenoty− powej oraz umożliwia prowadzenie badań filogene− tycznych i epidemiologicznych. Techniki serologiczne, pozwalające na wykrycie antygenów i specyficznych przeciwciał w płynach ustrojowych, odgrywają niezwykle istotną rolę w badaniach laboratoryjnych i często wspomagają nowoczesne metody molekularne. Metody immunologiczne W diagnozowaniu grzybic pomocne są testy se− rologiczne, szczególnie wykrywające antygeny grzybów, np. we krwi, w surowicy, w popłuczynach pęcherzykowo−oskrzelikowych – BAL (ang. bron− choalveolar lavage) lub w płynie mózgowo−rdzenio− wym, w ostrym okresie zakażenia. Idealny marker antygenowy, stosowany w tego typu badaniach, po− winien być trwały, swoisty tylko dla grzybów i po− zwalać na odróżnienie zakażenia od kolonizacji, która często ma miejsce w przypadku grzybów z ro− dzaju Candida [7]. Galaktomannan – polisacharydowy antygen, składnik ściany komórkowej grzybów z rodzaju K. Kuba Aspergillus służy jako marker stosowny do diagno− zowania grzybic układowych wywołanych przez ten patogen. Wykryto go po raz pierwszy w roku 1979 w surowicy i moczu pacjentów z inwazyjną aspergi− lozą. Jest on uwalniany podczas wzrostu grzyba [14]. Poziom galaktomannanu można określić już przy bardzo niskim stężeniu w surowicy, moczu, popłuczynach oskrzelowo−pęcherzykowych pacjen− tów z zakażeniami narządowymi i/lub fungemią. Galaktomannan jest wykrywany w znacznie niż− szym stężeniu w moczu (0,5 ng/ml) niż w surowicy (1,0 ng/ml). Powstało wiele testów komercyjnych do wykrywania tego antygenu, np. test aglutynacji lateksowej, radioimmunologiczny (RIA) i immuno− enzymatyczny ELISA, których czułość waha się między 65–100%, a specyficzność wynosi od 81% do 100% [15–17]. Rogers i wsp. [18] wykorzystali dwa różne testy ELISA do badań pacjentów z neutropenią, która by− ła następstwem leczenia białaczki lub przeszczepu szpiku. U 18−stu z 19−stu pacjentów z płucną, inwa− zyjną aspergilozą, wykryto obecność galaktomanna− nu w surowicy i moczu. Pozytywne wyniki potwier− dzające obecność tego antygenu otrzymano u 11−stu z 13−stu pacjentów, zanim na podstawie testów kli− nicznych potwierdzono u nich infekcje grzybicze. Na podstawie uzyskanych rezultatów czułość po− wyższych testów immunoenzymatycznch oszaco− wano na 95%, a ich specyficzność na 99–100%. Mannan jest powierzchniowym polimerem man− nozy, obecnym w ścianie grzybów z rodzaju Candi− da sp. uwalnianym podczas wzrostu grzyba. Może on być wykrywany w płynach ustrojowych pacjen− tów, w ilościach kilku ng/ml. Jest to antygen wyso− ce immunogenny dla człowieka [19–21]. Do jego wykrywania służą miedzy innymi testy: radioimmu− nologiczny, aglutynacji lateksowej, immunoenzy− matyczny i immunoelektroforetyczny [22–24]. Inne antygeny grzybicze wykrywane w przypadku inwa− zyjnej kandydozy to: 1,3−β−D−glukan, chityna oraz enolaza [7]. Enolaza jest wysoce immunogennym białkiem grzybów, o masie 48−kDa wykrywanym zarówno w cytoplazmie, jak i ścianie komórkowej C. albi− cans [25, 26]. Walsh i wsp. [27] wykorzystali z po− wodzeniem test immunoenzymatyczny, stwierdza− jący obecność tego antygenu w surowicy pacjentów, u których wcześniej potwierdzono inwazyjną kan− dydozę. Czułość tej metody wynosiła 54%. Do poszukiwania krążących antygenów grzy− bów z rodzaju Candida, Aspergillus i Cryptococcus obecnie używane są komercyjnie dostępne testy: Diagnostyka molekularna w mikologii Pastorex® Candida, Pastorex® Aspergillus i Pasto− rex® Krypto−Plus. Wszystkie one oparte są na teście aglutynacji lateksowej i wykrywają antygeny po− wierzchniowe grzybów chorobotwórczych w zakre− sie od 2,5 ng/ml do 50 ng/ml. Testy immunoenzy− matyczne o większej czułości (Platelia® Candida i Platelia® Aspergillus) pozwalają na oznaczenie odpowiednio mannanu w ilości 0,5 ng/ml i galakto− mannanu w ilości 1 ng/ml. W diagnostyce inwazyjnej kandydozy wykorzy− stywane są różne przeciwciała monoklonalne, takie jak np.: AF1, które rozpoznają oligosacharyd wspólny dla wielu mannoprotein różnych grzybów z rodzaju Candida, z wyjątkiem C. krusei [28], a także 3H8, które rozpoznają tylko mannoproteinę dla C. albicans [29] i EBCA1 wykrywające mannan i mannoproteiny różnych gatunków Candida – wy− korzystywane w testach Pastorex® Candida i Plate− lia® Candida (Bio−Rad, France) [30]. Pastorex® Aspergillus – test aglutynacji latekso− wej pozwala na wykrywanie galaktomannanu, wy− korzystując do tego celu przeciwciała monoklonal− ne EB−A2. Jednakże przy oznaczeniu antygenu w surowicy pobranej od 79 pacjentów z neutrope− nią, z nowotworami układu krwiotwórczego, w 18. przypadkach inwazyjnej aspergilozy zdiagnozowa− nej metodami tradycyjnymi, test Pastorex miał czu− łość tylko około 39% i specyficzność 95% [31]. W innych badaniach porównano dwa testy Pasto− rex® Aspergillus i test ELISA Platelia® Aspergillus badając próbki surowicy uzyskane od 22 pacjentów po transplantacji szpiku kostnego. Otrzymane wyni− ki potwierdziły, że czułość i specyficzność testów wynosiła odpowiednio 40 i 94% dla Pastorex® Aspergillus oraz 60 i 82% dla Platelia® Aspergillus [32]. Przeciwciała przeciwko antygenom grzybów chorobotwórczych wykrywane są u pacjentów, u których choroba ma przebieg przewlekły. W celu wykrycia przeciwciał przeciw antygenom grzybów z rodzaju Candida i Aspergillus stosowane są mię− dzy innymi testy: aglutynacji lateksowej, wiązania dopełniacza, immunoenzymatyczne. Warto pamiętać, że metody serologiczne dają często wyniki fałszywie ujemne, spowodowane nie− doskonałością stosowanych testów, a także diagno− zowaniem osób z obniżoną odpornością, które nie wytwarzają wykrywalnej ilości przeciwciał; wów− czas wynik negatywny nie zawsze wyklucza rozpo− znanie zakażenia grzybiczego. Częsty kontakt z grzybami chorobotwórczymi powoduje, że wielu pacjentów ma wcześniej wytworzone przeciwciała 189 przeciw antygenom niektórych grzybów. Pokrewień− stwo antygenowe nie tylko między grzybami, ale także między bakteriami i grzybami powoduje, że uzyskane wyniki mogą być fałszywie dodatnie. Nie− stabilność antygenów obecnych w płynach ustrojo− wych stwarza konieczność kilkukrotnego powtórze− nia badania (pojedynczy test jest niewystarczający i nie daje pełnego obrazu przebiegu choroby). War− tość diagnostyczna metod opartych na wykrywaniu antygenów lub przeciwciał w badaniach mikologicz− nych jest stale kwestionowana. Techniki serologicz− ne ze względu na częste wyniki fałszywie dodatnie lub fałszywie ujemne są tylko pomocne w diagnosty− ce inwazyjnych zakażeń grzybiczych i powinny być wykonywane równolegle z innymi badaniami. Obecnie metody wdrażane do codziennej dia− gnostyki inwazyjnych zakażeń grzybiczych oparte są na wykrywaniu i analizie DNA i RNA grzybów w materiale klinicznym lub służą do identyfikacji wyhodowanych z materiałów grzybów. Markery molekularne wykorzystywane w diagnostyce mikologicznej Techniki takie, jak np. hybrydyzacja kwasów nu− kleinowych z zastosowaniem znakowanych sond genetycznych i metody amplifikacji materiału gene− tycznego są fundamentalne dla diagnostyki moleku− larnej. Bazą dla metod diagnostycznych jest reakcja łańcuchowa polimerazy PCR, opisana po raz pierw− szy w 1983 roku. Metody te charakteryzują się względną prostotą wykonania, wysoką czułością i specyficznością, w przeciwieństwie do metod se− rologicznych, umożliwiają wykrycie i również iden− tyfikację czynnika etiologicznego choroby, nieza− leżnie od stanu odporności chorego. Technika PCR, prowadzona w warunkach in vitro, wzorowana jest na procesie replikacji odbywającej się w żywych komórkach. W metodzie tej próbki mogą być testo− wane bezpośrednio i w porównaniu do tradycyjnych metod identyfikacji, grzyby nie wymagają wcze− śniejszej izolacji i hodowli. W zależności od wybra− nej pary starterów można amplifikować dowolny fragment DNA mikroorganizmu. Wydajność samej reakcji uzależniona jest od różnych warunków, w ja− kich przebiega cały proces, takich jak składniki mie− szaniny reakcyjnej, temperatura i czas. Różnorodne metody genotypowania wykorzystywane do scha− rakteryzowania różnych gatunków grzybów opiera− ją się na technice amplifikacji materiałów genetycz− nych grzybów. Klasyczna metoda PCR doczekała się wielu modyfikacji [7, 33, 34]. 190 W badaniach molekularnych niewiele technik po− zwala na analizowanie całego materiału genetyczne− go wyizolowanego z komórek patogenu. Analiza ca− łego genomu wykorzystywana jest w badaniach nad zmiennością genetyczną grzybów chorobotwór− czych, techniką RFLP (ang. Restriction Fragment Length Polymorphism) lub RAPD – (ang. Random Amplification Polymorphism DNA). Natomiast czę− ściej analizuje się zmienność poszczególnych se− kwencji nukleotydowych wybranych regionów mar− kerowych genomu. W genomie grzybów znajdują się regiony konserwatywne oraz zmienne odznacza− jące się wysokim zróżnicowaniem pomiędzy po− szczególnymi gatunkami, a nawet szczepami. W ba− daniach mających na celu ustalenie taksonomicz− nych i filogenetycznych powiązań grzybów, ocenia− ne są sekwencje dla rybosomalnego DNA (rDNA), które występują we wszystkich organizmach w dużej ilości kopii, co ułatwia ich wykrywanie techniką PCR i zwiększa czułość samej reakcji. Do najczęściej stosowanych markerów moleku− larnych należą operony rDNA, a także niektóre re− giony mitochondrialnego DNA (mtDNA). W rDNA występują zarówno regiony wysoce konserwatywne i sekwencje o wysokiej zmienności genetycznej jak np. rozdzielające regiony niekodujące ITS (ang. In− ternal Transcribed Spacer Regions). Zarówno jedne, jak i drugie, wykorzystywane są w diagnostyce i ty− powaniu grzybów chorobotwórczych i są obecnie molekularnym standardem do typowania genetycz− nego grzybów [35]. Fragmenty genomu mitochon− drialnego – 16S rDNA – wykorzystywane są rów− nież jako markery genetyczne do identyfikowania poszczególnych gatunków. Mitochondrialne DNA jest niewielkie, łatwe do izolacji, wysoce konserwa− tywne i nie podlega rekombinacji genetycznej. Dziedziczy się w prosty sposób co sprawia, że jest doskonałym markerem do określenia wzajemnego pokrewieństwa między grzybami chorobotwórczy− mi [36]. Dodatkowo w diagnostyce układowej kan− dydozy lub aspergilozy jako matryca często stoso− wana jest sekwencja kodująca białka szoku termicz− nego HSP 90. Inne fragmenty genomu stosowane jako markery to sekwencje kodujące dla aktyny, de− metylazy lanosterolu C19, podjednostki dehydroge− nazy NADH i oksydazy cytochromowej – oraz ge− ny dla: syntazy chitynowej, zasadowej proteazy, enolazy[7, 37]. Mulitiplex PCR Kolejną odmianą techniki PCR wykorzystywa− K. Kuba ną w diagnostyce grzybic układowych jest niezwy− kle obiecujący multiplex PCR. Bardzo korzystną właściwością tej reakcji jest możliwość zastosowa− nia nie jednej, a kilku par starterów jednocześnie, co pozwala na amplifikację różnych odcinków DNA. Amplifikacja równoczesna PCR skraca czas wyma− gany do przebadania większych obszarów genomu. Umożliwia jednoczesne zastosowanie kilku par starterów dla różnych gatunków grzybów chorobo− twórczych w jednej próbce, co pozwala na lepszą i szybszą identyfikację. Warunkiem tej metody jest zastosowanie starterów o wysokiej specyficzności gatunkowej. Startery takie można opracować w oparciu o niekodujące regiony genomu o wyso− kim polimorfizmie i z wysoką swoistością identyfi− kować grzyby chorobotwórcze. Opracowano starte− ry uniwersalne dla DNA wszystkich grzybów. Dzię− ki temu możliwe jest odróżnienie zakażeń grzybi− czych od zakażeń wywołanych przez wirusy i bak− terie. Z powodzeniem wykonano multiplex PCR z wykorzystaniem w jednej próbie jednocześnie trzech par specyficznych gatunkowo starterów dla C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicallis oraz C. albicans, Aspergillus fumigatus i Cryptococcus neoformans. Dzięki multiplex PCR, można zidenty− fikować w dwóch reakcjach amplifikacji sześć róż− nych gatunków grzybów patogennych (klasyczna reakcja PCR pozwala na wykrywanie najczęściej tylko jednego gatunku). Często jednak wynik wy− maga potwierdzenia hybrydyzacją z sondą gene− tyczną, co dodatkowo wydłuża czas oczekiwania na wynik i zwiększa koszty badania [38]. Metoda ta wykorzystywana jest do identyfikacji zakażeń grzy− biczych. Multiplex PCR pozwala swoiście i znacz− nie szybciej niż klasyczny PCR identyfikować czynnik etiologiczny. Nested PCR W metodzie nested PCR – zagnieżdżony, zloka− lizowany lub zazębiony PCR – analiza PCR prze− prowadzona jest w dwóch następujących po sobie amplifikacjach. W pierwszym etapie reakcji stosuje się parę starterów zewnętrznych, najczęściej o ni− skiej specyficzności gatunkowej, pozwalających na powielenie fragmentu markerowego DNA patoge− nu. Następnie produkt PCR z pierwszego etapu jest poddawany kolejnej rundzie amplifikacji z drugą parą starterów oligonukleotydowych, o dużej specy− ficzności gatunkowej, które przyłączają się do miejsc wewnątrz fragmentu amplifikowanego przez pierwszą parę starterów. Jeśli podczas pierwszej Diagnostyka molekularna w mikologii rundy PCR powstają pewne niespecyficzne produk− ty, zastosowanie „nested” PCR powinno zapewnić amplifikacje z tylko pożądanego produktu. Techni− ka ta znacznie podwyższa czułość i swoistość bada− nia [39]. Dla przykładu w badaniach prowadzonych przez Burgener−Kairuz i wsp., czułość wykrywania infekcji grzybiczych techniką nested PCR była 1000 razy wyższa niż czułość rekcji PCR z zastosowa− niem pojedynczej pary starterów [37]. Dzięki nested PCR możliwa jest amplifikacja wybranego frag− mentu DNA patogenu, co pozwala na różnicowanie gatunków, a nawet szczepów grzybów chorobo− twórczych obecnych w badanym materiale. Techni− kę tę wykorzystano do testu o wysokiej czułości, służącego do wykrywania Cryptoccocus neofor− mans w płynie mózgowo−rdzeniowym [40]. Nested PCR zastosowano też do zbadania 175 próbek suro− wicy pobranych od 37 pacjentów po transplantacji szpiku kostnego, z podejrzeniem inwazyjnej asper− gilozy. Jako marker wybrano region D1−D2 dużej podjednostki rybosomalnej Aspergillus. Pozytywne wyniki testu uzyskano w 18 przypadkach [41]. Bio− rąc pod uwagę zwiększoną czułość, metodę nested PCR stosuje się do wykrywania i identyfikacji pato− genu bezpośrednio w materiale klinicznym. Dzięki zastosowaniu dla pierwszej pary starterów jako markera sekwencji genu dla topoizomerazy II, wspólnej dla grzybów z rodzaju Candida, Aspergil− lus i Penicillium, a następnie specyficznych gatun− kowo starterów dla tejże topoizomerazy, udało się zróżnicować różne gatunki Aspergillus [42]. RT−PCR Reverse Transcription (odwrotna reakcja PCR) Reakcje PCR zaadoptowano również do ampilfi− kacji sekwencji RNA, takich jak mRNA poprzez RT−PCR (reverse transcription). Oryginalnie proce− dura ta opiera się na przepisywaniu wyjściowego RNA na cDNA, prowadzonej przez enzym odwrot− ną transkryptazę i poprzedza amplifikację przez po− limerazę Taq. Obecnie wykonuje się bezpośrednią amplifikację RNA, w obecności jonów magnezu, przez pojedynczy enzym polimerazy (Tht) z Ther− mus thermophilus, mającej jednocześnie aktywność odwrotnej transkryptazy i polimerazy DNA. Pro− duktem reakcji są dwuniciowe odcinki cDNA, kopie RNA. RT−PCR jest wysoce czułą metodą, pozwala− jącą na wykrywanie i przybliżone analizowanie bar− dzo małych ilości specyficznego RNA, takich jak wcześniej niewykrywalne rzadkie transkrypty. Po− 191 nadto, ilościową odmianę RT−PCR stosuje się do mierzenia ekspresji genu. Przy pomocy RT−PCR z zastosowaniem jako markerów sekwencji ALS (ang. agglutinin−like sequence), potwierdzono kan− dydozę jamy ustnej spowodowaną przez Candida albicans u pacjentów HIV−pozytywnych. Zaobser− wowano ekspresję wszystkich genów ALS swoi− stych dla C. albicans w materiale klinicznym pobra− nym z jamy ustnej zbadanych [43]. Metoda analizy polimorfizmu długości frag− mentów restrykcyjnych DNA (RFLP; ang. Restriction Fragment Length Polymorphism) Metody molekularnej diagnostyki i epidemiolo− gii w większości opierają się na analizie polimorfi− zmu wyznaczonych markerów genetycznych. W technice tej uzyskane w czasie reakcji PCR am− plikony są poddawanie działaniu enzymów restryk− cyjnych, które posiadają zdolność rozpoznawania i cięcia DNA w punktach o określonej sekwencji nukleotydowej. W następstwie po rozdziale elektro− foretycznym uzyskujemy tzw. wzór restrykcyjny. Technika RFLP pozwala na analizę sekwencji poli− morficznych i swoiste mapowanie genetyczne, w zależności od konserwatywności lub zmienności wybranego do amplifikacji fragmentu DNA. Jest przydatna w typowaniu wewnątrzgatunkowym grzybów, lub odróżnieniu od siebie gatunków blisko spokrewnionych, u których występują jedynie sub− telne różnice fenotypowe. Przykładem takich gatun− ków są Candida albicans i Candida dubliniensis, które można odróżnić przy pomocy techniki RFLP z wykorzystaniem enzymu restrykcyjnego B1nI. Wcześniej zamplifikowany region ITS Candida du− bliniensis jest poddawany trawieniu enzymem re− strykcyjnym B1nI, natomiast region ITS Candida albicans nie ulega trawieniu przez ten enzym. Me− toda ta pozwala w łatwy sposób odróżnić patogeny nie różniące się znacznie cechami genotypowymi, a jednak należące do różnych gatunków i posiadają− cych różną wrażliwość na leki (np. flukonazol) [44]. Także inne gatunki grzybów z rodzaju Candida mo− gą być rozróżniane techniką RFLP, na podstawie różnic w budowie i wielkości regionów niekodują− cych w obrębie rDNA. Dla C. albicans, C. parapsi− losis, C. krusei, C. tropicalis i C. stellatoidea ampli− kony poddawane były trawieniu endonukleazami Dde I i Bfa I. Na podstawie otrzymanego wzoru RFLP możliwa była klasyfikacja grzybów do pozio− mu gatunku. C. glabrata, C. guilliermondii i C. 192 pseudotropicalis zidentyfikowano na podstawie wielkości amplikonu po reakcji PCR. W przypadku tych grzybów, nie wymagana była dalsza analiza en− zymami restrykcyjnymi [45]. Technika RAPD (ang. Randomly Amplified Polymorphic DNA) lub AD−PCR Losowy – random PCR. Analiza losowej amplifikacji polimorficznych fragmentów DNA (RAPD) W przeciwieństwie do klasycznej metody PCR technika ta umożliwia amplifikowanie fragmentów DNA, które mają niezdefiniowaną długość i se− kwencję; pozwala ona na amplifikację PCR geno− mowego DNA z pojedynczą, krótką, arbitralną se− kwencją nukleotydową, najczęściej o długości 10–20 nukleotydów. Zastosowanie jednego startera, zamiast dwóch, opiera się na założeniu, że w geno− mie występują odwrócone sekwencje powtórzone. Zakłada się występowanie sekwencji typu odwróco− nych powtórzeń w takiej odległości od siebie (300 do 1500 par zasad) w genomie, która pozwoli na wydajną amplifikację. Sekwencja starterowa przy− łączana jest do matrycy w niskiej temperaturze an− nelingu (około 36°C) co umożliwia hybrydyzację starterów do sekwencji o niepełnej homologii i do− prowadza do wytworzenia wielu produktów PCR. Po rozdziale elektroforetycznym uwidaczniane są w postaci wzoru prążków charakterystycznych dla każdego badanego szczepu. Przed wykonaniem sa− mego oznaczenia nie wymagana jest dokładna zna− jomość genomu lub poszukiwanej sekwencji DNA, co jest zaletą tej metody. Znalazła ona zastosowa− nie w określaniu stopnia pokrewieństwa między organizmami [39]. Trzynaście szczepów grzybów z rodzaju Candida, wyizolowanych z cewników, moczu i ran operacyjnych pacjentów, oznaczano przy pomocy RAPD−PCR z wykorzystaniem 15 starterów. Wcześniej szczepy zidentyfikowano me− todami tradycyjnymi; testem na wytwarzanie chla− mydospor i filamentów. Z powodzeniem, przy po− mocy obydwu metod – tradycyjnej i molekularnej, oznaczane grzyby zaliczono do: C. albicans, C. gla− brata i C. parapsilosis. Dodatkowo analiza geno− mowego DNA z wykorzystaniem RAPD−PCR wy− kazała niewielki polimorfizm analizowanych frag− mentów, wystarczający do odróżnienia poszczegól− nych szczepów tego samego gatunku, otrzymanych z różnych materiałów klinicznych [46]. Metoda nazywana jest także arbitralną (samo− wolną) metodą PCR (AP−PCR – ang. Arbitrarily Primed PCR) i amplifikacją DNA odcisku palca K. Kuba (DAF; ang. DNA Amplification Fingerprinting). Wykorzystywana jest ona w badaniach epidemiolo− gicznych stosowanych w przypadkach szpitalnych infekcji grzybiczych, w celu określenia ich transmi− sji. Prowadzone są również badania pozwalające na wskazanie nowo powstających opornych szczepów grzybów podczas terapii przeciwgrzybiczej, a także ocenę ich mikroewolucji wewnątrz poszczególnych gatunków. AFLP (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism) Inną techniką PCR służąca do oznaczania ślado− wych ilości DNA i mapowania genetycznego jest technika AFLP łącząca trawienie enzymami restryk− cyjnymi z reakcją PCR. Procedura ta pozwala na wysoce skuteczną amplifikację fragmentów DNA wybieranych losowo z fragmentów restrykcyjnych. W tej technologii, genomowy DNA jest najpierw trawiony restrykcyjnymi endonukleazami, a następ− nie olinukleotydy adaptorowe są wiązane do koń− ców fragmentów restrykcyjnych. Cząsteczki te słu− żą jako miejsca wiązania staterów podczas amplifi− kacji PCR. Dopiero wówczas przeprowadzana jest amplifikacja PCR z użyciem staterów, które obej− mują sekwencje adaptatora. Ilość amplikonów w profilu AFLP może być zmieniana poprzez wyko− rzystywanie różnych kombinacji endonukleaz. Za− mplifikowane fragmenty są analizowane poprzez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym, tworząc określony wzór. Na podstawie oceny pokrewień− stwa szczepów można wykreślić dendrogram. Tech− nika AFLP pozwala na ocenianie różnorodności ge− netycznej na różnych etapach taksonomii. Badania przeprowadzone tą metodą objęły 77 szczepów pochodzących z rodzajów: Candida, Ge− otrichum, Rhodoturula i Crypotococcus, wyizolo− wanych z jamy ustnej, pochwy, okrężnicy, krwi i płynu mózgowo−rdzeniowego pacjentów, a także z prób środowiskowych, pobranych z wody i gleby. Szczepy identyfikowano biochemicznie (API32), oznaczano techniką AFLP, poprzez trawienie geno− mowego DNA przez dwa enzymy restrykcyjne (Ba− mHI i PstI). Do otrzymanych po trawieniu fragmen− tów restrykcyjnych wiązano fragmenty adaptorowe, służące jako miejsce wiązania dla staterów w czasie dalszych etapów amplifikacji PCR. Jeden z wiąza− nych starterów znakowany był poprzez barwnik flu− orescencyjny. Dalsza analiza przeprowadzana była na żelu poliakrylamidowym z użyciem komputero− wego programu narzędziowego – GelCompar II Diagnostyka molekularna w mikologii (Applied Matys, Sint−Martens−Latem, Belgium). Badanie metodą AFLP wykazało różnice między różnymi grzybami (zarówno gatunkami, jak i rodza− jami). Analiza metodą AFLP wydaje się być do− brym narzędziem do identyfikacji i typowania droż− dży [47]. Technika PCR−EIA (ang. Enzyme Immuno− asay) Jest to metoda trójetapowa, imunoenzymatycz− na, obejmująca również amplifikację PCR, hybry− dyzację z komplementarną wyznakowaną sondą i wykrywanie produktu przy pomocy metod kolory− metrycznych lub fluorescencyjnych. Czułość PCR− EIA w wykrywaniu kandydemii i aspergilozy była wyższa, gdy wykorzystywano do znakowania bro− mek etydyny [48]. Ostatnio do znakowania używa się znakowanych biotyną swoistych gatunkowo sond oligonukleotydowych dla C. albicans [49]. W innych badaniach, wykorzystano PCR−EIA do różnicowania i identyfikacji grzybów z rodzaju Aspergillus. Zastosowano startery dla regionu ITS2 rDNA i sondy znakowane digoksygeniną lub bioty− ną. W badaniach laboratoryjnych udało się z powo− dzeniem zidentyfikować i odróżnić od siebie siedem najczęściej występujących u pacjentów i ważnych z medycznego punktu widzenia gatunków Aspergil− lus (A. flavus, A. fumigatus, A. nidulans, A. niger, A. terreus, A. ustus i A. versicolor). Dodatkowo oznaczono tą metodą DNA grzybów, wyizolowane z tkanek eksperymentalnie zakażonego królika. Me− toda jest szybka i prosta w wykonaniu, co sprawia, że może być stosowana do wykrywania inwazyjnej aspergilozy w materiałach klinicznych [50]. Reakcja łańcuchowa polimerazy DNA z analizą ilości produktu w czasie rzeczywi− stym (ang. Real−time PCR) Przełomowym wydarzeniem w dziedzinie ilo− ściowego PCR było opracowanie w roku 1992 przez Higuchiego i wsp. [51] reakcji PCR z analizą przy− rostu ilości produktu w czasie rzeczywistym; jest ona najbardziej obiecującą z obecnie stosowanych odmian PCR. Służy do pomiaru ilościowego kopii genu w genomie wirusów, bakterii oraz grzybów lub poziomu ekspresji RNA w komórkach i tkankach [51]. Ilość kopii badanej cząsteczki jest monitoro− wana w każdym cyklu reakcji amplifikacji. W reak− cji tej do środowiska wprowadza się startery lub sondy oligonukleotydowe znakowane cząsteczkami 193 zdolnymi do fluorescencji (fluorochromami). W amplikonch fluorochrom uwolniony z sondy, w wyniku jej degradacji enzymatycznej polimerazą endonukleazową, daje emisję światła. Podstawą do obliczenia ilości badanych cząsteczek obecnych na początku reakcji jest liczba cykli reakcji PCR, po których poziom fluorescencji przekroczy określony próg (moment wejścia kinetyki reakcji w fazę loga− rytmicznego przyrostu ilości produktu). Technika ta, bazując na konwencjonalnej metodzie PCR, po− zwala na monitorowanie ilości produktu reakcji w każdym cyklu prowadzonej reakcji PCR, dzięki czemu cała procedura analizy jest bardzo szybka i pozwala wyeliminować etap szacowania produktu po zakończeniu reakcji. Umożliwia ona także wgląd w kinetykę reakcji, a co za tym idzie pozwala na oszacowanie ilości produktu na starcie reakcji, co jest niemożliwe w konwencjonalnej metodzie PCR. Ponadto dzięki temu, że amplifikacja kwasów nu− kleinowych i detekcja produktu odbywa się w jed− nym zamkniętym naczyniu, ryzyko zanieczyszcze− nia badanej próby jest minimalne. Technika Real−ti− me PCR wymaga zastosowania specjalnie przysto− sowanego do tego celu termocyklera, który sprzężo− ny jest z spektrofluorymetrem umożliwiającym po− miar fluorescencji w trakcie trwania reakcji. Do wzbudzania fluorochromów używa się lampy, diody elektroluminescencyjnej lub lasera. Lampy emitują światło o szerokim zakresie długości fal, podczas gdy laser o wąskim spektrum. Detektory mogą po− siadać filtry, dzięki którym wykrywana i mierzona jest tylko jedna długość fali. Teoretyczne zasady techniki PCR zakładają, że ilość produktu po zakoń− czeniu reakcji powinna być wykładniczo proporcjo− nalna do początkowej puli analizowanej sekwencji w badanej próbce przed reakcją (podwajana w każ− dym cyklu reakcji PCR). W praktyce obserwuje się niewielkie różnice w ilościach powstałych produk− tów końcowych ze względu na osiągnięcie plateau w kinetyce reakcji. Spowodowane jest to zużyciem starterów i nukleotydów, spadkiem aktywności poli− merazy oraz konkurencją pomiędzy starterami a produktem o matrycę [39, 52]. Pierwszymi znakowanymi fluorescencyjnie son− dami użytymi w Real−time PCR były sondy Ta− qMan (ang. TaqMan probes, 5'−nuclease probes; Perkin−Elmer Corp., Applied Biosystem, Foster Ci− ty, California). Są to krótkie oligonukleotydy zawie− rające na końcu 5' reporter fluorescencji (np. FAM, NED), a na końcu 3' cząsteczkę wygaszającą fluo− rescencję (np. TAMRA, DABCYL). Wielkość son− dy (odpowiednia odległość między reporterem na 194 jednym jej końcu, a wygaszaczem na drugim) umożliwia przekazywanie energii między fluoro− chromami. Sonda taka po związaniu się z komple− mentarną sekwencją na etapie wydłużania jest de− gradowana przez polimerazę Taq posiadającą ak− tywność 5’−egzonukleazową, przez co fluorochrom ulega oddzieleniu od wygaszacza. Rozdział obu cząsteczek indukuje emisję światła fluorescencyjne− go. Udowodniono, że TaqMan PCR jest techniką detekcji dziesięciokrotnie czulszą niż tradycyjna metoda elektroforezy agarozowej z użyciem brom− ku etydyny. TaqMan PCR pozwala na oznaczenie różnych gatunków grzybów, w tym z rodzaju Can− dida, a także A. fumigatus [53, 54]. Inną techniką służącą do pomiarów ilościowych kopii genu jest LightCycler (Roch Diagnostics, Ger− many). Technologia ta wykorzystywana jest w dia− gnostyce zakażeń wywołanych przez drobnoustroje, w tym również grzyby chorobotwórcze i umożliwia wykrywanie dwóch lub więcej niezależnych pro− duktów w tym samym czasie w jednej próbce. Tech− nika ta wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie pojedyncze lub podwójne sondy do wykrycia ampli− fikowanej sekwencji w genomie patogenu. Znako− wane sondy przyłączane są do komplementarnych sekwencji DNA i dzięki emitowanemu przez czą− steczki fluorochromu światłu można, w danym mo− mencie, kontrolować ilość powstałych kopii poszu− kiwanych sekwencji DNA genomu grzybów. Natę− żenie światła jest proporcjonalne do ilości badanych sekwencji na końcu poprzedniego cyklu reakcji. Przykładem zastosowania tej metody jest jednogo− dzinny test wykrywania Candida albicans i Candi− da dubliniensis w próbkach krwi z wykorzystaniem Smart Cyklera. Technika ta pozwala na odróżnienie występujących u pacjentów z obniżoną odpornością dwóch oportunistycznych patogenów, które trudno jest zróżnicować tradycyjnymi metodami bioche− micznymi, ponieważ posiadają one prawie identycz− ny fenotyp. Przeprowadzono więc Real−time PCR z wykorzystaniem gatunkowo specyficznych sond i Smart Cyklera. Mierzono sygnał fluorescencji emitowany przez sondę w momencie rozpoczęcia każdego z etapu przyłączania. Specyficzność state− rów wykazano testując DNA z 67 szczepów Candi− da należących do 24 gatunków. Amplifikacje obser− wowano tylko dla DNA z C. albicans i C. dublinien− sis. Czułość testu Real−time PCR wynosiła około 10 kopii genomu dla wszystkich szczepów Candida. Obydwa gatunki grzybów z rodzaju Candida można łatwo różnicować już na poziomie detekcji, odpo− wiadającej w przybliżeniu 20 CFU/ml (Colony For− K. Kuba ming Units – Liczba Jednostek Tworzących Kolo− nie) [55]. Ilościowy PCR jest metodą szybką, nie− zwykle czułą i specyficzną oraz w pełni zautomaty− zowaną, charakteryzującą się dużą swoistością; za− pewnia specyficzne gatunkowo wykrywanie grzy− bów, np. C. albicans i A. fumigatus. Reakcja PCR przeprowadzana jest w zamkniętych, szklanych ka− pilarach, co znacznie minimalizuje możliwość prze− niesienia zanieczyszczeń. Czas wystarczający do przeprowadzenia całego procesu to 45 minut. Wszy− stkie te cechy pozwalają na wykorzystanie tej tech− niki w przyszłych badaniach klinicznych [56]. Grzyby z rodzaju Candida i Aspergillus identyfi− kowano za pomocą Real−time LightCycler. Zastoso− wano sekwencje starterowe i sondy komplementar− ne do sekwencji DNA dla genu 18S rRNA różnych patogenów. Przeanalizowano 1650 prób pobranych od pacjentów, głównie krew i materiał uzyskany z biopsji od pacjentów z podejrzeniem grzybicy in− wazyjnej. W 144 (6,9%) przypadkach uzyskano wy− niki pozytywne; w tym 5,3% stanowiły grzyby z ro− dzaju Candida, a 1,7% – Aspergillus (wszystkie próbki kliniczne oznaczano tą techniką do poziomu gatunku). Większość grzybów chorobotwórczych wykrywano z czułością 2 CFU/ml krwi, natomiast specyficzność testów wynosiła 100%. Real−time PCR pozwala na wykrywanie i identyfikację grzy− bów chorobotwórczych w warunkach in vivo i in vi− tro [57]. Podsumowanie Wzrastającą częstość zakażeń układowych grzy− bami chorobotwórczymi u pacjentów ze znacznie obniżoną odpornością skłania badaczy do poszuki− wania nowych technik diagnostycznych opartych o biologię molekularną. Liczne badania naukowe udowodniły przydatność metod, takich jak techniki PCR oraz badań serologicznych w diagnostyce in− wazyjnych zakażeń grzybiczych. Techniki te stwa− rzają możliwość wykorzystania różnego materiału, co zwiększa możliwość prawidłowej diagnozy. Obok surowicy i krwi badany jest mocz, płyn mózgowo−rdzeniowy, plwocina i popłuczyny pę− cherzykowo−oskrzelowe, a także inne materiały bio− logiczne. Dodatkową zaletą tych metod jest niewiel− ka ilość materiału potrzebna do badań. Coraz czę− ściej w laboratoriach mikologicznych do rutynowej diagnostyki grzybic układowych wprowadzane są metody molekularne, które charakteryzują się więk− szą czułością w porównaniu z metodami konwen− cjonalnymi oraz znacznie skracają czas oczekiwania Diagnostyka molekularna w mikologii na rozpoznanie. Należy jednak pamiętać, że metody te posiadają również wady i ograniczenia. Często PCR daje wyniki fałszywie ujemne, mimo przypisy− wanej jej wysokiej czułości. Wykorzystanie tych technik znacznie ogranicza ciągły brak standaryza− cji metod i mała ich dostępność. Nie ma do tej pory ustalonych jasnych i wspólnych kryteriów diagno− stycznych w zakresie wyboru najlepszej metody molekularnej stosowanej powszechnie w laborato− riach diagnostycznych. Brak jest również ujednoli− cenia metody izolacji DNA grzybów wykorzysty− wanej w diagnostycznych badaniach rutynowych. Nie bez znaczenia pozostaje źródło z jakiego pocho− dzi materiał pobrany do badania i jego rodzaj. Przy− kładem mogą być badania Bougnouxa i wsp. [58], przeprowadzone na próbkach krwi i surowicy, po− równujące w nich czułość reakcji PCR. Okazało się, że częściej wykrywano tą metody kandydemię w surowicy, niż w pełnej krwi. Nadal nie wybrano określonych i jednakowych markerów molekularnych do wykrywania czynni− ków etiologicznych grzybic. Standardem obecnie jest analiza regionów ITS, choć wciąż poszukuje się także innych markerów. Brak też ogólnych i ujedno− liconych zasad sposobu interpretacji uzyskanych wyników u chorych z niedoborami immunologicz− nym. Ogromna czułość samej metody jest zarówno jej zaletą, jak i wadą. Technik PCR w badaniach kli− nicznych daje czasem wynik fałszywie dodatnie, ponieważ często dochodzi do kontaminacji próbek. Dotyczy to szczególnie grzybów z rodzaju Aspergil− lus, których źródłem zarażenia jest często czynnik egzogenny, a zarodniki występują powszechnie w powietrzu. Techniki molekularne wymagają wciąż poparcia ich wyników klasycznymi metodami, takim jak ba− dania fenotypu patogenu, jego profilu biochemicz− nego. W wielu doniesieniach autorzy zalecają zasto− sowanie kilku różnych technik diagnostycznych: morfologicznych, serologicznych i molekularnych w celu potwierdzenia uzyskanych tymi metodami wyników [7, 34]. Literatura [1] Paya C.V. 1993. Fungal infection in soil−organ trans− plantation. Clinical Infection Diseases 16: 677–688. [2] Viscoli C., Castagnola E. 1999. Emerging fungal pa− thogens, drug resistance and the role of lipid formula− tions of amphotericin B in the treatment of fungal in− fections in cancer patients: a review. International Jo− urnal of Infectious Diseases 3 (2): 109–118. [3] Barnes R.A., Denning D.W., Evans E.G., Hay R.J., 195 Kibbler C.C., Prentice A.G., Richardson M.D., Ro− berts M.M., Rogers T.R., Speller D.C., Warnock D.W., Warren R.E. 1996. Fungal infections: a survey of laboratory services for diagnosis and treatment. Communicable Disease Report CDR Review 26: 69–75. [4] Coleman D.C., Rinaldi M.G., Haynes K.A., Rex J.H., Summerbell R.C., Anaissie E.J., Li A., Sullivan D.J. 1998. Importance of Candida species other than Can− dida albicans as opportunistic pathogens. Medical Mycology 36: 156–165. [5] Dasbach, E.J., Davies G.M., Teutsch S.M. 2000. Bur− den of aspergillosis – related hospitalizations in the United States. Clinical Infection Diseases 31: 1524–1528. [6] Mitchell T.G., Perfect J.R. 1995. Cryptococcosis in the era of AIDS – 100 years after the discovery of Cryptococcus neoformans. Clinical Microbiology Re− views 8: 515–548. [7] Lee SA, Wong B. 2004. Advances in diagnostic me− thods for invasive Candida and Aspergillus infec− tions. In: The Mycota: a comprehensive treatise on fungi as experimental systems for basic and applied research. (Eds. J. Domer, G. Kobayashi). vol. 12. Springer: 37–64. [8] Holmes A.R., Cannon R.D., Shepherd M.G., Jenkin− son H.F. 1994. Detection of Candida albicans and other yeasts in blood by PCR. Journal of Clinical Mi− crobiology 32: 228–231. [9] Aoki F.H., Imai T., Tanaka R., Mikami Y., Taguchi H., Nishimura N.F., Nishimura K., Miyaji M., Schreiber A.Z., Branchini M.L. 1999. New PCR primer pairs specific for Cryptococcus neoformans serotype A or B prepared on the basis of random amplified poly− morphic DNA fingerprint pattern analyses. Journal of Clinical Microbiology 37: 315–320. [10] Jaeger E.E., Carroll N.M., Choudhury S., Dunlop A.A., Towler H.M., Matheson M.M., Adamson P., Okhravi N., Lightman S. 2000. Rapid detection and identification of Candida, Aspergillus, and Fusarium species in ocular samples using nested PCR. Journal of Clinical Microbiology 38: 2902–2908. [11] Nagao K., Ota T., Tanikawa A., Takae Y., Mori T., Udagawa S., Nishikawa T. 2005. Genetic identifica− tion and detection of human pathogenic Rhizopus spe− cies, a major mucormycosis agent, by multiplex PCR based on internal transcribed spacer region of rRNA gene. Journal of Dermatological Sciences 39: 23–31. [12] Hope W.W., Walsh T.J., Denning D.W. 2005. Labo− ratory diagnosis of invasive aspergillosis. The Lancet Infectious Diseases 5: 609–622. [13] Machouart M., Larché J., Burton K., Collomb J., Maurer P., Cintrat A., Biava M.F., Greciano S., Kuij− pers A.F., Contet−Audonneau N., de Hoog G.S., Gérard A., Fortier B. 2006. Genetic identification of the main opportunistic Mucorales by PCR−restriction fragment length polymorphism. Journal of Clinical 196 Microbiology 44: 805–810. [14] Reiss E., Lehmann P.F. 1979. Galactomannan anti− genemia in invasive aspergillosis. Infection and Im− munity 25: 357–365. [15] Verweij P.E., Latgé J.P., Rijs A.J., Melchers W.J., De Pauw B.E., Hoogkamp−Korstanje J.A., Meis J.F. 1995. Comparison of antigen detection and PCR as− say using bronchoalveolar lavage fluid for diagnosing invasive pulmonary aspergillosis in patients receiving treatment for hematological malignancies. Journal of Clinical Microbiology 33: 3150–3153. [16] Rohrlich P., Sarfati J., Mariani P., Duval M., Carol A., Saint−Martin C., Bingen E., Latge J.P., Vilmer E. 1996. Prospective sandwich enzyme−linked immuno− sorbent assay for serum galactomannan: early predic− tive value and clinical use in invasive aspergillosis. Pediatric Infectious Disease Journal 15: 232–237. [17] Sulahian A., Tabouret M., Ribaud P., Sarfati J., Gluckman E., Latgé J.P., Derouin F. 1996. Compari− son of an enzyme immunoassay and latex agglutina− tion test for detection of galactomannan in the diagno− sis of invasive aspergillosis. European Journal of Cli− nical Microbiology and Infectious Diseases 15: 139–145. [18] Rogers T.R., Haynes K.A., Barnes R.A. 1990. Value of antigen detection in predicting invasive pulmonary aspergillosis. Lancet 336: 1210–1213. [19] Fukazawa Y. 1989. Antigenic structure of Candida albicans. Immunochemical basis of the serologic spe− cificity of the mannans in yeasts. Immunology Series 47: 37–62. [20] Herent P., Stynen D., Hernando F., Fruit J., Poulain D. 1992. Retrospective evaluation of two latex agglu− tination tests for detection of circulating antigens du− ring invasive candidosis. Journal of Clinical Micro− biology 30: 2158–2164. [21] Pfaller M.A., Cabezudo I., Buschelman B., Bale M., Howe T., Vitug M., Linton H.J., Densel M. 1993. Va− lue of the hybritech ICON Candida assay in the dia− gnosis of invasive candidiasis in high−risk patients. Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases 16: 53–60. [22] Meckstroth K.L., Reiss E., Keller J.W., Kaufman L. 1981. Detection of antibodies and antigenemia in leu− kemic patients with candidiasis by enzyme−linked im− munosorbent assay. Journal of Infectious Diseases 144: 24–32. [23] Bennett J.E. 1987. Rapid diagnosis of candidiasis and aspergillosis. Reviews of Infectious Diseases 9: 398–402. [24] De Repentigny L. 1992. Serodiagnosis of candidia− sis, aspergillosis, and cryptococcosis. Clinical Infec− tion Diseases 14, Suppl 1: 11–22. [25] Mason A.B., Brandt M.E., Buckley H.R. 1989. Eno− lase activity associated with a C. albicans cytopla− smic antigen. Yeast 5: 231–239. [26] Angiolella L., Facchin M., Stringaro A., Maras B., K. Kuba Simonetti N., Cassone A. 1996. Identification of a glucan−associated enolase as a main cell wall prote− in of Candida albicans and an indirect target of lipo− peptide antimycotics. Journal of Infectious Diseases. 173: 684–690. [27] Walsh T.J., Hathorn J.W., Sobel J.D., Merz W.G., Sanchez V., Maret S.M., Buckley H.R., Pfaller M.A., Schaufele R., Sliva C. 1991. Detection of circulating Candida enolase by immunoassay in patients with cancer and invasive candidiasis. The New England Journal of Medicine 324: 1026–1031. [28] De Bernardis F., Girmenia C., Boccanera M., Adria− ni D., Martino P., Cassone A. 1993. Use of a monoc− lonal antibody in a dot immunobinding assay for de− tection of a circulating mannoprotein of Candida spp. in neutropenic patients with invasive candidiasis. Jo− urnal of Clinical Microbiology 31: 3142–3146. [29] Marcilla A., Monteagudo C., Mormeneo S., Sentan− dreu R. 1999. Monoclonal antibody 3H8: a useful to− ol in the diagnosis of candidiasis. Microbiology 145: 695–701. [30] Jacquinot P.M., Plancke Y., Sendid B., Strecker G., Poulain D. 1998. Nature of Candida albicans−derived carbohydrate antigen recognized by a monoclonal an− tibody in patient sera and distribution over Candida species. FEMS Microbiology Letters 169: 131–138. [31] Manso E., Montillo M, De Sio G., D'Amico S., Di− scepoli G., Leoni P. 1994. Value of antigen and anti− body detection in the serological diagnosis of invasi− ve aspergillosis in patients with hematological mali− gnancies. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 13: 756–760. [32] Machetti M., Feasi M., Mordini N., Van Lint M.T., Bacigalupo A., Latgé J.P., Sarfati J., Viscoli C. 1998. Comparison of an enzyme immunoassay and a latex agglutination system for the diagnosis of invasive aspergillosis in bone marrow transplant recipients. Bone Marrow Transplantation 21: 917–921. [33] Chen S.C., Halliday C.L., Meyer W. 2002. A review of nucleic acid−based diagnostic tests for systemic mycoses with an emphasis on polymerase chain reac− tion−based assays. Medical Mycology 40: 333–357. [34] Atkins S.D., Clark I.M. 2004. Fungal molecular dia− gnostics: a mini review. Journal of Applied Genetics 45: 3–15. [35] White, T.J., Bruns T., Lee S., and Taylor J.W. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal riboso− mal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Proto− cols: a guide to methods and applications. (Eds. M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, T.J. White). Acade− mic Press Inc., New York: 315–322. [36] Miyakawa Y., Mabuchi T., Kagaya K., Fukazawa Y. 1992. Isolation and characterization of a species−spe− cific DNA fragment for detection of Candida albi− cans by polymerase chain reaction. Journal of Clini− cal Microbiology 30: 894–900. [37] Burgener−Kairuz P., Zuber J.P., Jaunin P., Buchman Diagnostyka molekularna w mikologii T.G., Bille J., Rossier M. 1994. Rapid detection and identification of Candida albicans and Torulopsis (Candida) glabrata in clinical specimens by species− specific nested PCR amplification of a cytochrome − P−450 lanosterol−alpha−demethylase (L1A1) gene fragment. Journal of Clinical Microbiology 32: 1902–1907. [38] Luo G., Mitchell T.G. 2002. Rapid identification of pathogenic fungi directly from cultures by using mul− tiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology 40: 2860–2865. [39] Balajee S.A., Sigler L., Brandt ME. 2007. DNA and the classical way: identification of medically impor− tant molds in the 21st century. Medical Mycology 45: 475–490. [40] Rappelli P., Are R., Casu G., Fiori P.L., Cappucci− nelli P., Aceti A. 1998. Development of a nested PCR for detection of Cryptococcus neoformans in cerebro− spinal fluid. Journal of Clinical Microbiology 36: 3438–3440. [41] Williamson E.C., Leeming J.P., Palmer H.M., Ste− ward C.G., Warnock D., Marks D.I., Millar M.R. 2000. Diagnosis of invasive aspergillosis in bone marrow transplant recipients by polymerase chain reaction. Bri− tish Journal of Haematology 108: 132–139. [42] Kanbe T., Yamaki K., Kikuchi A. 2002. Identifica− tion of the pathogenic Aspergillus species by nested PCR using a mixture of specific primers to DNA to− poisomerase II gene. Microbiology and Immunology 46: 841–848. [43] Green C.B., Marretta S.M., Cheng G, Faddoul F.F., Ehrhart E.J., Hoyer L.L. 2006. RT−PCR analysis of Candida albicans ALS gene expression in a hyposali− vatory rat model of oral candidiasis and in HIV−positi− ve human patients. Medical Mycology 44: 103–111. [44] Mirhendi H., Makimura K., Zomorodian K., Maeda N., Ohshima T., Yamaguchi H. 2005. Differentiation of Candida albicans and Candida dubliniensis using a single−enzyme PCR−RFLP method. Japanese Jour− nal of Infectious Diseases 58: 235–237. [45] Williams D.W., Wilson M.J., Lewis M.A., Potts A.J. 1995. Identification of Candida species by PCR and restriction fragment length polymorphism analysis of intergenic spacer regions of ribosomal DNA. Journal of Clinical Microbiology 33: 2476–2479. [46] Valério H.M, Weikert−Oliveira Rde C., Resende M.A. 2006. Differentiation of Candida species obtai− ned from nosocomial candidemia using RAPD−PCR technique. The Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 39: 174–178. [47] Kantardjiev T, Levterova V., Panaiołov S., Ivanov I. 2004. Use of amplified fragment length polymor− phism analysis as a tool for identification and typing of yeast isolates. Mikologia Lekarska 11: 113–117. [48] Fujita S., Lasker B.A., Lott T.J., Reiss E., Morrison C.J. 1995. Microtitration plate enzyme immunoassay to detect PCR−amplified DNA from Candida species 197 in blood. Journal of Clinical Microbiology 33: 962–967. [49] Wahyuningsih R., Freisleben H.J., Sonntag H.G., Schnitzler P. 2000. Simple and rapid detection of Candida albicans DNA in serum by PCR for diagno− sis of invasive candidiasis. Journal of Clinical Micro− biology 38: 3016–3021. [50] Aguirre L., Hurst S.F., Choi J.S., Shin J.H., Hinri− kson H.P., Morrison C.J. 2004. Rapid differentiation of Aspergillus species from other medically important opportunistic molds and yeasts by PCR−enzyme im− munoassay. Journal of Clinical Microbiology 42: 3495–3504. [51] Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S., Griffith R. 1992 Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (NY) 10: 413–417. [52] Kubista M., Andrade J.M., Bengtsson M., Forootan A., Jonák J., Lind K., Sindelka R., Sjöback R., Sjögreen B., Strömbom L., Stahlberg A., Zoric N. 2006. The real−time polymerase chain reaction. Mole− cular Aspects of Medicine 27: 95–125. [53] Brandt M.E., Padhye A.A., Mayer L.W., Holloway B.P. 1998. Utility of random amplified polymorphic DNA PCR and TaqMan automated detection in mole− cular identification of Aspergillus fumigatus. Journal of Clinical Microbiology 36: 2057–2062. [54] Reiss E., Tanaka K., Bruker G., Chazalet V., Cole− man D., Debeaupuis J.P., Hanazawa R., Latgé J.P., Lortholary J., Makimura K., Morrison C.J., Muraya− ma S.Y., Naoe S., Paris S., Sarfati J., Shibuya K., Sul− livan D., Uchida K., Yamaguchi H. 1998. Utility mo− lecular diagnosis and epidemiology of fungal infec− tions. Medical Mycology 36: 249–257. [55] Trépanier H., Jean V., Boily M.J., Clairoux N., Bo− issinot M., Picard F.J., Roy P.H., Ouellette M., Ber− gerom M.G. 2001. One−hour detection of Candida al− bicans and Candida dubliniensis in blood samples using the smart cycler. (Poster; 101st General Mee− ting, ASM, May 2001, Orlando, FL). [56] Loeffler J., Henke N., Hebart H., Schmidt D., Hag− meyer L., Schumacher U., Einsele H., 2000. Quanti− fication of fungal DNA by using fluorescence reso− nance energy transfer and the light cycler system. Jo− urnal of Clinical Microbiology 38: 586–590. [57] Klingspor L., Jalal S. 2006. Molecular detection and identification of Candida and Aspergillus spp. from clinical samples using real−time PCR. Clinical Micro− biolgy and Infection 12: 745–753. [58] Bougnoux M., Dupont C., Mateo J., Saulnier P., Fa− ivre V., Payen D., Nicolas−Chanoine M. 1999. Serum is more suitable than whole blood for diagnosis of sy− stemic candidiasis by nested PCR. Journal of Clinical Microbiology 37: 925–930. Wpłynęło 12 marca 2008 Zaakceptowano 29 maja 2008
