Wprowadzanie genu kodującego białko GFP i regulacja jego

Wprowadzanie genu kodującego białko GFP i regulacja jego ekspresji w komórkach
eukariotycznych za pomocą techniki interferencji RNA
WPROWADZENIE
Zjawisko interferencji RNA opisano na przełomie XX i XXI wieku. W 2006 odkrycie zostało
wyróżnione nagrodą Nobla. Jest to powszechny w świecie roślin i zwierząt mechanizm regulujący
aktywność genów na poziomie potranskrypcyjnym. W uproszczeniu polega on na degradowaniu
cząsteczki mRNA lub utrudnianiu dostępu do niej aparatowi translacyjnemu. Konsekwencją tego
jest zahamowanie lub zmniejszenie ilości konkretnego białka. Obecnie jest to szeroko
wykorzystywana technika manipulacji ekspresją genów (obecnie w badaniach podstawowych ale
w przyszłości być może w terapii genowej).
Cząsteczką inicjującą to zjawisko jest krótkie dwuniciowe RNA (siRNA – ang. short interfering
RNA) o tak dobranej sekwencji nukleotydowej, że pozwala na specyficzną interakcję z wybraną
cząsteczką mRNA danego genu. siRNA można wprowadzać do komórek/organizmów w formie
gotowej lub w postaci konstruktu DNA kodującego taką cząsteczkę.
W trakcie tych ćwiczeń będziemy sprawdzać skuteczność tego mechanizmu w wyciszaniu
ekspresji genu kodującego białko zielonej fluorescencji (GFP – ang. green fluorescence protein),
które jest stosowane w biotechnologii do śledzenia aktywności innych genów lub całych komórek
(tzw. gen reporterowi).
W tym celu do komórek mysich fibroblastów zostaną wprowadzone dwa konstrukty DNA:
kodujący białko GFP (pGFP) oraz kodujący cząsteczkę siRNA skierowaną na wyciszenie GFP
(pGFP-siRNA). Każda sekcja przeprowadzi 2 transfekcje: plazmidem pGFP oraz plazmidami
pGFP i pGFP-siRNA. Porównując ilości komórek wykazujących fluorescencję GFP w obydwu
rodzajach transfekcji ocenimy w jakim stopniu zjawisko interferencji hamuje ekspresję GFP.
Zadanie 1 – transfekcja mysich fibroblastów konstruktami DNA (pGFP lub pGFP + pGFPsiRNA)
1. Dwie płytki 10-cm z komórkami w fazie 80% konfluencji poddajemy trypsynizacji:
a. aspirujemy pożywkę
b. komórki zalewamy 3ml PBS, mieszamy
c. aspirujemy PBS
d. dodajemy 1ml Trypsyny/EDTA
e. inkubujemy w 37° C przez około 5min. kontrolując efekt odklejenia
f. przerywamy działanie trypsyny dodając 3 objętości pożywki
g. mieszamy intensywnie przez pipetowanie
h. jednorodną zawiesinę komórek przenosimy do Falcona 15ml
i. przygotowujemy komorę do liczenia komórek
j. mieszamy komórki przez kilkakrotne odwrócenie Falcona, pobieramy 10μl
zawiesiny komórek i nanosimy do komory
k. liczymy komórki i szacujemy całkowitą liczbę
l. wirujemy 1200rpm przez 5min. w temp. pokojowej
2. Transfekcja komórek przez elektroporację
a. po odwirowaniu komórek aspirujemy pożywkę
b. do osadu komórek dodajemy taką iloś medium OPTIMEM do elektroporacji, żeby
uzyskać zagęszczenie 2mln komórek na 400μl medium (jeśli ilość komórek będzie
niewystarczająca – zawiesić całość w 400μl i użyć całą objętość wyrównując ilość
komórek w sekcji A i B)
c. komórki mieszamy przez pipetowanie aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny
(UWAGA: unikamy tworzenia piany !)
1
d. sekcja A: do 400 μl zawiesiny komórek dodajemy konstrukt DNA pGFP (kontrola)
w ilości 20μg sekcja B: do 400 μl zawiesiny komórek dodajemy konstrukty DNA
pGFP i pGFP-siRNA (badana) w ilości 20μg każdy
e. przenosimy zawiesinę komórek do kuwety elektroporacyjnej (ok. 400μl)
f. kuwetę elektroporacyjną wstawiamy do komory elektroporacyjnej, zamykamy i
podajemy impuls
g. pozostawiamy komórki w kuwecie na 5 min. (w międzyczasie notujemy uzyskane
napięcie oraz czas trwania impulsu)
h. w międzyczasie nalewamy pożywki do 2 studzienek płytki 12-dołkowej po 1ml na
dołek
i. do kuwety elektroporacyjnej dolewamy 600μl pożywki, mieszamy pipetując
j. nastawiamy parametry elektroporacji: napięcie: 400 V pojemnośd kondensatora:
1200 μF rezystancja: 24 Ohm
k. do każdego dołka wysiewamy po 200.000 komórek
l. inkubacja w 37° C, 5% CO2 przez 24-48 godz.
m. po inkubacji obserwacja fluorescencji GFP w mikroskopie fluorescencyjnym
Zadanie 2 – Obliczanie wydajności hamowania ekspresji pGFP techniką interferencji
RNA
1. W oparciu o zdjęcia pokazujące fluorescencję białka GFP (rozdaje prowadzący) oraz
ilość komórek widzialnych w jasnym polu (tj. całkowitą liczbę komórek) oblicz
wydajność procesu:
a. oblicz procentowy udział komórek wykazujących sygnał GFP w polu widzenia
mikroskopu dla przeprowadzonego eksperymentu w każdym wariancie: pGFP
(kontrola) oraz pGFP i pGFP-siRNA (badana)
b. oblicz wydajność wyciszenia (różnica procentowej zawartości komórek
wykazujących fluorescencję GFP pomiędzy kontrolą a próbą badaną)
2
Komora Fuchsa-Rosenthala do liczenia ilości komórek w roztworze
3