Przegląd korzyści płynących ze zmiany analizatora
advertisement
rev.1 2013-08-19 Przegląd korzyści płynących ze zmiany analizatora hematologicznego 3-Diff na analizator hematologiczny 5-Diff komórek, automatyczne analizatory zliczają średnio około 15 000 komórek w jednej próbce. Dlaczego potrzebne jest różnicowanie krwinek białych? Zautomatyzowane krwinek białych Populacja białych krwinek składa się z kilku grup, posiadających zróżnicowane funkcje biologiczne. Sama liczba krwinek białych (WBC), bez dodatkowych informacji, nie pozwala na ocenę stanu zdrowia pacjenta, a prawidłowa liczba WBC nie oznacza dobrego stanu zdrowia. Dlatego, powszechnie wykonywane jest różnicowanie krwinek białych, które standardowo dzielą się na 5 głównych grup: Limfocyty Monocyty Neutrofile Eozynofile Bazofile i zliczanie Automatyczne analizatory hematologiczne są klasyfikowane jako analizatory różnicujące populację krwinek białych na 3 grupy (analizatory 3-Diff) lub na 5 grup (analizatory 5-Diff): a) Analizatory 3-Diff Działanie analizatorów 3-Diff opiera się na impedancyjnej metodzie pomiaru, w której zliczanie i rozdział krwinek białych zależny jest od ich wielkości. Za pomocą odczynników chemicznych krwinki czerwone ulegają lizie, natomiast krwinki białe pozostają nienaruszone. W technologii impedancyjnej strumień zawiesiny komórek przechodzi przez mały otwór, w którym przepływa prąd elektryczny. Każda przepływająca komórka zmienia opór elektryczny, proporcjonalnie do swojej objętości i w ten sposób jest zliczana. Dodatkowo, metoda ogniskowania hydrodynamicznego zwiększa dokładność, zapewniając przechodzenie tylko jednej komórki w danym momencie i eliminuje nieprawidłowe oszacowanie rozmiaru (np. jednoczesne przejście dwóch komórek przez układ pomiarowy daje jeden silny impuls zamiast dwóch pojedynczych). Tradycyjną metodą różnicowania krwinek białych jest oglądanie pod mikroskopem rozmazu zabarwionego za pomocą jednej z różnych form barwienia Romanowskiego. Pierwsza metoda referencyjna różnicowania WBC, została opublikowana przez Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) w 1984 roku. Polegała na liczeniu przez cztery osoby 200 komórek w dwóch rozmazach wykonanych z tej samej probówki. Wynik stanowiła średnia otrzymana z tych czterech zliczeń. Kiedy okazało się to całkowicie niepraktyczne, w zaleceniach CLSI liczba osób oglądających rozmaz została zmniejszona do dwóch. Jednakże, dla większości laboratoriów ta procedura jest nadal zbyt czasochłonna, zatem w praktyce zliczane jest przez jedną osobę, 100 komórek w pojedynczym rozmazie. Początkowo różnicowanie poszczególnych typów leukocytów określane było tylko w odniesieniu względnym, głównie jako wartości procentowe. Obecnie uważa się, że więcej informacji dostarczają wartości bezwzględne. Rutynowo różnicowanie krwinek białych podawane jest zarówno w liczbach 9 bezwzględnych (x10 /l), jak również jako wartości procentowe (%) całkowitej liczby białych krwinek. Ryc. 1 Zasada metody impedancyjnej z ogniskowaniem hydrodynamiczym W zależności od rozmiaru komórki, identyfikowane są: Duże komórki lub granulocyty Małe komórki lub limfocyty Średnie komórki lub monocyty lub komórki „pośrednie”. Wraz z rozwojem technologii, pojawiła się możliwość różnicowania krwinek białych na automatycznych analizatorach, których główną zaletą jest szybkość i większa dokładność. W przeciwieństwie do ręcznego zliczania 100 Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o. różnicowanie Analizatory Sysmex 3-Diff pocH-100i i XP-300, posiadają bardziej zaawansowane systemy niż 1 rev.1 2013-08-19 b) Analizatory 5-Diff Zautomatyzowane analizatory 5-Diff w różnicowaniu WBC wykorzystują różne kombinacje technik: impedancji objętościowej, energii elektromagnetycznej wysokiej częstotliwości, technik optycznych i barwień cytochemicznych. Zasadnicza różnica w odniesieniu do aparatów 3-diff polega na tym, że komórki są identyfikowane w oparciu o analizę dwuwymiarową, a nie tylko o wielkość komórek. inne aparaty, ponieważ specjalny skład chemiczny odczynników, pozwana zidentyfikować neutrofile jako osobną grupę. Hematologia konwencjonalna 3-Diff 5-Diff Neutrofile Neutrofile Mieszana Bazofile Eozynofile Monocyty Limfocyty Limfocyty Analizatory Sysmex klasy X do wykonania analizy 5-Diff wykorzystują fluorescencyjną cytometrię przepływową. WBC rozdzielane są na poszczególne grupy na podstawie złożoności komórek (światła rozproszonego bocznie i sygnału fluorescencyjnego). Próbka poddana jest działaniu barwnika fluorescencyjnego, który wiąże się do wewnątrzkomórkowego DNA i RNA. Siła sygnału fluorescencji jest proporcjonalna do zawartości RNA/DNA w poszczególnych komórkach. Ponadto, różnicowanie posiada wysoki poziom dokładności, dzięki oprogramowaniu ACAS (ang. Adaptive Cluster Analysis System), który zapewnia, że każda populacja komórek tworzy wyraźny klaster jeszcze zanim zostaną zliczone wszystkie komórki. W przeciwieństwie do systemu ACAS, wykorzystywana w innych systemach stała bramkowania powoduje czasami, że komórki, zwłaszcza w próbkach patologicznych, są zliczane jako część niewłaściwej grupy. Znacznie lepsza jest zdolność analizatorów 5-Diff do zliczenia mniej licznych rodzajów komórek, mianowicie monocytów, eozynofilii i bazofilii jako oddzielnych grup, a nie jako mieszanej populacji komórek. Poszczególne typy białych krwinek posiadają różne funkcje, dlatego zmiany w bezwzględnej liczbie poszczególnych populacji dostarczają bardzo cennych informacji. Umożliwiają lekarzowi ukierunkowanie się na najbardziej prawdopodobną diagnozę, jak również monitorowanie odpowiedzi na leczenie. Ryc. 2 Różnicowanie 3-Diff. Neutrofile i limfocyty są identyfikowane jako odrębne populacje od populacji monocytów, eozynofili i bazofili, które są zliczane wspólnie jako komórki mieszane Badania porównujące dokładność automatycznego zliczania na analizatorach 3-Diff, z pierwszą metodą referencyjną – manualnym zliczaniem 800 komórek wykazały, że precyzja jest doskonała, ale dokładność jest dość słaba. Dotyczyło to zwłaszcza nieprawidłowych próbek, w których względna liczba i morfologia komórek mogą być zmienione. Dlatego uważa się, że rozdział 3-Diff dla patologicznych próbek jest niewystarczający. W stanie zdrowia, 5 głównych grup krwinek białych znajduje się w prawidłowych zakresach i proporcjach (%). Jednakże, w stanie choroby: Proporcje są zniekształcone, a zatem wzór odsetkowy w przypadku braku wartości bezwzględnych staje się bez znaczenia Liczebność grup może się zwiększać, np. w odpowiedzi na reakcję alergiczną może wzrosnąć liczba eozynofilii Liczebność grup może się zmniejszać, np. liczba limfocytów zmniejsza się stopniowo w przypadku nieleczonego zakażenia HIV Niedojrzałe komórki, które zwykle znajdują się jedynie w szpiku kostnym, mogą pojawić się w krwi obwodowej, np. niedojrzałe granulocyty u pacjentów z ciężkim zakażeniem Mogą pojawić się nieprawidłowe, niedojrzałe komórki, np. blasty u pacjentów z ostrą białaczką. Dlaczego różnicowanie białych krwinek za pomocą fluorescencyjnej cytometrii przepływowej jest lepsze niż inne technologie rozdziału 5-Diff i różnicowanie 3-Diff? a) Ocena jest niezależna od wielkości komórki Różnicowanie krwinek białych przy pomocy fluorescencyjnej cytometrii odbywa się na podstawie zawartości kwasu nukleinowego oraz wewnętrznej struktury i złożoności komórek. Rozdział 5-Diff daje o wiele więcej informacji niż rodził 3-Diff w określeniu ewentualnej przyczyny choroby. Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o. 2 rev.1 2013-08-19 b) Identyfikacja niedojrzałych komórek Ważną zaletą fluorescencyjnej cytometrii przepływowej jest możliwość identyfikacji niedojrzałych komórek krwi na podstawie większej zawartości kwasów nukleinowych w porównaniu do ich dojrzałych odpowiedników. Umożliwiło to powstanie generacji rozdziału 6-Diff przez dodanie niedojrzałych granulocytów (IG, ang. immature granulocytes). Liczba IG uwzględnia promielocyty, mielocyty i metamielocyty. Obecność niedojrzałych granulocytów, z wyjątkiem okresu po porodzie i noworodków poniżej 3 dni, zawsze wskazuje na wystąpienie patologii. Precyzja automatycznego liczenia IG jest znacznie lepsza niż metoda mikroskopowa. Jest idealna do monitorowania dużej liczby pacjentów i eliminuje pracochłonne zliczanie ręczne. Główną zaletą tej metody, której nie posiadają analizatory 3-Diff i analizatory 5-Diff innych producentów jest fakt, że różnicowanie WBC nie zależy od wielkości komórek. Jest to znacznie bardziej korzystne, ponieważ: Po poraniu krwi na EDTA zmiany wielkości komórek następują dość szybko, ponieważ nie jest to fizjologiczne środowisko dla krwinek, które znajdują się w warunkach stresu metabolicznego, co prowadzi do niedoboru glukozy i w konsekwencji do niemożności utrzymania równowagi przepływu przez błonę komórkową, wywołując obrzęk i ostatecznie rozpad komórek. Różnicowanie WCB opierające się na wielkości komórek może stać się niewiarygodne w ciągu 24 godzin. Dla porównania – analizatory Sysmex klasy X zapewniają wiarygodne zliczenie rozdziału WBC do 48 godzin po pobraniu. c) Rozbudowany system flagowania służący identyfikacji nieprawidłowych komórek Inną zaletą analizatorów Sysmex klasy X jest rozbudowany system flagowania, który umożliwia jakościową identyfikację niedojrzałych lub nieprawidłowych komórek. Analizatory 3-Diff także posiadają system flagowania, ale dostarcza on mniej informacji, ponieważ całkowicie oparty jest na zmianach wielkości komórek. Czy wymagane jest liczenie rozmazu ręcznego? Metoda mikroskopowa nadal jest niezbędna do potwierdzenia obecności populacji komórek nieprawidłowych, które przez analizator zostały zidentyfikowane jako podejrzane i oflagowane w celu zwrócenia uwagi operatora. Oglądanie rozmazu pod mikroskopem nie ma jednak na celu sprawdzenia liczebności poszczególnych grup WBC, tylko potwierdzenia obecności populacji komórek nieprawidłowych i wyszczególnienia wszelkich znaczących zmian morfologicznych. Zliczanie manualne nigdy nie będzie tak precyzyjne jak automatyczne, ponieważ liczba zliczanych komórek jest znacznie niższa. Jednak, analiza automatyczna nie zapewni tak dokładnej identyfikacji możliwej odmiany zaburzeń komórkowych. Natomiast jest mało prawdopodobnym, żeby podczas rozmazu ręcznego zostały odnalezione jakieś nieprawidłowości, jeśli aparat nie oflagował próbki. Dobrze wykonana mikroskopowa ocena rozmazu, zależy od wyszkolonych i doświadczonych osób, które są zasobem deficytowym. Pod tym względem aparat 5-Diff przyczynia się do zaoszczędzenia czasu i zwiększenia efektywności kosztowej, ponieważ Ryc. 2 Skatergramy z analizatorów Sysmex klasy X. a) Skatergram różnicujący: fluorescencja, która jest wskaźnikiem zawartości DNA/RNA w komórce jest wyrażona na osi Y, natomiast złożoność komórek i światło rozproszone bocznie jest wyrażona na osi X. b) kanał WBC/BASO – obecny w analizatorach XT i XE, wykorzystuje reakcję chemiczną, która pozostawia bazofile niezmienione, w celu oddzielenia ich od pozostałych krwinek białych w oparciu o światło rozproszone czołowo (oś Y) i światło rozproszone bocznie (oś X). Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o. 3 rev.1 2013-08-19 znacząco zmniejszają liczbę rozmazów wykonania i ukierunkowuje laboranta poszukiwanie określonej patologii. do na analizatorach hematologicznych, a jednocześnie rośnie ich przepustowość. To oczywiście zmniejsza dostępność lepszych technologii, uwzględniając w tym analizę 5-Diff, dla mniejszych laboratoriów. Sysmex rozpoznał to ograniczenie i zniwelował je poprzez wprowadzenie analizatorów serii XS. Są one zaprojektowane dla laboratoriów ze względnie małą liczbą wykonywanych analiz, ale zapewniają lepszą analizę, szczególnie próbek patologicznych. Dlaczego warto wybrać aparaty Sysmex 5-Diff? Jeśli laboratoria mają zamiar oceniać tylko podstawowe parametry, takie jak hemoglobina, liczba płytek i liczba białych krwinek, wystarczający i generujący niższe koszty jest aparat 3-Diff. Jednakże w przypadku wykonywania analiz u ludzi chorych bez wątpienia lepszy jest aparat 5-Diff, ponieważ: Rozróżnia populacje krwinek białych Posiada lepszą zdolność wykrywania nieprawidłowych komórek Posiada znacznie lepszy system flagowania Dostępne są dodatkowe, użyteczne klinicznie parametry, które mogą dostarczyć więcej informacji niż sam rozdział Analizatory klasy X są czymś więcej niż tylko licznikami komórek – nacisk został skierowany na identyfikację subtelnych cech jakościowych w celu odróżnienia stanów normalnych i patologicznych. Ryc. 3 Skatergram różnicujący Sysmex przedstawia obszary występowania populacji komórek nieprawidłowych. Podsumowanie Wszystkie informacje uzyskane z aparatu 5-Diff są przekazywane lekarzowi, który informuje pacjentów o dalszych decyzjach w sprawie leczenia. W ten sposób stanowią korzyść dla pacjenta. Z tego powodu aparaty 5-Diff są zdecydowanie tak samo lub nawet bardziej korzystne kosztowo niż analizatory 3-Diff. Redukcja czasu wymaganego przy wykonaniu analizy mikroskopowej próbek po oznaczeniu na analizatorze 5-Diff w porównaniu do analizatora 3-Diff, przyczynia się do ogólnych korzyści dla laboratoriów. Ogólnie rzecz ujmując, dostępne właściwości i mierzone parametry są coraz bardziej zaawansowane w różnych Copyright Sysmex Polska Sp. z o.o. 4
