Zbadaj szczepionkę przeciwko wirusowi HIV

advertisement
Zbadaj
szczepionkę
przeciwko
wirusowi HIV
Warsztaty doświadczalne
Protokół
Podsumowanie
Instytut Badań nad AIDS IrsiCaixa opracowuje szczepionkę chroniącą ludzi przed zakażeniem wirusem wywołującym AIDS (HIV) i niedawno zidentyfikował kandydata na
szczepionkę, który obecnie jest w fazie opracowywania.
Jednym z głównych problemów programu opracowywania
szczepionek jest ogromna różnorodność typów wirusa w
różnych regionach świata.
W tej pracowni spróbujesz sprawdzić, czy szczepionka
przeciwko HIV, opracowana przez IrsiCaixa może
zapewnić skuteczną ochronę ludziom na różnych
kontynentach.
Wprowadzenie
Ponad 33 miliony osób na całym świecie są zarażone wirusem HIV wywołującym AIDS i co minutę kolejnych sześć
osób ulega zakażeniu. Obecnie mamy już leki wydłużające życie i poprawiające jego jakość u osób zakażonych,
ale nie znamy kuracji umożliwiającej całkowite wyleczenie
i nie mamy szczepionki.
Instytut Badań nad AIDS IrsiCaixa od ponad 15 lat pracuje nad szczepionką i stara się ulepszyć istniejące leki. W
międzyczasie najlepszym narzędziem do walki z pandemią pozostaje profilaktyka.
2
Szczepionka jest substancją, która „uczy” układ odpornościowy (immunologiczny), jak rozpoznawać wirusy lub
bakterie powodujące choroby i jak się przed nimi bronić.
W momencie podania szczepionki nasz układ odpornościowy rozpoznaje składniki szczepionki jako ciała obce
i uruchamia odpowiednią odpowiedź organizmu. Dzięki
temu, gdy zaatakują nas drobnoustroje, układ immunologiczny będzie gotowy do walki.
1
2
3
1. Białko będące kandydatem na szczepionkę stymuluje
układ immunologiczny do produkcji skierowanych przeciwko niemu przeciwciał.
2. Jeżeli zaszczepiona osoba zakazi się, będzie już mieć
przeciwciała, które zaatakują wirusa HIV.
3. Ale jeżeli zaszczepiona osoba zakazi się wirusem HIV,
który składa się z innego białka, przeciwciała wytworzone
przez szczepionkę nie będą pomocne w zwalczaniu tej infekcji.
3
Trudność w opracowaniu szczepionki przeciwko wirusowi HIV polega na wymyśleniu takiej szczepionki, która potrafi aktywować układ odpornościowy, tak aby całkowicie
wyeliminować infekcję wywołaną przez miliony genotypów
wirusa HIV, które istnieją na całym świecie.
0 1 _ AE 13832
4,3 %
02 _ AG 9594
3,0 %
A
22714
7,1 %
B 199411 62,1 %
C
42993 13,4 %
DE 8465
2,6 %
F
3050
0,9 %
G
3909
1,2 %
inne 17227
5,4 %
- - - - - - - - - - - razem 321195 100,0%
Rozkład różnych genotypów wirusa HIV-1 na świecie. (Baza danych sekwencji HIV Los Alamos, www.hiv.lanl.gov)
4
W jaki sposób można
uczestniczyć w poszukiwaniu
szczepionki przeciwko wirusowi
HIV?
W ramach naszych warsztatów będzie można zbadać
białko wirusa HIV, które instytut IrsiCaixa zidentyfikował
jako możliwy składnik szczepionki chroniącej ludzi przed
wirusem. W laboratorium (czyli w warunkach „in vitro”) wykazano, że to białko stymuluje odpowiedź układu immunologicznego.
Obecnie instytut IrsiCaixa prowadzi dalsze badania in vitro, aby ocenić skuteczność tego białka, a jeżeli wszystko pójdzie dobrze, rozpoczną się bardziej zaawansowane
prace rozwojowe, zakończone badaniami z udziałem pacjentów.
Celem naszych warsztatów będzie określenie, czy kandydat na szczepionkę instytutu IrsiCaixa będzie skutecznie
chronić ludzi przed mnogością genotypów wirusa HIV w
różnych rejonach świata. A może będziemy musieli opracować różne szczepionki dla różnych części świata?
Aby to zbadać, należy sprawdzić, czy to białko występuje
w genotypach wirusa HIV z Afryki, Azji i Europy.
Jeżeli występuje, szczepionka może skuteczne chronić
przed zakażeniem tymi genotypami wirusa HIV przez wywołanie reakcji na nie ze strony układu immunologicznego. Taka szczepionka mogłaby skutecznie chronić populacje tych kontynentów.
Ale jeżeli dowolny z tych genotypów nie zawiera białka będącego kandydatem na szczepionkę, to taka szczepionka
nie będzie skutecznie zwalczać tego genotypu wirusa HIV
i trzeba będzie ją zmodyfikować.
?
Wirus afrykański
?
Wirus azjatycki
?
Wirus europejski
5
Cele
• Udział w programie opracowywania szczepionki przeciwko AIDS przez IrsiCaixa zgodnie z etapami metody naukowej.
• Stosowanie technik laboratoryjnych typowych dla tej
dziedziny nauki, takich jak rozdzielanie fragmentów
DNA metodą elektroforezy czy cięcie DNA za pomocą
enzymów restrykcyjnych.
• Zbadanie i poznanie ogromnej różnorodności odmian
wirusa powodującego AIDS.
• Sprawdzenie, czy białko rozpoznane przez instytut IrsiCaixa jako kandydat na szczepionkę może skutecznie
stymulować układ immunologiczny osób narażonych
na większość genotypów wirusa HIV z różnych kontynentów: Afryki, Azji i Europy.
Hipoteza
Aby stać się częścią szczepionki, białkokandydat rozpoznane przez instytut IrsiCaixa
nie jest modyfikowane w przypadku znacznej
większości genotypów wirusa HIV istniejących
na świecie. Dlatego szczepionka zawierająca
to białko powinna być jednakowo skuteczna w
zwalczaniu większości istniejących genotypów
wirusa HIV.
6
Metodyka
Będziemy pracować z próbkami DNA pochodzącymi od
trzech najbardziej rozpowszechnionych genotypów wirusa HIV występujących na trzech kontynentach: w Afryce,
Azji i Europie.
DNA
Białko będące kandydatem
Będziemy mieć także próbkę DNA zawierającą informacje
potrzebne do wytworzenia białka będącego kandydatem
na szczepionkę IrsiCaixa. Za pomocą tych próbek zbadasz, czy różne genotypy wirusa HIV zawierają sekwencję
DNA kandydata.
DNA
Najbardziej popularny genotyp wirusa HIV w Europie
DNA
Najbardziej popularny genotyp wirusa HIV w Afryce
DNA
Najbardziej popularny genotyp wirusa HIV w Azji
7
W celu przeprowadzenia tego badania wykonamy następujące zadania:
(A) Cięcie nici DNA wirusów pochodzących
z trzech kontynentów: Wykorzystamy do tego enzymy restrykcyjne, czyli białka, które są znane badaczom
ze względu na zdolność przecinania DNA w konkretnych
miejscach. Enzym, który zastosujemy, precyzyjnie przecina miejsce, w którym znajduje się gen odpowiedzialny
za syntezę białka będącego kandydatem, ale nie przetnie
go, jeżeli istnieją jakiekolwiek zmiany w badanym odcinku DNA. Dlatego próbki DNA zostaną pocięte tylko wtedy,
gdy ten gen nie jest zmodyfikowany.
(B) Rozdzielenie fragmentów DNA: Za pomocą metody o nazwie elektroforeza rozdzielimy fragmenty
DNA powstałe w trakcie trawienia enzymami.
(C) Wizualizacja fragmentów DNA: Uwidocznimy, które próbki DNA zostały pocięte, a dzięki temu dowiemy się, które genotypy są odpowiedzialne za syntezę
białka-kandydata.
A
T
C G
A G C
T
C G
A G C
B
T
T
T
A C G
A A A T
T
T
T
A A A
G C
T
C
A G
A C C
T
T
A G
G G
C
A C
T
T
A A A
G
T
A C
T
T
A A A
G
T
T
T
T
C G
A G C
T
T
T
A C G
A A A
C G
A G C
T
T
T
A A
T
T
G C
A C C
A T
G G
T
T
C
A C
T
T
G
A A A
A C
T
T
T
A A A
A G
C
A G
G
T
T
T
C
8
Wyniki i wnioski
Porównamy sekwencje genetyczne różnych genotypów wirusa HIV, analizując skutki działania enzymu restrykcyjnego, a dzięki temu poznamy różnice w ich DNA. Dzięki tym
informacjom będziemy mogli zbadać ogromną różnorodność wirusa HIV.
Uzyskane wyniki pozwolą nam na określenie, czy białko będące kandydatem IrsiCaixa może skutecznie chronić
osoby pochodzące z różnych kontynentów, czy też należy
opracować różne szczepionki, każdą dostosowaną do sekwencji wirusa obecnego w danym rejonie geograficznym.
9
Wymagane
instrumenty i materiały
Instrumenty i materiały laboratoryjne pipety o pojemności 10 i 20 µl
stojaki
łaźnia wodna i statyw na probówki
zasilacz
żel agarozowy
3 pojemniki (do barwienia i oczyszczania żelu)
chłodziarka
komora do elektroforezy
minutnik
marker do pisania na
szkle
10
Materiały jednorazowe
rękawice i fartuchy
końcówki do pipet
probówki 1,5 ml i/lub
0,5 ml
Odczynniki i rozpuszczalniki *
DNA wirusa z różnych
próbek
enzym restrykcyjny Nhel
+ bufor (1)
marker mas
cząsteczkowych (2)
bufor TAE
500 ml 0,5x TAE (3)
bufor
obciążający (4)
płyn do wybarwiania DNA
(Stain Fast 100x)
woda destylowana: 3 szklane butelki o pojemności 500 ml
i jedna probówka 1,5 ml.
(1) Bufor jest potrzebny, aby uzyskać
odpowiednie podłoże do działania
enzymów.
(2) Etykieta na markerze informuje, że służy
on do pomiaru różnych fragmentów od
100 do 3000 par zasad.
(3) Aby utrzymać pH, zawiera także
sole ułatwiające przepływ prądu
elektrycznego (w stężeniu 0,5 x do
napełnienia komory).
(4) Nadaje kolor i gęstość próbkom, dzięki
czemu można je łatwiej zlokalizować.
*Zamierzając przeprowadzić to doświadczenie w szkole lub muzeum, należy skontaktować się z nami, pisząc pod adres [email protected] w celu
uzyskania wymaganych odczynników.
11
Procedura
A
Cięcie nici DNA wirusów pochodzących z trzech kontynentów +
Wprowadzenie
Potniemy DNA trzech genotypów wirusa HIV, wykorzystując
enzymy restrykcyjne, czyli białka, które są znane badaczom
ze względu na zdolność przecinania DNA w konkretnych
T
C G
T
T
T
A C G
A C
T
A G
T
A A A
A G C
A A A
A C C
T
A C
T
T
T
T
A G
T
A A A
A G C
A A A T
T
T
C G
A G C
T
T
A A A
G C
G G
T
C
C
G
G
T
T
T
miejscach. Enzym, który zastosujemy, precyzyjnie przecina
gen odpowiedzialny za syntezę białka będącego kandydatem, ale nie przetnie go, jeżeli istnieją jakiekolwiek zmiany w
badanym obszarze DNA. Dlatego próbki DNA będą pocięte
tylko wtedy, gdy ten gen nie jest zmodyfikowany.
T
T
C G
C G
A G C
T
T
T
A A
T
T
A C G
T
G C
A C C
A T
G G
T
T
C
A C
T
T
G
A A A
A C
T
T
T
A A A
A G
C
A G
G
T
T
T
12
Procedura A
1
2
Zamykamy probówkę i delikatnie mieszamy
jej zawartość, ostukując probówkę palcem.
Za pomocą pipety przygotujemy składniki mieszaniny do reakcji trawienia w czterech odpowiednio
oznakowanych probówkach 1,5 ml. Do każdej probówki dodamy:
• Wodę destylowaną
16 µl
• Bufor w celu zapewnienia prawidłowego działania
enzymu restrykcyjnego (zielony) 3 µl
• Enzym restrykcyjny (zimny) 1 µl
• Jedną z czterech próbek DNA
(zawierających jedno białko będące
kandydatem i 3 genotypy wirusa HIV) 10 µl
3
Przetrzymujemy (inkubujemy) probówkę w
temperaturze 37°C przez 5 minut, aby enzym
restrykcyjny mógł przeciąć DNA.
4
Po 5 minutach wkładamy probówkę do chłodziarki, aby zatrzymać reakcję trawienia.
13
B
Rozdzielanie pociętych fragmentów DNA
Wprowadzenie
Aby rozdzielić fragmenty DNA, zastosujemy powszechnie
stosowaną w laboratoriach metodę o nazwie elektroforeza, która umożliwia rozdzielenie fragmentów DNA na podstawie ich długości.
W tym celu próbki DNA umieszcza się na porowatym żelu
przygotowanym na bazie żelatyny z wodorostów. Aby ułatwić umieszczanie próbek i zobaczyć, jak się przemieszczają, należy dodać „buforu obciążającego”, który nadaje
im gęstość i kolor. Żel zawiera także „marker DNA”, składający się z fragmentów DNA o znanej długości, który ułatwi ocenę długości badanych fragmentów próbki.
Do żelu zostaje przyłożony prąd elektryczny - ładunek
ujemny po jednej stronie, a dodatni po drugiej. Ponieważ
fragmenty DNA mają naturalnie ładunek ujemny, po
umieszczeniu ich z jednej strony żelu są przyciągane
przez ładunek dodatni i przemieszczane. Odległość, jaką
pokonają w żelu jest proporcjonalna do ich długości:
krótsze fragmenty mogą być przemieszczane szybciej niż
dłuższe, które wolniej przechodzą przez pory żelu.
14
Procedura B
1
2
Umieszczamy żel pośrodku komory do
elektroforezy, zagłębieniami od strony ładunku
ujemnego. Następnie wypełniamy komorę
buforem TAE 0,5x, wlewając go po bokach,
tak aby nie uszkodzić żelu i całkowicie go
przykryć.
Przygotowujemy próbki DNA z buforem obciążającym: nie będzie konieczne dodanie buforu obciążającego do próbek trawionych enzymami restrykcyjnymi, ponieważ bufor enzymatyczny, którego
już dodaliśmy, zawiera zielony bufor obciążający.
Dlatego bierzemy 3 probówki 0,5 ml i za pomocą pipety dodajemy 2 µl zielonego buforu obciążającego i 20 µl pierwotnej, niepoddanej trawieniu
próbki. Te próbki będą pełnić rolę kontroli.
3
4
Przykrywamy komorę i podłączamy ją do źródła
zasilania 130 V / 200 mA na około 20 minut.
Wprowadzamy próbki do zagłębień za pomocą pipety, w niniejszej kolejności:
• pierwsze zagłębienie na (25 µl) markera DNA
• kolejne trzy zagłębienia na próbki DNA zawierające
niestrawione genotypy (20 µl)
• i kolejne cztery na próbki po trawieniu (pierwszy na
DNA kandydata, a następne na próbki 3 genotypów
wirusa HIV) (25 µl)
15
W trakcie elektroforezy należy przećwiczyć mapę restrykcyjną
1. Rozpoznaj sekwencję(e) docelową(e) enzymu restrykcyjnego Nhel w obrębie pełnej sekwencji DNA białka
będącego kandydatem.
Uzupełnij sekwencję DNA kandydata na szczepionkę:
1 ...
300
310
320
A T G G G A T C G A G C T
A T
A G C T
A T
A G G G G
T
T
T
T
T
A C
C
C
T
A G C
T
C G
A
A
330
C G
A
A
C
A G C
T
A G C
A G
T
G
A C
360
C T G T
G
A C
A
A G C T
T
C G
A
C
C G G
A
A T
T
A C G C
A
A
T
T
T
T
A C A C T
A
T
T
T
A
T
A C
380
T
T
T
T
A
T C G T
T C G
A G C
A G C
A
400
A G C C G A T G A G C T
T
A C
A A A A A A T
390
A T G C G T
G
A T G
370
A G G C C T
T
A
C G G C
T
A C
C G
T
A
410
A G C G A T
T
C
350
A C T G A A T
T
C
340
T C G T C G C C C A T C G T C A C T G T
A G C G G G
C
C G C
T
C G G G A C
A G C
C
C
T
G
... 1400 par zasad
G
T
G
A
Sekwencja docelowa enzymu restrykcyjnego:
C G A T
G C
T
C G
A G C
16
2. Ile fragmentów DNA otrzymamy, jeżeli enzym znajdzie swój cel i przetnie DNA? Jakiej wielkości?
3. Ile fragmentów DNA otrzymamy, jeżeli enzym NIE znajdzie swojego celu i NIE przetnie DNA? Jakiej
wielkości?
4. W jaki sposób, według Ciebie, marker DNA pomoże określić wymiary otrzymanych fragmentów?
5. Rozpoznaj sekwencję(e) docelową(e) enzymu restrykcyjnego EcoRV w obrębie pełnej sekwencji DNA białka
będącego kandydatem:
C
T
A T
G A T
A G
A T
C
6. Ile fragmentów DNA otrzymalibyśmy, gdybyśmy zastosowali ten inny enzym? Jakiej wielkości?
(W doświadczeniu wykorzystaliśmy enzym Nhel, ponieważ miejsce, które przecina, interesuje nas pod względem badawczym, gdyż bardziej skutecznie stymuluje układ immunologiczny)
17
Praktyka: zobacz, jak przebiega elektroforeza
7. Dlaczego rozdzielamy fragmenty? Jak się oddziela te fragmenty od żelu agarozowego?
8. Jaki ładunek ma DNA? Co by się stało w przypadku odwrotnego podłączenia elektrod?
9. Co można zobaczyć? Dlaczego został dodany bufor obciążający?
18
C
Wizualizacja fragmentów DNA
Wprowadzenie
Na tym etapie wybarwiamy fragmenty DNA, aby móc
je zobaczyć i sprawdzić, czy zostały pocięte. Tylko
te fragmenty, które zostały pocięte, będą mieć gen
odpowiedzialny za syntezę białka będącego kandydatem
IrsiCaixa z oryginalną sekwencją, czyli bez mutacji.
3000 pz
1000
500
100
C
19
Procedura C
1
Wyjmujemy żel ze statywów i zanurzamy w
roztworze w celu barwienia (Stain Fast Blast)
w „pojemniku” o odpowiedniej wielkości na
około 2 minuty.
2
Przenosimy żel do
większego „pojemnika”,
zawierającego 500 ml
wody. Ostrożnie poruszamy żelem przez
około 10 minut, aby go
„przepłukać”.
3
Teraz musimy umyć
żel: Przenosimy
żel do trzeciego
„pojemnika”,
zawierającego
500 ml czystej
wody i delikatnie
poruszamy żelem
co minutę, łącznie
przez 5 minut.
4
Przeprowadzamy drugie płukanie zgodnie z
opisem w poprzednim rozdziale.
5
Prążki DNA powinny się już pojawić na żelu, ale
raczej będą zamazane. Jeżeli poczekamy od 5
do 15 minut, staną się bardziej wyraźne. *
*Aby uzyskać
lepszy kontrast,
należy
zastosować
dodatkowe
kilkukrotne
płukanie wodą.
20
Wyniki i wnioski
10. Przypatrz się prążkom DNA uzyskanym dla każdej próbki każdego genotypu i narysuj wyniki poniżej.
Zaznacz także długość segmentów markera DNA.
11. Jaki wpływ miały enzymy restrykcyjne na każdy genotyp?
Wirus afrykański
Wirus europejski
Wirus azjatycki
21
12. Czy istnieje jakiś genotyp wirusa HIV, na który enzym nie zadziałał?
13. Jaki wniosek wynika z Twoich badań? (Odnieś się do początkowej hipotezy).
22
O instytucie IrsiCaixa
Czym jest instytut IrsiCaixa?
Instytut Badań nad AIDS IrsiCaixa jest międzynarodowym
instytutem referencyjnym, którego celem jest poszerzanie
wiedzy, profilaktyka i leczenie zakażenia wirusem HIV
i AIDS, przy czym celem ostatecznym jest eliminacja
epidemii.
Instytut IrsiCaixa, wspierany przez fundację „la Caixa” i
Wydział Zdrowia Rządu Katalonii, został założony w roku
1995 jako prywatna organizacja non-profit przy szpitalu
uniwersyteckim Germans Trias i Pujol de Badalona.
Instytut IrsiCaixa, kierowany przez dr Bonaventurę
Cloteta, skupia ponad pięćdziesięciu badaczy, którzy
są zaangażowani głównie w badania podstawowe,
zmierzające do wyjaśnienia mechanizmów zakażenia
wirusem HIV oraz opracowania nowych leków i
szczepionek. Jednocześnie instytut IrsiCaixa uczestniczy
w badaniach klinicznych oceniających nowe strategie
terapeutyczne i współpracuje z krajami rozwijającymi się
w celu zwalczenia globalnej pandemii.
Badania naukowe Instytutu Badań nad AIDS IrsiCaixa
są prowadzone we współpracy z najbardziej znanymi
międzynarodowymi ośrodkami naukowymi, a publikacje
uzyskują jeden z najwyższych współczynników IF (ang.
impact factor) w tej dziedzinie.
23
Aneks
Środki zapewniające bezpieczeństwo
Odpowiednia wiedza
Zobacz, gdzie znajdują się środki zapewniające
bezpieczeństwo w laboratorium lub miejscu
przeznaczonym do przeprowadzania doświadczeń
(gaśnice, prysznice lub łazienki, wyjścia awaryjne itp.).
Przed przeprowadzeniem doświadczenia dokładnie
przeczytaj instrukcje. Nie zapomnij przeczytać etykiet
bezpieczeństwa odczynników i aparatury.
Noś odpowiednią odzież
Rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne.
Ogólne zasady
Nie wolno palić, jeść ani pić w laboratorium lub w miejscu
przeznaczonym na doświadczenia. Należy pracować
systematycznie, starannie i bez pośpiechu. Rozlany
produkt należy natychmiast usunąć. Materiały należy
zawsze zostawiać czyste i uporządkowane. Nigdy
nie należy stosować sprzętu ani urządzenia, jeżeli
nie poznano dokładnie sposobu jego działania. Przed
opuszczeniem laboratorium należy umyć ręce.
Praca ze szkłem
W trakcie pracy ze szkłem należy chronić ręce i zwracać
uwagę na temperaturę, ponieważ szkło gorące nie różni
się wyglądem od zimnego. Nie należy używać elementów
szklanych, które są popękane.
Związki chemiczne
Nie wolno używać żadnych odczynników w butelkach
bez etykiety lub z niewłaściwymi etykietami. Związków
chemicznych nie wolno wąchać, wdychać, smakować ani
dotykać. Nigdy nie należy pipetować ustami. W czasie
pracy ze związkami toksycznymi lub żrącymi należy
nosić rękawice i często myć ręce. W przypadku kontaktu
z oczami należy je natychmiast przemyć wodą. Nie
wolno zbliżać pojemników z odczynnikami do płomienia.
Nie wolno podgrzewać palnych cieczy. Butelki należy
przenosić, trzymając je za dno, a nie za szyjkę.
Utylizacja odpadów
Odpady w postaci stałej i płynnej wymagające takiego
traktowania należy usuwać do specjalnych, odpowiednio
oznakowanych pojemników. Wszelkie pytania kieruj do
instruktora. Nigdy nie wolno wyrzucać odpadów stałych
do zlewu.
Pamiętaj
W razie wypadku należy niezwłocznie powiadomić
instruktora.
Szczególne środki ostrożności
dotyczące tych warsztatów
W czasie tych warsztatów będziesz pracować z
odczynnikami chemicznymi, rozpuszczalnikami i
instrumentami, które stanowią następujące zagrożenia:
Bufor TAE: Jest toksyczny w przypadku spożycia i
może powodować poważne podrażnienie oczu. Należy
go utylizować jako odpad niebezpieczny.
Żel agarozowy: Należy utylizować jako odpad
niebezpieczny. Ponieważ zawiera bufor TAE, należy
postępować zgodnie z powyższymi instrukcjami.
DNA Stain Fast Blast: Toksyczny po spożyciu. Nie
ma konieczności utylizacji jako odpadu niebezpiecznego,
ale należy rozcieńczyć dużą ilością wody.
Elektroforeza: Należy zwracać szczególną uwagę na
zagrożenia związane z prądem elektrycznym.
24
Kontynuuj swoje badania na Xplore Health!
Badacze, którzy pomagali przygotować treść: Marta Curriu, badaczka instytutu IrsiCaixa.
opracowano przez
Niniejsza praca została objęta licencją Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported
Creative Commons. Kopię licencji zaprezentowano na stronie http://creativecommons.org/
licenses/by-nc-nd/3.0/
Download
Random flashcards
123

2 Cards oauth2_google_0a87d737-559d-4799-9194-d76e8d2e5390

ALICJA

4 Cards oauth2_google_3d22cb2e-d639-45de-a1f9-1584cfd7eea2

bvbzbx

2 Cards oauth2_google_e1804830-50f6-410f-8885-745c7a100970

Motywacja w zzl

3 Cards ypy

Pomiary elektr

2 Cards m.duchnowski

Create flashcards