Molekularne metody badań genetycznych
advertisement
Współczesne techniki analizy DNA Janusz Zimowski Zakład Genetyki, IPiN Izolacja DNA • Materiał: – Krew obwodowa – Płyn owodniowy – Kosmówka – Włosy (cebulka) – Sperma – Inna tkanka – mięsieo, wątroba, nabłonek Izolacja DNA • • • • • Metoda fenolowa Wysalanie Kolumienki z membraną Kulki metalowe Robot Schemat budowy genu Promotor Ekson 1 Ekson 2 Ekson 3 c.1467G>T CACACACACACAC AUG UGA p.389V>F Val>Phe Hybrydyzacja Southerna Linia startu elektroforezy CTGAAAGCTGCTCCCATA GACTTTCGACGAGGGTAT Sekwencje komplementarne z sekwencją sondy Autoradiogram PCR PCR-RFLP • Amplifikacja • Trawienie enzymem restrykcyjnym • Elektrofoereza 1 2 3 Analiza metylacji DNA • Inaktywacja przez metylację • Odmatczyne/odojcowskie pochodzenie genu Enzym restrykcyjny wrażliwy na metylację nie wrażliwy na metylację Odcisk genetyczny • Hybrydyzacja z sondą molekularną Aleca Jeffreysa – identyfikacja wysokopolimorficznych tandemowych powtórzeo (VNTR) • PCR identyfikujący sekwencje mikrosatelitarne (STR) Odcisk genetyczny PCR w czasie rzeczywistym • Metoda ilościowego oznaczania DNA – monitorowanie zmian stężenia produktu PCR poprzez pomiar fluorescencji proporcjonalnej do jego ilości w czasie trwania reakcji. • SYBR Green I – barwnik przyłączający się do dwuniciowego DNA PCR w czasie rzeczywistym Macierz DNA • Hybrydyzacja badanego materiału do DNA związanego z nośnikiem • Mikromacierze oligonukleotydowe • Mikromacierze cDNA • Makromacierze cDNA na filtrach nylonowych aCGH MLPA SSCP Denaturacja Elektroforeza w poliakrylamidowym Sekwencjonowanie 5’ 3’ GCATCAGCTGATCTA 3’ CGTAGTCGACTAGAT 5’ Denaturacja Znakowany starter 5’ Jednoniciowy DNA - matryca 3’ 3’ CGTAGTCGACTAGAT 5’ Przyłączanie startera 5’ 3’ 3’ CGTAGTCGACTAGAT 5’ Synteza DNA Reakcja syntezy z użyciem polimerazy DNA, dNTP i terminujących dideoksynukleotydów Terminacja A GCA CATCA GCATCAGCTGA GCATCAGCTGATCTA Terminacja C GC GCATC GCATCAGC GCATCAGCTGATC Elektroforeza Terminacja G G GCATCAG GCATCAGCTG Terminacja T GCAT GCATCAGCT GCATCAGCTGAT GCATCAGCTGATCT NGS – tworzenie biblioteki NGS – hybrydyzacja i wydłużanie adapter sequence > 200 mln fragmentów jednoniciowego DNA ulega hybrydyzacji 3' extension adapter sequence NGS – związane nici DNA Denaturacja Usunięcie pierwotnych nici DNA NGS – tworzenie mostków NGS – amplifikacja Tworzenie klastrów NGS – lineryzacja NGS – usunięcie nici DNA w jednej orientacji NGS – zablokowanie kooców 3’ NGS – hybrydyzacja starterów do sekwencjonowania Startery hybrydyzują do sekwencji adapterów sequencing primer NGS - sekwencjonowanie Add 4 Fl-NTP’s + Polymerase Incorporated FlNTP is imaged X 36 - 101 Sequencing Terminator and fluorescent dye are cleaved from the Fl-NTP
