Endokrynologia Pediatryczna Pediatric Endocrinology

Bossowski A. i inni: Analiza komórek T regulatorowych we krwi obwodowej u dzieci i młodzieży z chorobą Gravesa–Basedowa...
Vol. 10/2011 Nr 1(34)
Endokrynologia Pediatryczna
Pediatric Endocrinology
Analiza komórek T regulatorowych we krwi obwodowej u dzieci i młodzieży z chorobą
Gravesa–Basedowa i zapaleniem tarczycy typu Hashimoto
Analysis of T Regulatory Cells in the Peripheral Blood in Children and Adolescents
with Graves’ Disease and Hashimoto’s Thyroiditis
Artur Bossowski, 2Marcin Moniuszko, 3Milena Dąbrowska, 4Małgorzata Mrugacz, 1Beata Sawicka,
Anna Bossowska, 2Marta Jeznach, 2Anna Bodzenta-Łukaszyk
1
5
Klinika Pediatrii, Endokrynologii, Diabetologii z Pododdziałem Kardiologii; 2Klinika Alergologii i Chorób Wewnętrznych; 3Zakład Diagnostyki
Hematologicznej; 4Klinika Okulistyki Dziecięcej, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku; 5Oddział Kardiologii i Szpital MSWiA w Białymstoku
1
Adres do korespondencji:
Artur Bossowski MD PhD, Klinika Pediatrii, Endokrynologii, Diabetologii z Pododdziałem Kardiologii,
Uniwersytet Medyczny w Białymstoku, Polska, ul. Waszyngtona 17, 15-274 Białystok,
tel. 857450-735, fax (085)7450730, e-mail: [email protected]
Słowa kluczowe: Tregs, choroba Gravesa–Basedow, zapalenie tarczycy typu Hashimoto
Key words: Tregs, Graves’ disease, Hashimoto’s thyroiditis
STRESZCZENIE/ABSTRACT
Schorzenia autoimmunizacyjne tarczycy (AITD) należą do jednych z najczęściej występujących narządowo-swoistych chorób immunologicznych. Współistnienie predyspozycji genetycznej, dysfunkcji immunologicznej oraz działanie czynników środowiskowych odpowiada za inicjację i rozwój AITD. W ostatnich latach podkreśla się istotną
rolę komórek T regulatorowych (fenotyp CD4+CD25+) o właściwościach supresyjnych uczestniczących w regulacji obwodowej tolerancji immunologicznej. Celem pracy była ocena odsetka komórek T regulatorowych o fenotypie
CD4+CD25high, CD4+ CD25+CD127low and CD4+ FoxP3 u pacjentów z chorobą Gravesa–Basedowa (GB) (n = 20,
średni wiek 14,9 lat), zapaleniem tarczycy typu Hashimoto (n = 20, średni wiek 15,2 lat) i w grupie kontrolnej dzieci
zdrowych z ujemnym wywiadem w kierunku chorób zapalnych, układowych i nowotworowych (n = 20, średni wiek
15,4 lat). Analiza subpopulacji komórek Tregs została przeprowadzona w oparciu o czterokolorową cystometrię przepływową z wykorzystaniem aparatu FACSCalibur (BD Biosciences). U pacjentów z chorobą GB i HT stwierdzono
istotne statystycznie obniżenie odsetka komórek Tregs o fenotypie CD4+FoxP3 (p < 0,007, p < 0,01) i CD4+CD25high
(p < 0,01, p < 0,048) w porównaniu z grupą kontrolną. Analiza populacji komórek CD4+CD25+CD127low T nie wykryła istotnych różnic w obu schorzeniach autoimmunizacyjnych tarczycy w stosunku do dzieci zdrowych. Przeprowadzona ocena zależności pomiędzy stężeniem p/ciał przeciwtarczycowych a odsetkiem poszczególnych subpopulacji komórek Tregs wykazała w grupie z nowo rozpoznaną chorobą GB ujemną zależność pomiędzy odsetkiem komórek T CD4+CD25high a mianem p/ciał anty-TSH-R (r = -0,43, p < 0,03). Można stwierdzić, że zmniejszenie odsetka
subpopulacji limfocytów Tregs o fenotypie CD4+FoxP3 i CD4+CD25high we krwi obwodowej jest odpowiedzialne za
37
Praca oryginalna
Endokrynol. Ped., 10/2011;1(34):37-48
utratę tolerancji immunologicznej i w konsekwencji rozwój schorzeń autoimmunizacyjnych tarczycy wieku rozwojowego. Endokrynol. Ped. 10/2011;1(34):37-48.
Autoimmune thyroid disease (AITD) is the most common organ-specific autoimmune disorders. Genetic background,
environmental and endogenous factors are play important roles in determining the activation of immune cells or the
efficacy of the immunoregulatory pathways. In recent years underlined the immunosuppressive role of T lymphocytes
with expression of CD4+CD25+ (Tregs) in regulation mechanisms of peripheral immune tolerance. The aim of
the study was to estimate the expression of CD4+CD25high, CD4+ CD25+CD127low and CD4+ FoxP3 T cells in
patients with Graves’ disease (GD) (n = 20, mean age 14.9 years old), in patients with Hashimoto’s thyroiditis (HT)
(n = 20, mean age 15.2 years old) in comparison with sex- and age-matched healthy control subjects (n = 20, mean
age 15.4 years old). The expression of the immune cells populations were analyzed by the four-color flow cytometry
using a FACSCalibur (BD Biosciences) cytometer. In untreated patients with Graves’ disease and HT we observed
a significant decrease of CD4+FoxP3 (p < 0.007, p < 0.01) and CD4+CD25high (p < 0.01, p < 0.048) T lymphocytes
in comparison to the healthy control subjects. The analysis of CD4+CD25+CD127low T cells in the peripheral
blood revealed comparable percentages of these cells in patients with thyroid autoimmune diseases to the controls.
In untreated Graves’ patients negative correlation between percentage of CD4+CD25high T cells and serum level
of anti-TSH-R (r = -0.43, p < 0.03) antibodies was found, while no such correlation were detected in relation to
CD4+CD25+CD127low or CD4+ FoxP3 T cells. We conclude that the reduction number of Treg cells with expression
of CD4+CD25high and CD4+FoxP3 could be responsible for loses immune tolerance and development of autoimmune
process in thyroid disorders. Pediatr. Endocrinol. 10/2011;1(34):37-48.
Wstęp
Wśród narządowo-swoistych chorób immunolo-gicznych dużą grupę stanowią choroby układu dokrewnego, a zwłaszcza autoimmunizacyjne choroby tarczycy (AITD), tj. choroba Gravesa
–Basedowa i przewlekłe limfocytarne zapalenie
tarczycy typu Hashimoto. Choroby te, wraz z innymi schorzeniami autoimmunizacyjnymi tarczycy, stanowią około 30% wszystkich chorób autoimmunizacyjnych [1]. Regulacja stopnia nasilenia
antygenowo-swoistej odpowiedzi immunologicznej zachodzi w organizmie na wiele różnych sposobów. Właściwie zróżnicowana reakcja immunologiczna ma kluczowe znaczenie dla efektywnego
rozpoznawania i usuwania obcych antygenów, zapewniając tym samym bezpieczeństwo tkankom
i narządom gospodarza. W grasicy dochodzi do
delecji klonalnej autoreaktywnych limfocytów,
natomiast w obwodowych narządach układu immunologicznego tolerancja uzyskiwana jest przez
anergię lub aktywną supresję z udziałem limfocytów T regulatorowych (supresorowych) Tregs,
które poprzez swoją funkcję utrzymują homeostazę immunologiczną [2].
Limfocyty T regulatorowe stanowią 5–10% populacji limfocytów CD4+ i cechują się swoistą
ekspresją czynnika transkrypcji FoxP3, odpowiedzialnego za hamowanie nadmiernej reakcji układu odpornościowego. Dodatkowo FoxP3 kodujący
skurfinę, negatywny czynnik transkrypcji, blokuje
38
ekspresję cytokin prozapalnych zaangażowanych
w aktywację limfocytów Th1 [3]. Oznaczanie jednak czynnika FoxP3 wiąże się z długotrwałą procedurą laboratoryjną (permeabilizacja) oraz brakiem
możliwości użycia komórek do dalszych badań, np.
funkcjonalnych. Ostatnio wykryto silną korelację
pomiędzy wewnątrzkomórkową ekspresją czynnika transkrypcyjnego FoxP3 a powierzchniową niską ekspresją antygenu CD127 (IL-7R), dlatego też
można przyjąć, że komórki T regulatorowe mogą
prezentować fenotyp CD4+/CD25++/CD127low.
Jak dotąd najwięcej uwagi poświęcono badaniom limfocytów: CD4+CD25+, pomocniczych
typu 3 (Th3), regulatorowych typu 1 (Tr1) oraz limfocytów typu naturalnego zabójcy (NKT). Limfocyty CD4+CD25+ są identyfikowane przez ekspresję na powierzchni komórek łańcucha α receptora
interleukiny 2 (IL-2R) czyli CD25+ [3]. Badania
przeprowadzone na myszach dowiodły, że brak
tego receptora na limfocytach T prowadzi do zaburzeń w stabilności subpopulacji limfocytów T regulatorowych (Treg), co skutkuje rozwojem schorzeń autoimmunologicznych [4]. Badania in vitro
i in vivo ostatnich lat potwierdziły regulatorowe
działanie limfocytów CD4+CD25+, a tym samym –
ich kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej
[2]. Zasadniczy mechanizm supresyjnego działania
opiera się na ich bezpośrednim wpływie na komórkę docelową. Po pobudzeniu receptora limfocytów
T komórki CD4+CD25+ czynnie hamują proces aktywacji i proliferacji limfocytów CD4+ i CD8+ [5].
Bossowski A. i inni: Analiza komórek T regulatorowych we krwi obwodowej u dzieci i młodzieży z chorobą Gravesa–Basedowa...
Natomiast mechanizm pośredni polega na ich wpływie na komórki prezentujące antygen (np. dendrytyczne) oraz wytwarzaniu cytokin supresorowych,
takich jak: IL-10 czy TGF-β [5]. Ponadto zaobserwowano, że na limfocytach Tregs występuje
przejściowa ekspresja receptora z rodziny TNF-α
(cząsteczka CD134), który uczestniczy w kontrolowaniu liczebności oraz regulacji aktywności limfocytów T pomocniczych [6].
Znaczenie udziału limfocytów T regulatorowych
w patogenezie chorób autoimmunizacyjnych tarczycy u człowieka nie jest do końca poznane, a publikacje dotyczące dzieci są wręcz nieobecne w literaturze światowej. Wyniki niektórych badań in vitro oraz
pojedyncze doniesienia o próbach immunoterapii,
wpływających na funkcję limfocytów T regulatorowych, wskazują na ich istotną rolę w zaburzeniach
tolerancji immunologicznej na antygeny własne.
Jednoznacznie wykazano, że u zwierząt istnieje silny związek między utratą czynności limfocytów T
regulatorowych a występowaniem zapalenia tarczycy [7]. Badania przeprowadzone na myszach,
które w trzecim dniu życia pozbawiono grasicy, wykazały ich podatność na rozwój chorób autoimmunologicznych tarczycy, natomiast transfer limfocytów od zdrowych, dorosłych myszy zapobiegał ich
rozwojowi. Podanie zaś myszom puli limfocytów
niezawierających komórek CD4+CD25+ sprzyjało
autoimmunizacji, a obecność tych komórek prowadziła do zahamowania tego procesu [8].
Celem pracy była więc próba odpowiedzi na następujące pytania: 1. Czy w grupie osób młodych
z nowo zdiagnozowaną postacią choroby Gravesa–Basedowa oraz zapaleniem tarczycy typu Hashimoto dochodzi do zaburzeń liczby limfocytów
T regulatorowych w porównaniu z grupą dzieci
zdrowych? 2. Jak zachowują się proporcje limfocytów T regulatorowych w dynamice chorób autoimmunizacyjnych po zastosowaniu leczenia? 3. Czy
istnieją zależności pomiędzy stężeniem przeciwciał
przeciwtarczycowych i hormonów tarczycy a populacją komórek T (CD4+CD25high, CD4+ CD25+
CD127low i CD4+ FoxP3)?
Materiał i metody
Badaniem objęto 40 dzieci i młodzieży (8 chłopców i 32 dziewcząt) w wieku 8–19 lat (średni wiek
15,5 roku) z rozpoznanymi chorobami autoimmunizacyjnymi tarczycy (AITD): zapaleniem tarczycy typu Hashimoto n = 20 przed i w trakcie leczenia L-tyroksyną, chorobą Gravesa–Basedowa
n = 20 nowo rozpoznaną i w trakcie 3–6 mies. leczenia tyreostatykiem.
Rozpoznanie ustalono w oparciu o badania kliniczne, wyniki badań laboratoryjnych oraz ultrasonograficznych gruczołu tarczowego. U pacjentów
ze współistniejącymi guzkami dodatkowo przeprowadzono biopsję aspiracyjną cienkoigłową pod
kontrolą USG (BACC). W leczeniu nadczynności tarczycy zastosowano terapię metizolem, stosując początkowo 0,5–1,0 mg/kg/dobę (maks. do
30 mg/m2/dobę) łącznie z propranololem w dawce
0,5–1,0 mg/kg m.c./dobę. Po uzyskaniu klinicznej
eutyreozy dawki metizolu odpowiednio redukowano o 5–10 mg, dochodząc do dawki podtrzymującej
5–10 mg. Pacjenci z zapaleniem tarczycy typu Hashimoto otrzymywali leczenie wyłącznie L-tyroksyną (średnio 75 ± 25 μg/dobę) w okresie 6–12 miesięcy (średnio 8 miesięcy) od rozpoznania.
Funkcję gruczołu tarczowego oceniono na podstawie badania hormonalnego, które zostało przeprowadzone łącznie z oznaczeniem stężenia przeciwciał przeciwtarczycowych oraz z analizą
cytometryczną odsetka poszczególnych populacji
limfocytów T (CD4+CD25high, CD4+ CD25+
CD127low i CD4+ FoxP3) u pacjentów z nowo rozpoznanym zapaleniem tarczycy typu Hashimoto
(grupa C) oraz w trakcie 6–12 mies. leczenia L-tyroksyną (grupa D). Takie analizy przeprowadzono
także u dzieci ze świeżą nadczynnością tarczycy
(grupa A) przed rozpoczęciem leczenia metizolem,
a następnie powtórzono w okresie remisji kliniczno-biochemicznej po 3–6 miesiącach terapii (grupa
B). Wszyscy pacjenci spełniali następujące kryteria: • prawidłowa funkcja wątroby i nerek • w wywiadzie nie ustalono obecności chorób alergicznych
• nie stosowano leków antyarytmicznych z III grupy
według Williamsa (amiodaron) • w badaniu fizykalnym nie zaobserwowano cech infekcji.
Grupę dzieci badanych z autoimmunizacyjnymi
schorzeniami tarczycy porównano z grupą kontrolną
dzieci zdrowych z prawidłową czynnością gruczołu tarczowego, zgodną pod względem płci, wieku
i masy ciała oraz z ujemnym wywiadem w kierunku
chorób zapalnych, autoimmunologicznych i nowotworowych. Badania uzyskały zgodę lokalnej Komisji do Spraw Etyki Nadzoru nad Badaniami na
Ludziach i Zwierzętach przy UM w Białymstoku.
Metodyka dotycząca oceny stężenia przeciwciał
przeciwtarczycowych oraz hormonów tarczycy
Krew do badań pobierano na czczo w godzinach
rannych z żyły odłokciowej. Odwirowywano ją
39
Praca oryginalna
w wirówce przez 10 min. przy 2000 obrotów na
min. Do chwili zebrania odpowiedniej ilości surowic do oznaczeń przechowywano je w tem. -85°C.
W badanych surowicach oznaczano przeciwciała
antyperoksydazowe (anty-TPO), antytyreoglobulinowe (anty-TG) i anty-TSH receptorowi (TRAK)
za pomocą analizatora Modular Analytics E170
(moduł Elecsys) firmy Roche Diagnostics Polska,
metodą elektrochemiluminescencji ECLIA. Wartości prawidłowe stężeń przeciwciał wynosiły odpowiednio: anty-TPO 0–34 IU/mL, czułość metody
< 5,0 IU/ml; anty-TG 0–115 IU/mL, czułość metody < 10 IU/ml oraz anty-TSHR 0–1,75 IU/l, czułość
metody 0,3 IU/l.
Oznaczenie stężeń wolnej tyroksyny (fT4), wolnej trójjodotyroniny (fT3) i TSH w surowicy krwi
przeprowadzono za pomocą analizatora Cobas e
411 firmy Roche Diagnostics Polska, metodą elektrochemiluminescencji „ECLIA”. Wartości prawidłowe hormonów wynosiły odpowiednio: fT4
– 0,9–1,8 ng/dl, czułość metody 0,023 ng/dl; fT3
– 2,0–5,2 pg/ml, czułość metody 0,26 pg/mL oraz
TSH – 0,27–4,2 µIU/ml, czułość metody 0,005
µIU/mL.
Metodyka dotycząca analizy cytofluorometrycznej
detekcji komórek T regulatorowych
Krew do badań pobierano na czczo w godzinach
rannych z żyły odłokciowej. Próbki krwi pełnej (100
µl) z użyciem EDTA jako antykoagulantu poddano
inkubacji przez 30 min. w temperaturze pokojowej
z użyciem przeciwciał monoklonalnych znakowanych fluorochromem w objętości 20 µl [anti-CD4
FITC/PerCP (BD PharMingen), anti-CD25 PE-Cy5
(IL-2R, BD PharMingen), anti-CD127 PE (IL-7R,
Immunotech) oraz anti-FoxP3 PE lub Alexa Fluor 647 i odpowiadających im kontroli izotopowych (BD PharMingen)]. W celu dokonania lizy
erytrocytów próbki umieszczono na okres 5 min.
w roztworze BD FACSLysing Solution (BD Biosciences). Po dwukrotnym płukaniu komórki zostały utrwalone w roztworze CellFix (BD Biosciences). Dodatkowo przed barwieniem przeciwciałami anti-FoxP3 próbki zostały poddane trwającej 30
min. inkubacji w temperaturze pokojowej z buforem Permeabilizing Solution (BD Biosciences), po
której przeprowadzono dwukrotne płukanie komórek. Ocenę ekspresji markerów powierzchniowych
przeprowadzono za pomocą cytometru przepływowego FACSCalibur (BD Biosciences). Populację Tregs wyselekcjonowano na podstawie kombinacji charakterystycznych dla limfocytów cech
40
Endokrynol. Ped., 10/2011;1(34):37-48
morfotycznych (forward scatter, side scatter) oraz
wysokiej ekspresji CD4 i CD25 oraz niskiej ekspresji CD127 (komórki CD4+CD25+CD127-) (ryc. 1).
Wewnątrzkomórkową ekspresję FoxP3 oceniono po
ustawieniu bramki analizy na populacji limfocytów
CD4+ oraz CD4+CD25+ (ryc. 2). Analiza instrumentalna została przeprowadzona za pomocą oprogramowania CellQuest (BD Biosciences). Każdorazowo oceniano po 104 komórek. Wyniki podano jako
wartości odsetkowe lub wartość średniej intensywności fluorescencji (MFI, mean fluorescencje intensity). Czas od pobrania krwi do wykonania badań
morfologicznych i oznaczeń cytometrycznych nie
przekraczał 5 godzin.
Analiza statystyczna
Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej w oparciu o program Statistica 9.0 for Windows.
Wobec braku cech rozkładu normalnego wyniki
analizowano za pomocą testów nieparametrycznych. Porównania poszczególnych parametrów immunologicznych w grupach badanej i kontrolnej
dokonano za pomocą testu U Manna–Whitneya.
Za istotną statystycznie uznano wartość p < 0,05.
Do oceny siły współzależności między kolejnymi
parametrami zastosowano współczynniki korelacji
liniowej Persona i Spearmana.
Wyniki
W tabeli I przedstawiono charakterystykę pacjentów z chorobą Gravesa–Basedowa przed leczeniem (grupa A) i po 3–6-miesięcznej terapii metizolem (grupa B) oraz z nowo rozpoznanym zapaleniem tarczycy typu Hashimoto przed leczeniem
(grupa C) oraz w trakcie 6–12 mies. terapii L-tyroksyną (grupa D), a także grupy kontrolnej dzieci
zdrowych (grupa K). Wiek badanych i parametry
antropometryczne nie wykazywały różnic istotnych statystycznie. Rozpoznanie chorób autoimmunologicznych ustalono w oparciu o badanie kliniczne, wyniki badań laboratoryjnych oraz badanie
ultrasonograficzne gruczołu tarczowego, a w przypadku 6 pacjentów ze współistniejącymi zmianami
guzkowymi powyżej i równymi 10 mm dodatkowo
o biopsję aspiracyjną cienkoigłową (BACC), uzyskując we wszystkich przypadkach postać zmian
o charakterze łagodnym.
W poddanej ocenie subpopulacji limfocytów
T regulatorowych u pacjentów z nowo rozpoznaną chorobą Gravesa–Basedowa stwierdzono istotne statystycznie obniżenie odsetka limfocytów T
Bossowski A. i inni: Analiza komórek T regulatorowych we krwi obwodowej u dzieci i młodzieży z chorobą Gravesa–Basedowa...
Ryc. 1. Identyfikacja wybranych subpopulacji komórek T regulatorowych (Tregs) wyselekcjonowanych na podstawie
kombinacji charakterystycznych dla limfocytów cech morfotycznych (forward scatter, side scatter) oraz wysokiej ekspresji
CD4 i CD25 oraz niskiej ekspresji CD127 (komórki CD4+CD25+CD127-)
Fig. 1. Identification of chosen Treg cell subpopulations selected according to characteristic of morphological features for
lymphocytes (forward scatter, side scatter) and higher expression of CD4 and CD25 or low expression of CD127 (fenotype
CD4+CD25+CD127-)
41
Praca oryginalna
Endokrynol. Ped., 10/2011;1(34):37-48
Ryc. 2. Identyfikacja wewnątrzkomórkowej ekspresji czynnika transkrypcji FoxP3 na podstawie ustawienia bramki analizy na
populacji limfocytów CD4+ oraz CD4+CD25+
Fig. 2. Identification of intracellular expression of transcription factor FoxP3 due to gating of population of CD4 and
CD4+CD25+ T cells
CD4+FoxP3 (p < 0,007) i CD4+CD25high (p < 0,01)
w porównaniu do grupy kontrolną. Po 3–6 miesiącach terapii metizolem w stanie kliniczno-biochemicznej eutyreozy wartości odsetka powyższych
populacji komórek pozostawały nadal znamiennie
statystycznie obniżone (p < 0,001; p < 0,01) w stosunku do grupy kontrolnej. W przypadku pacjentów
z nowo rozpoznanym zapaleniem tarczycy typu Hashimoto obserwowano także niższe wartości odsetka
limfocytów Tregs, zarówno CD4+FoxP3 (p < 0,01),
jak i CD4+CD25high (p < 0,048) we krwi obwodowej w porównaniu do dzieci zdrowych (ryc. 3a, b).
Dodatkowo przeprowadzona ocena obu subpopulacji limfocytów Tregs w trakcie 6–12 mies. terapii
42
L-tyroksyną wykazała znamienny wzrost ich odsetka, który nie wykazywał znamiennych statystycznie różnic w wobec grupy kontrolnej. W odniesieniu do populacji limfocytów CD4+CD25+CD127low i CD4+CD25int nie obserwowano istotnych
statystycznie różnic w grupie pacjentów z autoimmunizacyjnymi chorobami tarczycy przed jak
i w trakcie stosowanej terapii w porównaniu do
dzieci zdrowych (ryc. 4).
W badanym przez nas materiale brano pod uwagę
zależności pomiędzy przeciwciałami przeciwtarczycowymi a odsetkiem poszczególnych subpopulacji limfocytów Tregs. U pacjentów z nieleczoną
chorobą Gravesa–Basedowa stwierdzono istotną
Bossowski A. i inni: Analiza komórek T regulatorowych we krwi obwodowej u dzieci i młodzieży z chorobą Gravesa–Basedowa...
Tabela 1. Dane pacjentów z chorobą Gravesa–Basedowa (GB) przed leczeniem metizolem (grupa A), po 3–6 miesiącach
terapii (grupa B), w nowo rozpoznanym zapaleniu tarczycy typu Hashimoto (HT) (grupa C) oraz HT po 6–12 miesiącach
terapii L-tyroksyną (grupa D) oraz w grupie kontrolnej dzieci zdrowych (grupa K)
Table 1. Data of patients with Graves’ disease [prior to methimazole treatment (group A), after 4–6 months of thyrostatic
therapy (group B)], with newly diagnosed Hashimoto’s thyroiditis (group C), with Hashimoto’s thyroiditis during 6–12
months of L-thyroxine therapy (group D) and healthy control subjects (group K)
Grupa A
– z nieleczoną
chorobą GB
Group A – with
untreated GD
(n = 20)
Wiek/Age
(lata/years)
BMI (kg/m²)
TSH(µIU/ml)
fT4 (ng/dl)
fT3 (pg/mL)
TRAb (U/l)
anti-ATG
(IU/ml)
anti-TPO
(IU/ml)
14.9 ± 6
15.36 ± 1.5
0.22 ± 0.07
2.48 ± 1.19
5.75 ± 2.24
10.67 ± 3.68
686.41 ± 85
352.57 ± 65
Grupa B – po
3–6 mc terapii
metizolem
Group B
– with GD after
3–6 months of
methimazole
treatment
(n = 12)
15.3 ± 6
18.93 ± 2
2.03 ± 0.29
1.24 ± 0.7
3.67 ± 0.6
5.12 ± 3.9
128.17 ± 46
166.73 ± 23
Grupa C –
z nieleczonym
HT
L-tyroksyną
Group C
– with HT
untreated with
L – thyroxine
(n = 20)
15.2 ± 3
20.69 ± 2.5
16.95 ± 1.25
1.06 ± 0.05
2.66 ± 0.41
0.54 ± 0.22
673 ± 43
265 ± 65
Grupa D z
HT leczona
L-tyroksyną
przez 6–12
mc
Group D
– with HT
treated with
L-thyroxine for
6–12 months
(n = 12)
15.8 ± 3
21.15 ± 3.5
Grupa K
– grupa
kontrolna
Group K
– healthy
controls
p*
p**
p***
p****
(n = 20)
15.4 ± 2
21.65 ± 3.8
NS*
NS**
NS***
NS****
p < 0.001*
NS**
NS***
NS****
1.77 ± 0.7
p < 0.001*
NS**
1.47 ± 0.87
p < 0.0001***
NS****
1.34 ± 0.1
p < 0.002*
NS**
1.17 ± 0.06
NS***
NS****
3.14 ± 0.29
p < 0.008*
NS**
3.5 ± 0.34
NS***
NS****
0.39 ± 0.12
p < 0.0001*
p < 0.001
0.71 ± 0.48
NS***
NS****
183.5 ±136
151.7 ± 55
21.07 ± 5.7
p < 0.0001*
p < 0.01**
p < 0.0001***
p < 0.013****
19.42 ± 3
p < 0.001*
p < 0.014**
p < 0.001***
p < 0.03****
43
Praca oryginalna
Endokrynol. Ped., 10/2011;1(34):37-48
p) istotność statystyczna pomiędzy poszczególnymi grupami
p) istotność statystyczna pomiędzy poszczególnymi grupami
Ryc. 3. Odsetek limfocytów o fenotypie CD4+FoxP3 (a) i CD4+CD25high (b) w badanych grupach dzieci
Fig. 3. Percentage of lymphocyte subpopulations CD4+FoxP3 (a) i CD4+CD25high (b) in examined groups
44
Bossowski A. i inni: Analiza komórek T regulatorowych we krwi obwodowej u dzieci i młodzieży z chorobą Gravesa–Basedowa...
Ryc. 4. Odsetek limfocytów o fenotypie CD4+CD25int oraz CD4+CD25+CD127low w badanych grupach dzieci
Fig. 4. Percentage of lymphocyte CD4+FoxP3 and CD4+CD25high subpopulations in examined groups
Ryc. 5. Krelacje zachodzące pomiędzy % limfocytów CD+25high a stężeniem p/ciał TRAb u pacjentów z nowo rozpoznaną
chorobą Gravesa–Basedowa
Fig. 5. Correlation between percentage of CD4+CD25high T cells and serum level of anti-thyroid receptor antibodies (antiTSH-R) in patients with untreated GD
45
Praca oryginalna
statystycznie ujemną korelację pomiędzy odsetkiem limfocytów T regulatorowych o fenotypie
CD4+CD25high we krwi obwodowej a stężeniem
p/ciał TRAb (r = -0,43, p < 0,03) (ryc. 5) oraz korelację dodatnią pomiędzy stężeniem TSH a odsetkiem
limfocytów Tregs CD4+FoxP3 (p < 0,01) i CD4
+CD25high (p < 0,05). Takich zależności w tej grupie nie obserwowano w odniesieniu do stężenia
hormonów tarczycy oraz do przeciwciał anty-TPO,
anty-TG. Poddana z kolei ocenie zależność stężenia przeciwciał przeciwtarczycowych i hormonów
tarczycy w odniesieniu do poszczególnych subpopulacji komórek Tregs (poza stwierdzoną w nieleczonym zapaleniu tarczycy typu Hashimoto ujemną korelacją pomiędzy stężeniem przeciwciał
anty-TPO a odsetkiem limfocytów CD4+CD25high;
r = -0,56, p < 0,03) nie wykazała istotnych korelacji
zarówno u pacjentów przed, jak i w trakcie leczenia
zapalenia tarczycy typu Hashimoto.
Dyskusja
Przebieg schorzeń autoimmunizacyjnych tarczycy wiąże się z napływem limfocytów do gruczołu
tarczowego oraz z dysregulacją układu odpornościowego, którą charakteryzuje powstawanie odpowiedzi na własne antygeny tarczycy (peroksydaza,
tyreoglobulina, receptory dla TSH oraz symporter Na+/I-) [9,10]. W ostatnich latach coraz większą rolę przypisuje się niewielkiej populacji limfocytów T o fenotypie CD4+CD25+FoxP3 (Tregs)
w regulacji funkcjonowania mechanizmów tolerancji obwodowej i zapobieganiu aktywacji autoreaktywnych limfocytów T. Niedobór liczby i/lub
upośledzenie funkcji tych komórek może stać się
przyczyną wzbudzenia reakcji autoimmunologicznej w związku z brakiem hamującego ich działania
w nadmiernej reakcji układu odpornościowego [7].
Obecnie trwają intensywne badania nad rolą komórek Tregs w patogenezie schorzeń autoimmunizacyjnych (cukrzycy typ 1, toczniu, łuszczycy, zapaleniu autoimmunizacyjnym wątroby) oraz miażdżycy,
niewiele jest jednak takich badań co do chorób tarczycy [11–14].
W naszych badaniach u dzieci z nowo rozpoznanymi schorzeniami autoimmunizacyjnymi tarczycy ocenialiśmy odsetek komórek T regulatorowych
oraz ekspresję czynnika transkrypcji FoxP3 w limfocytach T CD4. Wykazaliśmy istotne statystycznie
obniżenie odsetka limfocytów Tregs (poza populacjami CD4+CD25int i CD4+CD25++CD127-) w grupie badanej z nowo zdiagnozowanymi chorobami
46
Endokrynol. Ped., 10/2011;1(34):37-48
autoimmunizacyjnymi tarczycy w porównaniu do
grupy dzieci zdrowych. Podobnie Nakano i wsp.
odkryli, że odsetek komórek T regulatorowych
wśród wewnątrztarczycowych limfocytów był niższy u osób z autoimmunizacyjnymi chorobami tarczycy niż w zdrowej grupie kontrolnej. Komórki te
ulegały przyspieszonej apoptozie, co doprowadzało do rozwoju choroby [15]. W modelu zwierzęcym McLachlan i wsp. obserwowali rozwój zapalenia autoimmunizacyjnego tarczycy po usunięciu
limfocytów Tregs przy zastosowaniu przeciwciał
anty-CD25 i anty-CD122 [16]. Z kolei w badaniach
Marazuela i wsp. odnotowali wzrost liczby komórek T CD4+ wykazujących jednak zaburzoną ekspresję m.in. IL-10, TGF-β, genów dla czynników
transkrypcyjnych (FoxP3, STAT1, STAT3) oraz
genów krytycznych dla komórek Tregs (OX40,
4-1BB, ICOS, GITR, CTLA-4) wśród jednojądrzastych komórek krwi obwodowej pacjentów z AITD
w porównaniu z grupą kontrolną. Podobne komórki z zaburzoną ekspresją powyższych cząsteczek
infiltrowały tkankę tarczycową w zapaleniu typu
Hashimoto, co sugeruje niekompletną supresyjną funkcję komórek Tregs w tej grupie pacjentów.
Dodatkowo obserwowano zmieniony odsetek komórek wykazujących ekspresję genów typową dla
Tregs we krwi i gruczole tarczowym pacjentów
z chorobą Hashimoto [17]. Wyniki tych badań nasuwają wniosek, że komórki Tregs występujące
w ilości prawidłowej lub podwyższonej mają upośledzoną funkcję, co prowadzi do rozwoju chorób
autoimmunizacyjnych tarczycy [17]. Wydaje się
prawdopodobny także fakt, że dochodzi do opóźnienia pojawienia się Tregs w miejscu toczącego się
już procesu immunologicznego [18]. W naszych badaniach u dzieci i młodzieży z nowo rozpoznanymi chorobami autoimmunizacyjnymi tarczycy obserwowaliśmy zmniejszenie odsetka limfocytów
CD4 z ekspresją czynnika FoxP3. Uznano, że Tregs
dzięki swym właściwościom odgrywają istotną rolę
w utrzymaniu tolerancji immunologicznej, chronią
przed wystąpieniem zaburzeń autoimmunologicznych bądź prowadzą do ich remisji (u ciężarnych
z chorobą Gravesa–Basedowa), jak również mogą
hamować odpowiedź limfocytów T na antygeny
egzogenne [19]. Zdecydowanym potwierdzeniem
tej hipotezy i wskazaniem roli limfocytów Tregs
w patogenezie chorób autoimmunizacyjnych tarczycy jest fakt uzyskania w naszych badaniach
istotnie statystycznej ujemnej korelacji, zachodzącej pomiędzy odsetkiem komórek Tregs o fenotypie CD4+CD25high a stężeniem przeciwciał przeciw
Bossowski A. i inni: Analiza komórek T regulatorowych we krwi obwodowej u dzieci i młodzieży z chorobą Gravesa–Basedowa...
receptorowi TSH (anty-TSHR) w grupie pacjentów
z nowo rozpoznaną chorobą Gravesa–Basedowa
oraz ujemnej z przeciwciałami anty-TPO u pacjentów z nieleczonym zapaleniem tarczycy typu Hashimoto. Zrozumienie zatem regulacji procesu immunologicznego na poziomie molekularnym może
przyczynić się nie tylko do lepszego poznania patogenezy schorzeń autoimmunizacyjnych tarczycy,
ale także stwarza nowe możliwości diagnostyczne
i prognostyczne.
Zastosowanie w terapii metizolu, którego rola
immunomodulująca była podkreślana przez Weetmana i wsp. w związku ze stabilizacją śródbłonka naczyń oraz błon komórkowych tyreocytów w odniesieniu do uwalniania przez nie cytokin, doprowadza
do normalizacji zaburzeń dystrybucji limfocytów
CD4/CD8 po uzyskaniu kliniczno-biochemicznej
eutyreozy [20]. W naszych badaniach wprowadzenie w leczeniu nadczynności tarczycy metizolu nie
doprowadzało do normalizacji odsetka limfocytów
Tregs o fenotypie CD4+FoxP3 i CD4+CD25high,
co mogło być prawdopodobnie związane ze zbyt
krótkim okresem (3–6 mies.) obserwacji w trakcie
leczenia tyreostatykiem oraz utrzymującym się
podwyższonym stężeniem przeciwciał przeciwtarczycowych. Znamienne zaś obniżenie odsetka
limfocytów Tregs o fenotypie CD4+FoxP3 i CD4
+CD25high na początku procesu chorobowego wskazywać może na potrzebę wprowadzenia bardziej
agresywnej terapii w leczeniu choroby Gravesa–Basedowa, a także na konieczność jej wydłużenia ponad standardowy okres 2–3 lat. Dalsze badania nad rolą komórek Tregs są niezwykle potrzebne
wobec coraz większej ilości publikacji dotyczących
wykorzystania ich w immunoterapii np. w cukrzycy
typu 1 [21]. W przyszłości będzie to być może nowa
droga w terapii procesów autoimmunologicznych,
w tym choroby Gravesa–Basedowa, w związku
z ograniczeniem napływu komórek immunokompetentnych do objętego procesem zapalnym gruczołu
tarczowego. Obecnie w badaniach doświadczalnych na zwierzętach znane są pojedyncze doniesienia wskazujące na możliwość zastosowania komórek Tregs w leczeniu autoimmunizacyjnych chorób
tarczycy [22].
Podsumowując można stwierdzić, że zmniejszenie odsetka subpopulacji limfocytów Tregs o fenotypie CD4+FoxP3 i CD4+CD25high we krwi obwodowej jest odpowiedzialne za utratę tolerancji
immunologicznej i w konsekwencji rozwój schorzeń autoimmunizacyjnych tarczycy wieku rozwojowego.
PIŚMIENNICTWO/REFERENCES
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
Brown R.S.: Autoimmune thyroid disease: unlocking a complex puzzle. Curr Opin Pediatr., 2009:26, 1-7.
Holm T., Nielsen J., Claesson M.: CD4CD25 regulatory T cells: Phenotype and physiology. APMIS, 2004:112, 629-641.
Baecher-Allan C., Viglietta V., Hafler D.A.: Human CD4+CD25+ regulatory T cells. Semin. Immunol., 2004:16, 89-98.
Antony P.A., Restifo N.P.: CD4+CD25+ T regulatory cells, immunotherapy of cancer and interleukine 2. J. Immunother., 2005:28,
120-128.
Boehmer von H.: Mechanisms of suppression by suppressor T cells. Nature Immunology, 2005:5, 338-344.
So T. et al.: Immune regulation and control of regulatory T cells by OX40 and 4-1BB. Cytokine Growth Factor Rev., 2008:19, 253562.
Lan R., Ansarib A., Liana Z. et al.: Regulatory T cells: Development, function and role in autoimmunity. Autoimmunity Rev., 2005:4,
351-363.
Mason D., Powrie F.: Control of immune pathology by regulatory T cells. Curr. Opin. Immunol.,1998, 6, 649-655.
Brand O.J., Gough S.C.: Genetics of thyroid autoimmunity and the role of the TSHR. Mol Cell Endocrinol., 2010 Jun 30:322(1-2),
135-143.
Weetman A.P.: The genetics of autoimmune thyroid disease. Horm. Metab. Res., 2009:41(6), 421-425.
Longhi M.S., Meda F., Wang P., Samyn M. et al.: Expansion and De Novo Generation of Potentially Therapeutic Regulatory T Cells in
Patients with Autoimmune Hepatitis. Hepatology, 2008:47, 581-591.
Atfy M., Amr G.E., Elnaggar A.M. et al.: Impact of CD4+CD25high regulatory T-cells and FoxP3 expression in the peripheral blood
of patients with systemic lupus erythematosus. Egypt J. Immunol., 2009:16(1), 117-126.
Chentoufi A.A., Binder N.R., Berka N. et al.: Advances in type I diabetes associated tolerance mechanisms. Scand. J. Immunol.,
2008 Jul:68(1), 1-11.
Ait-Oufella H., Taleb S., Mallat Z., Tedgui A.: Cytokine network and T cell immunity in atherosclerosis. Semin. Immunopathol., 2009
Jun:31(1), 23-33.
Nakano A., Watanabe M., Iida T. et al.: Apoptosis-induced decrease of intrathyroidal CD4(+)CD25(+) regulatory T cells in autoimmune thyroid diseases. Thyroid, 2007:17, 25-31.
47
Praca oryginalna
Endokrynol. Ped., 10/2011;1(34):37-48
[16] McLachlan S.M., Nagayama Y., Pichurin P.N., Mizutori Y. et al.: The link between Graves’ disease and Hashimoto’s thyroiditis: a role
for regulatory T cells. Endocrinology, 2007 Dec:148(12), 5724-5733.
[17] Marazuela M., Garcia-Lopez M.A., Figueroa-Vega N. et al.: Regulatory T cells in human autoimmune thyroid disease. 2006, J. Clin.
Endocrinol. Metab., 2006:91, 3639-3646.
[18] Feunou P., Paulin L., Habran C. et al.: CD4+CD25+ and CD4+CD25- T cells act respectively as inducer and effector T suppressor
cells in superantigen-induced tolerance. J. Immunol., 2003:171, 3475-3484.
[19] Weetman A.P.: Immunity, thyroid function and pregnancy: molecular mechanisms. Nat. Rev. Endocrinol., 2010:6(6), 311-318.
[20] Weetman A.P., Tandon N., Morgan B.P.: Antithyroid drugs and release of inflammatory mediators by complement-attracted thyroid
cells. Lancet, 1992:340, 633.
[21] Gagliani N., Ferraro A., Roncarolo M.G., Battaglia M.: Autoimmune diabetic patients undergoing allogeneic islet transplantation: are
we ready for a regulatory T-cell therapy? Immunol. Lett., 2009 Dec 2:127(1), 1-7.
[22] Morris G.P., Brown N.K., Kong Y.C.: Naturally-existing CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells are required for tolerance to
experimental autoimmune thyroiditis induced by either exogenous or endogenous autoantigen. J. Autoimmun., 2009 Aug:33(1),
68-76.
48