Streszczenie

Streszczenie
Pochodzące z grasicy, naturalne limfocyty T regulatorowe (tTregs, thymusderived regulatory T cells, lub nTregs, natural regulatory T cells), charakteryzujące
się fenotypem CD4+CD25+Foxp3+, mają istotne znaczenie dla działania układu
odpornościowego ze względu na ich zdolność do hamowania fizjologicznej i
patologicznej odpowiedzi immunologicznej oraz kontrolowania odpowiedzi na
antygeny własne. Z tego powodu Tregs pochodzące z grasicy odgrywają kluczową
rolę w utrzymaniu tolerancji na antygeny własne i homeostazy układu
odpornościowego. Limfocyty te powstają w grasicy, po czym migrują do
obwodowych narządów limfoidalnych, gdzie podejmują swoje funkcje. Ich rozwój i
aktywacja zależą od interakcji z komórkami prezentującymi antygen (APCs, antigenpresenting cells), głównie komórkami dendrytycznymi (DCs, dendritic cells). Rolę
APC mogą pełnić również limfocyty B ze względu na powierzchniową ekspresję
MHC II i zdolność do pobierania, przetwarzania i prezentacji antygenów limfocytom
T CD4+.
Celem badań przedstawionych w tej dysertacji była ocena zdolności mysich
limfocytów B użytych w roli komórek prezentujących antygen do indukowania
rozwoju Treg pochodzenia grasiczego w modelu in vitro, w którym wykorzystano
opracowany na podstawie wcześniejszych badań model hodowli całej populacji
tymocytów, zawierającej również komórki prekursorowe Treg, z limfocytami B
izolowanymi ze śledziony. Znając rolę, jaką pełnią komórki dendrytyczne
w
różnicowaniu regulatorowych limfocytów T o fenotypie CD4+CD25+Foxp3+ w
obwodowych narządach limfoidalnych i w grasicy, zbadano rolę MHC II i cząsteczek
kostymulatorowych (CD80, CD86, CD40) aktywowanych limfocytów B na
generowanie Treg pochodzenia grasiczego. W celu aktywacji limfocytów B przez
receptory
TLR7
i
TLR4
zastosowano
imikwimod
(IMQ,
Imiquimod)
i
lipopolisacharyd (LPS). W grasicy naturalnie występuje niewielka populacja
limfocytów B, której rola w rozwoju tymocytów, a szczególnie limfocytów T
regulatorowych jest mało znana. W niniejszej dysertacji przedstawiono wstępną
analizę roli grasiczych limfocytów B w rozwoju nTreg. Ponadto, zbadano rolę
glukokortykoidów uznawanych za czynnik selekcyjny w powstawaniu limfocytów T
CD4+CD25+Foxp3+
w
warunkach
hodowli
zastosowanych
w
badaniach.
Powszechnie uważa się, że glukokortykoidy, charakteryzujące się silnym działaniem
immunosupresyjnym, hamują dojrzewanie komórek dendrytycznych, prezentujących
antygen zmniejszając ekspresję MHC II i cząsteczek kostymulatorowych, co w
konsekwencji prowadzi do stanu, w którym komórki te częściej indukują tolerancję na
antygeny. W badaniach zastosowano syntetyczny glukokortykoid, deksametazon
(Dex, dexamethasone).
Wyniki badań prezentowanych w dysertacji podzielone zostały na trzy części:
pierwsza część dotyczy roli śledzionowych limfocytów B w rozwoju Treg
pochodzących z grasicy, w drugiej przedstawiono wstępne wyniki dotyczące roli
grasiczych limfocytów B w generowaniu nTreg, a w trzeciej opisano wpływ Dex na
powstawanie nTreg w hodowli tymocytów z limfocytami B śledziony. Wyniki badań
prezentowanych w pierwszej części wskazują na zwiększenie odsetka limfocytów B
śledziony wykazujących ekspresję MHC II i cząsteczek kostymulatorowych (CD80,
CD86, CD40) pod wpływem aktywacji. Jednocześnie zwiększeniu ulega ekspresja
większości tych białek. W hodowli tymocytów z limfocytami B obserwowano zmianę
rozkładu głównych populacji tymocytów, dotyczącą przede wszystkim tymocytów
DN CD4–CD8– i DP CD4+CD8+ z małymi różnicami w odsetkach SP CD4+CD8– i
CD8+CD4– niezależnie od stosunku tymocytów do limfocytów B i aktywacji
limfocytów B. W środowisku hodowli tymocytów i limfocytów B śledziony
wykazano zwiększenie odsetka tymocytów SP CD4+Foxp3+. Zjawisko to zależne
było od aktywacji limfocytów B i stosunku tymocytów do limfocytów B w hodowli.
Wykazano, że limfocyty B śledziony mają zdolność to generowania regulatorowych
limfocytów T pochodzenia grasiczego in vitro zależnie od siły sygnałów
kostymulatorowych przekazywanych różnicującym się tymocytom. Ponadto, w
środowisku aktywowanych limfocytów B śledziony obserwowano zwiększenie
ekspresji
czynnika
transkrypcyjnego
Foxp3
w
powstałych
limfocytach
T
regulatorowych. Wykazano, że izolowane z hodowli in vitro tymocyty o fenotypie
CD4+CD25+Foxp3+ wykazują aktywność supresorową w teście hamowania
proliferacji aktywowanych docelowych limfocytów T CD4+. Blokowanie cząsteczek
kostymulatorowych i MHC II na limfocytach B wykazało, że CD80/CD86 są
skuteczniejsze niż CD40 w procesie generowania nTreg przez limfocyty B, co
wskazuje na większe zaangażowanie w ten proces interakcji cząsteczek CD80/CD86 z
CD28 niż CD40/CD40L.
Rola grasiczych limfocytów B w powstawaniu nTreg in vitro została
zaprezentowana w drugiej części rozprawy. Wyniki 72-godzinnej hodowli wskazują,
że aktywowane grasicze limfocyty B utrzymują populację nTreg niezależnie od
zastosowanego aktywatora (LPS lub IMQ) i przeciwdziałają zmniejszeniu odsetka
nTreg, który obserwowano w hodowli niestymulowanej aktywatorami. Wyniki badań
pokazują, że grasicze i śledzionowe limfocyty B różnią się od siebie pod względem
właściwości po aktywacji i ich roli w indukowaniu rozwoju Treg. Dodatkowo,
aktywacja limfocytów B występujących naturalnie w grasicy przez LPS lub IMQ
powoduje 2-3-krotne zwiększenie liczby grasiczych limfocytów B po 72 godzinach
hodowli w porównaniu z hodowlą 24-godzinną. Te obserwacje pozwalają nam
wnioskować, że grasicze limfocyty B wpływają na utrzymanie żywotności lub
powstawanie nTreg w sposób zależny od aktywacji limfocytów B i ich proporcji w
stosunku do tymocytów. Dodatkowo, interakcja aktywowanych limfocytów B grasicy
z tymocytami skutkowała zwiększeniem ekspresji Foxp3 tymocytów o fenotypie SP
CD4+Foxp3+.
Celem badań prezentowanych w trzeciej części dysertacji było zbadanie
zdolności deksametazonu do zwiększenia tolerogenności limfocytów B i w rezultacie
do wzrostu odsetka powstających w hodowli nTreg. Przedstawione wyniki wskazują,
że w warunkach hodowli limfocytów B śledziony i tymocytów deksametazon nie
wykazuje aktywności czynnika selekcyjnego w powstawaniu nTreg.