Ćwiczenia 2 immunopatologia - patoimmunologia

Ćwiczenia 2 immunopatologia.doc
(67 KB) Pobierz
Identyfikacja subpopulacji limfocytów przy użyciu Ab
monoklonalnych – metoda immunofluorescencja
Badanie immunologiczne
Badanie układu immunologicznego ↔ Badanie przy użyciu różnych metod immunologicznych
1.Ocena strukturalna (ilościowa)
- elementy komórkowe:
profil immunologiczny: bezwzględna/odsetkowa zawartość poszczególnych populacji i
subpopulacji komórek immunokompetentnych
→ izolacja komórek; ocena antygenów błonowych i wewnątrzkomórkowych
-elementy humoralne: obecność/stężenie:
Ig
składniki dopełniacza
białka ostrej fazy
cytokiny
inne: białka, enzymy, kwasy nukleinowe
- inne:
badania genetyczne
typowanie HLA
identyfikacja mutacji
transgeniczne mysz (WT, KO)
2. Ocena czynnościowa
-elementy komórkowe:
testy aktywacji
testy transformacji blastycznej limfocytów
ocena proliferacji limfocytów (3H-tymidyna, BrdU, CFSE)
testy produkcji Ab
ekspresja receptorów/CD/inne
pomiar stężenia/kinetyki cytokin
ocena funkcji cytotoksycznej (Tc, NK)
ocena funkcji fagocytarnych, chemotaktycznych (granulocyty,
makrofagi)
testy degranulacji monocytów, bazofilów
ocena syntezy DNA, mRNA, białka
- elementy humoralne:
ocena aktywności dopełniacza
ocena swoistości Ab
Metody immunologiczne
Oparte na reakcjach nie/swoistych


Ag – Ab (wykrywanie sAg lub sAb)
Ag – MHC – TCR (wykrywanie sAg lub swoistych limfocytów T)


Ag – BCR
aktywacja poliklonalna limfocytów T/B
Identyfikacja elementów komórkowych
1. Pochodzenie komórek/tkanek
2. Dojrzałość komórek
3. Funkcje komórek
4. Aktywność komórek
Obecność +/- oraz rozmieszczenie w badanym materiału danych Ag/markerów
Metody (ilościowe i jakościowe)
Metody immunomorfologiczne
→ wykrywanie i lokalizacja Ag

składników komórek (immunocytochemia)

składników tkanek (immunohistochemia)
na zasadzie reakcji Ab – Ag
→ znaczniki przeciwciał:

fluorochromy (metody immunofluorescencyjne IMF)

enzymy (metody immunoenzymatyczne)


metale ciężkie (Au)
pierwiastki promieniotwórcze (metody radioizotopowe)
Przygotowanie materiału do badań immunomorfologicznych

niedopuszczenie do wypłukania lub przemieszczenia antygenu


zachowanie właściwości wiązania przeciwciał
utrzymanie ogólnej struktury komórki lub tkanki
Metoda immunofluorescencyjna (IMF)
możliwość wykonania badania:
→ komórki żywe, nieutrwalone
→ komórki i tkanki utrwalone (rozmazy, preparaty
cytospinowe, skrawki kriostatowe, parafinowe odciski)
odczyt:
mikroskop – ocena jakościowa i półilościowa
cystometria przepływowa – ocena ilościowa

identyfikacja antygenów wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych
 określenie topografii antygenów w strukturach histologicznych
→ przeciwciała monoklonalne wykrywające pojedyncze determinanty antygenowe
Reakcje bezpośrednie i pośrednie
Reakcje dwubarwne
→ odczynniki znakowane fluorochromami o różnych kolorach fluorescencji; stosowane
sekwencyjnie lub jednocześnie w mieszaninie
Stosowane fluorochromy:


FITC – izotiocyjanian fluoresceiny (525 nm)
TRITC – izotiocyjanian tetrametylorodaminianu (600 nm)

Alexa fluor (345-680 nm)

PE – fikoerytyna (488 nm)

PerCP
Zróżnicowanie komórek izolowanych z krwi obwodowej możliwe jest dzięki zastosowaniu
przeciwciał monoklonalnych, skierowanych przeciwko obecnym na powierzchni komórek
antygenom leukocytarnym CD.
Klasyfikacja CD
- markery głównych linii komórkowych
- markery dojrzewania
- markery aktywacji
Immunofenotyp
Charakterystyczny zbiorów antygenów, stanowiących elementy różnych struktur komórkowych,
związany z jej różnicowaniem, dojrzewaniem, funkcją uwarunkowany przez genotyp (zestaw genów
jądra komórkowego) i środowisko.
Podstawowe markery do fenotypowania
CD45
marker wszystkich leukocytów
CD3, CD7
marker limfocytów T
CD4
marker limfocytów Th
CD8
marker limfocytów Tc
CD19, CD20
CD56, CD16
CD25
marker limfocytów B
komórki NK
marker aktywacji limfocytów
Profil immunologiczny – fenotypy krwi obwodowej dorosłej osoby zdrowej – wartość
względna i bezwzględna
populacja
komórek
CD
odsetek
limfocytów (%)
ilość
komórek/µl
Limfocyty T
CD3+
60-70
690-2540
Limfocyty Th
CD3+ CD4+
35-55
410-1590
Limfocyty Tc
CD3+ CD8+
20-35
190-1140
Limfocyty B
CD19+ CD20+
15-20
90-660
Komórki NK
CD56+ CD16+
10-20 (30)
90-560
Wskaźnik CD4/CD8
1,74 ± 0,7 (średnio 1,5-1,7)
Obecnie subpopulacje limfocytów T wyodrębnia się na podstawie funkcji, a nie na
podstawie ekspresji cząsteczek CD4 i CD8 !!!
- 90% limfocytów Th posiada CD4 na swojej powierzchni i wiąże się z MHC klasy II
- ponad 90% limfocytów Tc posiada CD8 i rozpoznaje MHC klasy I
- ale istnieją też limfocyty Tc CD4+ i limfocyty Th CD8+
Fenotyp limfocytów T
Th1
Th2
INF-γ
IL-4,IL-5, IL-9, IL-13
Th17
IL-17, IL-22
Treg
IL-10,TGF-β
Cytometria przepływowa
↓
Immunofenotypowanie
identyfikacja antygenów, różnicowanie i określenie wartości liczbowych różnych subpopilacji
krwinek białych w przebiegu zespołów limfoproliferacyjnych.
Przeciwciała monoklonalne



Homogeniczna populacja cząsteczek Ab
Jeden klon – identyczne łańcuchy ciężkie i lekkie
Jeden klon – swoisty względem tego samego epitopu i wiąże się do niego z takim samym
powinowactwem


Przeciwciała monoklonalne mają identyczny izotyp, allotyp i idiotyp
Standardowe odczynniki stosowane w badaniach naukowych i praktyce klinicznej
(diagnostyka i leczenie)
Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych
1. immunizacja zwierzęcia (podanie antygenu)
2. izolacja komórek plazmatycznych, produkujących przeciwciała
3. fuzja komórek plazmatycznych z komórkami nowotworowymi (np. komórkami szpiczaka,
niewytwarzającymi Ab)
4. powstają nieśmiertelne hybrydy, syntetyzujące homogenne, swoiste przeciwciała
5. selekcja klonów przeciwciał
6. hodowla wybranego klonu komórek hybrydowych, z której otrzymuje s...
Plik z chomika:
depeche_89
Inne pliki z tego folderu:
 16.docx (19 KB)
2.2b.4a.char ukł odp.docx (56 KB)
 4a.11fg.12immunologia punkt 5.doc (649 KB)
 4bc.11g.PROCES FAGOCYTOZY.doc (69 KB)
4f.6.7.10.11c.Cząsteczki w układzie odpornościowym.docx (37 KB)


Inne foldery tego chomika:

Atlas hemat
chemia
Dobosz
 Farmakologia
Hematologia wyklady



Zgłoś jeśli naruszono regulamin





Strona główna
Aktualności
Kontakt
Dział Pomocy
Opinie


Regulamin serwisu
Polityka prywatności
Copyright © 2012 Chomikuj.pl