Autoreferat - Instytut Botaniki PAN
advertisement
Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 Autoreferat I. Dane osobowe 1. Imię i nazwisko: Joanna Augustynowicz 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne – z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania: mgr biologii, Instytut Biologii Molekularnej (obecnie Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii), Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Jagielloński, czerwiec 1995; promotor prof. dr hab. Halina Gabryś; studia ukończone z wyróżnieniem; czerwiec 1995 dr nauk biologicznych w zakresie biologii, specjalność fizjologia roślin, Instytut Biologii Molekularnej (obecnie Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii), Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Jagielloński; promotor prof. dr hab. Halina Gabryś; grudzień 2000 3. Informacje o artystycznych: dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/ październik 1995 – wrzesień 2000 doktorantka, Zakład Fizjologii i Biochemii Roślin, Instytut Biologii Molekularnej, Uniwersytet Jagielloński wrzesień 1999 – styczeń 2000 asystent, Zakład Fizjologii i Biochemii Roślin, Instytut Biologii Molekularnej, Uniwersytet Jagielloński styczeń 2001 – wrzesień 2010 adiunkt, Zakład (dawniej Katedra) Biochemii, Wydział Ogrodniczy, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie od października 2010 adiunkt, Zakład Botaniki i Fizjologii Roślin, Instytut Biologii Roślin i Biotechnologii (poprzednia nazwa: Katedra Botaniki i Fizjologii Roślin), Wydział Ogrodniczy, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie W latach 2001-2002 oraz 2006-2007 przebywałam na urlopach macierzyńskich i wychowawczym (łącznie ok. 2 lata). II. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.) 1 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 * w przypadku, gdy osiągnięciem tym jest praca/ prace wspólne, należy przedstawić oświadczenia wszystkich jej współautorów, określające indywidualny wkład każdego z nich w jej powstanie A) Tytuł osiągnięcia naukowego/artystycznego. Jako osiągnięcie wynikające z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.), wskazuję jednotematyczny cykl czterech publikacji, zatytułowany: „Fitoremediacja związków metali ciężkich przez Callitriche cophocarpa, ze szczególnym uwzględnieniem chromu” B) Autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa. Oświadczenia współautorów publikacji znajdują się w załączniku 3. Opis mojego udziału, w tym procentowego, w wykonaniu poniższych prac zawiera załącznik 4, p. I B. Kopie prac zostały zebrane w załączniku 5. P1. Augustynowicz J.*, Kyzioł-Komosińska J., Smoleń S., Waloszek A. (2013) Study on Cr binding capacity of Callitriche cophocarpa in an aquatic environment. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 64 (3): 410–418 IF 2012 2,012, 25 pkt MNiSW P2. Augustynowicz J.*, Kołton A., Baran A., Kostecka-Gugała A., Lasek W. (2013) Strategy of Cr detoxification by Callitriche cophocarpa. Central European Journal of Chemistry: 11 (2): 295–303 IF 2012 1,167, 25 pkt MNiSW P3. Augustynowicz J. *, Wróbel P., Płachno B., Tylko G., Gajewski Z., Węgrzynek D. (2014) Chromium distribution in shoots of aquatic phytoremediator Callitriche cophocarpa Sendtn. Planta DOI: 10.1007/s00425-014-2047-9 IF 2012 3,347, 40 pkt MNiSW P4. Augustynowicz J.*, Tokarz K., Baran A., Płachno B. (2014) Phytoremediation of water polluted by thallium, cadmium, zinc, and lead with the use of macrophyte Callitriche cophocarpa. Archives of Environmental Contamination and Toxicology 66: 572–581 IF 2012 2,012, 25 pkt MNiSW * autor korespondencyjny sumarycznie: IF 8,536, 115 pkt MNiSW 2 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 C) Omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Cel i zakres badań Jako nadrzędny cel publikacji stanowiących osiągnięcie naukowe będące podstawą postępowania habilitacyjnego postawiłam sobie zbadanie zdolności Callitriche cophocarpa (rzęśli długoszyjkowej) do fitoremediacji związków Cr(VI) oraz Cr(III) w wodach. Ponadto, chciałam również ocenić zdolności badanego gatunku do fitoekstrakcji innych związków metali ciężkich: ekstremalnie toksycznych związków Tl i Cd, a także Zn i Pb. Przeprowadzone przeze mnie eksperymenty miały charakter interdyscyplinarny, wpisujący się w ważną dyscyplinę naukową – biotechnologię środowiska. U podstaw tej dziedziny nauki leżą jednak badania podstawowe, obejmujące analizę procesów biologicznych, w tym potencjału metabolicznego żywych organizmów, w kontekście remediacji zdegradowanego środowiska. Badaniom tym poświęciłam niniejszy cykl publikacji. Wytypowałam do nich roślinę wodną, szeroko rozprzestrzenioną w klimacie umiarkowanym na świecie, stąd też prezentowane wyniki mogą mieć znaczenie globalne. Fitoremediacja należy do tzw. „zielonych technologii”, a prace z tego zakresu wpisują się w aktualne trendy naukowe w Polsce i na świecie. Analizy potencjału fitoremediacyjnego Callitriche cophocarpa w stosunku do Cr(VI), Cr(III), Tl, Cd, Zn i Pb nie były nigdy dotychczas prowadzone. Wprowadzenie – osadzenie tematyki w kontekście badań nad fitoremediacją wód z zanieczyszczeń związkami metali ciężkich Prace nad fitoremediacją, z wykorzystaniem wodnych roślin naczyniowych (makrofitów), rozpoczęłam na przełomie 2005 i 2006 roku, pracując jako adiunkt w Katedrze Biochemii Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie, w zespole kierowanym przez prof. Henryka Kołoczka. Zespół ten zajmował się biotechnologią środowiska, głównie w odniesieniu do mikroorganizmów. Ponadto jednak, prowadził modelowe badania nad komórkowymi mechanizmami transportu chromianów przez rośliny wodne (Spirodela polyrhiza). W ramach prac zespołu podjęłam się wówczas zadania badawczego – izolacji protoplastów Spirodela polyrhiza. Wykorzystanie protoplastów Spirodela miało być kontynuacją badań, których wyniki zostały w 2005 roku opublikowane przez członków zespołu, dr hab. Pawła Kaszyckiego i wsp., w Plant, Cell & Environment. Mój udział w realizacji tego tematu miał być związany z posiadanym przeze mnie doświadczeniem w pracy z kulturami in vitro, w tym także z izolacją i regeneracją protoplastów. Niestety, wydajna protoplastyzacja Spirodela nie powiodła się. Dlatego też postanowiłam znaleźć inny model, taki gatunek rośliny wodnej, z którego udałoby mi się otrzymać protoplasty z odpowiednio wysoką wydajnością. Jako dodatkowe kryterium przyjęłam wówczas jeszcze jeden warunek, otóż starałam się również, aby model roślinny miał znaczenie fitoremediacyjne. Niestety, pomimo prób, żaden z wyselekcjowanych przeze mnie i przebadanych gatunków (z rodzajów: Bacopa, Ceratophyllum, Elodea, Hydrilla, Lemna, Vallisneria), mających potwierdzone literaturowo znaczenie w fitoremediacji wód, nie ulegał wydajnej protoplastyzacji. 3 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 W związku z tym, nie mógł być wykorzystany do naszych modelowych badań. Jednak, w czasie poszukiwań wspomnianego modelu, natrafiłam w rzece Szreniawie (Małopolska: 50°14’ N/20°04’ E) na Callitriche sp. Gatunek Callitriche cophocarpa, czyli rzęśl długoszyjkowa, został zidentyfikowany na moją prośbę przez prof. Krzysztofa Szoszkiewicza (Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu), zajmującego się ekologią rodzaju Callitriche w Polsce. Roślina ulegała stosunkowo łatwej protoplastyzacji. Natomiast, jak się okazało później, nie była znana pod kątem zastosowań biotechnologicznych. Od roku 2008 rozpoczęłam zatem intensywne prace nad potencjalnym wykorzystaniem rzęśli długoszyjkowej w fitoremediacji wód, przesuwając na dalszy plan modelowe badania nad transportem chromianów w protoplastach. Omówione w prezentowanym cyklu publikacji badania stały się możliwe dzięki odkryciu przeze mnie nieznanego dotychczas, niezwykłego potencjału bioremediacyjnego Callitriche cophocarpa. Od roku 2000 w Unii Europejskiej obowiązuje tzw. Ramowa Dyrektywa Wodna (RDW), której głównym celem jest zapewnienie ochrony wód oraz osiągnięcie ich dobrego stanu ekologicznego i czystości chemicznej do roku 2015. Cele RDW realizowane są, między innymi, poprzez oczyszczanie systemów wodnych w warunkach skażenia (in situ). W oczyszczaniu środowiska alternatywą dla metod fizykochemicznych są metody biologiczne, ogólnie noszące nazwę bioremediacji. Termin bioremediacja jest pojęciem zawężonym niekiedy do aktywności mikroorganizmów. Natomiast fitoremediacja to wykorzystanie roślin do usuwania zanieczyszczeń wody, gleby i powietrza i/lub przemiany tych zanieczyszczeń w formy mniej szkodliwe. Rośliny są zdolne do pobierania zanieczyszczeń metalicznych i ich transferu do organów nadziemnych (fitoekstrakcja), a w przypadku pewnych gatunków do znacznej ich akumulacji (fitoakumulacja). Rośliny mogą też wydzielać na zewnątrz tak zwane eksudaty (np. aminokwasy, kwasy organiczne), które przyczyniają się do obniżenia dostępności toksycznego związku (fitostabilizacja). Związki metali ciężkich, w przeciwieństwie do zanieczyszczeń organicznych, nie ulegają degradacji. Dlatego tak ważne jest opanowanie sposobów ich usuwania. Fitoekstrakcja/fitoakumulacja metali w naturalnych systemach wodnych, dokonywana w oparciu o wodne rośliny naczyniowe (makrofity), jest strategią konkurencyjną w porównaniu do innych metod bioremediacyjnych, bazujących na wykorzystaniu mikroorganizmów pro- i eukariotycznych, takich jak bakterie, jednokomórkowe glony, czy drożdże. Korzyści wynikające z użycia roślin naczyniowych wiążą się przede wszystkim z możliwością ich wykorzystania do likwidacji zanieczyszczeń w warunkach in situ, z łatwością zebrania materiału biologicznego oraz z brakiem zagrożenia migracji organizmów w środowisku gruntowo-wodnym. Wysoki potencjał fitoremediacyjny makrofitów, w szczególności występujących w strefach klimatu gorącego, jest w literaturze dobrze udokumentowany. Callitriche cophocarpa Sendtn. (C. polymorpha Lönnr.), obiekt moich zainteresowań, jest zimozielonym makrofitem, najbardziej powszechnym przedstawicielem rodzaju Callitriche w Polsce i Europie. Jest rośliną kosmopolityczną, występującą w klimacie umiarkowanym na obydwu półkulach. Gatunek ten rośnie w wodach stojących lub płynących (Fot. 1). 4 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 Wśród roślin wodnych występują gatunki zdolne do skutecznego usuwania zanieczyszczeń metali ciężkich, są to: gatunki wolno pływające (np. Eichhornia crassipes i Nymphaea spontanea), gatunki zanurzone (np. Hydrilla verticillata i Salvinia sp.) lub gatunki wynurzone (np. Phragmites australis i Typha latifolia). W odniesieniu do badań fitoremediacyjnych duże znaczenie ma jednak fakt, że C. cophocarpa jest rośliną zanurzoną. U roślin zanurzonych, powierzchnia kontaktu z zanieczyszczonym roztworem jest znacznie większa niż u roślin wynurzonych lub pływających po powierzchni, dlatego też fitoremediacja prowadzona przez makrofity zanurzone może być efektywniejsza. W prezentowanym cyklu prac Fot. 1. C. cophocarpa – naturalne skupiłam się na zanieczyszczeniach wody stanowisko rośliny (rzeka Dłubnia). przez związki metali ciężkich, czyli, zgodnie z definicją, metali posiadających gęstość przekraczającą 5 g·cm-3 i o liczbie atomowej większej od 20. Dostępność metali ciężkich dla roślin jest zawsze związana z rozpuszczalnością związków, jakie tworzą, oraz formami w jakich występują w roztworze. Metale najłatwiej dostępne są w postaci jonowej, lecz mogą być również skompleksowane z ligandami organicznymi. Forma, w jakiej występują, bezpośrednio rzutująca na ich biodostępność, jest uzależniona m.in. od: pH, potencjału redox roztworu, a także występowania materii organicznej. Niektórzy badacze sugerują zastąpienie terminu „metale ciężkie” terminem „metale śladowe”, ze względu na ich śladową, średnią zawartość w skorupie ziemskiej. Pod nazwą „metali śladowych” kryje się jednak większa grupa pierwiastków, zawierająca również metaloidy, takie jak np. arsen. W grupie metali ciężkich, balastowych, o wysokiej toksyczności w niskich koncentracjach, znalazły się pierwiastki, którymi zajęłam się w przedłożonym cyklu prac: Cr(VI), Tl(I)/(III) i Cd(II) oraz mniej ruchliwy Pb(II). Oprócz wymienionych pierwiastków, analizom poddałam również zdolności fitoremediacyjne Callitriche w stosunku do Cr(III) i Zn(II). Trójwartościowy Cr i cynk, w niskich stężeniach mają znaczenie jako mikroelementy, lecz w wyższych również cechują się znaczną toksycznością. Obecność badanych przeze mnie pierwiastków w wodach ma głównie pochodzenie antropogeniczne. Emisja związków metali ciężkich do zbiorników i cieków wodnych może pochodzić z kilku źródeł: a) gazów i pyłów towarzyszących spalaniu paliw kopalnych, b) spływów powierzchniowych z gleb, gdzie stosowane były nawozy mineralne, środki ochrony roślin oraz komunalne osady ściekowe, c) bezpośredniego odprowadzania surowych lub niedostatecznie oczyszczonych ścieków przemysłowych i komunalnych. 5 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 Chrom jest wykorzystywany w szerokim zakresie, m.in. w przemyśle metalowym do produkcji stopów i stali, do pokrywania powierzchni innych metali (galwanizacja) oraz garbowania skór. Jego sole posiadają atrakcyjne barwy (fiołkową, zieloną, żółtą, pomarańczową), stąd też Cr znajduje zastosowanie w produkcji różnego rodzaju pigmentów. Zanieczyszczenia chromem stanowią bardzo poważny problem zarówno w krajach rozwiniętych (USA), jak i rozwijających się (Indie). Na obszarze Polski największe skażenia Cr występują w Małopolsce, na Podhalu i są związane z wielowiekowym użytkowaniem licznych garbarni, znajdujących się na tych terenach. Chrom w przyrodzie występuje na dwóch stabilnych stopniach utlenienia jako Cr(III) oraz Cr(VI). Te dwie formy różnią się jednak zasadniczo własnościami fizykochemicznymi oraz toksycznością. Cr(VI) w roztworach występuje jako anion chromianowy lub dichromianowy. Jest niezwykle silnym utleniaczem, o wysokiej rozpuszczalności w szerokim zakresie pH i biodostępności. Jego obecność skutkuje utlenianiem wiązań nienasyconych w kwasach tłuszczowych, nukleinowych i białkach. Wykazuje mutagenne i kancerogenne oddziaływanie na ludzi i zwierzęta. Jest również wysoce toksyczny dla roślin. Cr(III) jest mniej toksyczny, w niskich stężeniach stanowi mikroelement w diecie ssaków, niezbędny w usuwaniu nadmiaru glukozy (jest składnikiem tzw. glucose tolerance factor) oraz gospodarce lipidowej. W roztworach występuje jako kation. Jego szkodliwe oddziaływanie, podobnie jak innych kationów metali ciężkich, jest związane z wiązaniem do grup funkcyjnych białek, w tym enzymów. Kationy metali ciężkich mogą również wypierać natywne jony metali z biocząsteczek komórki. Skutkuje to zmianami w ich strukturze i funkcjach. Ze względu na zawartość Cr(III) w wodach często przekraczającą dopuszczalne normy, zarówno związki Cr(VI) jak i Cr(III) są kwalifikowane przez Amerykańską Agencję Środowiskową (US Environmental Protection Agency; US EPA) jako związki o priorytetowej toksyczności. Pochodzenie talu w środowisku jest związane głównie z wydobyciem i przetwórstwem rud cynku i ołowiu, ponieważ metal ten wchodzi w skład minerałów siarczkowych. Tal w przyrodzie, podobnie jak Cr, występuje na dwóch stabilnych stopniach utlenienia jako Tl(I) oraz Tl(III). Obydwie formy są dobrze rozpuszczalne. Dla organizmów żywych, zarówno Tl(I) jak i Tl(III) są ogromnie niebezpieczne. W szczególności Tl(I), ze względu na duże podobieństwo do jonów K+, drastycznie wpływa na procesy potaso-zależne. Związki Tl, pomimo ich ogromnej toksyczności, przewyższającej toksyczność Cd, Hg i Pb, nie były do lat osiemdziesiątych traktowane z należytą uwagą. W Polsce, pierwsze badania dotyczące oddziaływania talu na rośliny, prowadzone były w latach dziewięćdziesiątych, na gatunkach występujących w rejonach Olkusza. Obecność toksycznych stężeń kationów Cd(II), Zn(II) i Pb(II) w środowisku ma swoje źródło w wydobyciu oraz bardzo szerokim, przemysłowym zastosowaniu tych pierwiastków, m.in. w przemyśle metalowym, do produkcji baterii, akumulatorów oraz wyrobu szkła. W grupie tych trzech pierwiastków, Cd posiada największą toksyczność, jednocześnie związki Cd wykazują wysoką rozpuszczalność. 6 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 Opis uzyskanych wyników W prezentowanym cyklu prac skupiłam się na analizach fizjologicznobiochemicznych i morfologicznych pędów C. cophocarpa, niezbędnych do określenia jej potencjału fitoremediacyjnego. Wykonałam również testy z zakresu chemii środowiska. Szczególny nacisk położyłam na fitoremediację jonów Cr(VI) i Cr(III) (publikacje P1, P2, P3). Te dwie formy Cr wprowadzałam do roztworu jako sole Cr(VI) lub Cr(III), w postaci odpowiednio dichromianów oraz siarczanu chromu. Aby badania były bardziej znaczące środowiskowo, jako roztworu inkubacyjnego używałam filtrowanej wody rzecznej (rzeka Dłubnia), pochodzącej z naturalnych stanowisk rośliny, skąd też pobierałam materiał roślinny (Małopolska: 50º16’ N/19º56’E) (Fot. 1). W pracy P4 zastosowałam jeszcze inne podejście do fitoremediacji, decydując się na aspekty bardziej aplikacyjne. W tym celu rośliny poddawałam działaniu skażonej wody, pobranej z naturalnego, zanieczyszczonego środowiska (strumień Graniczna Woda, okolice Tarnowskich Gór: 50º30’ N/18º49’ E). W wodzie tej zidentyfikowałam wysokie stężenia Tl, Cd, Zn i Pb. Pochodzenie wymienionych pierwiastków związane było m.in. z hutą cynku, mieszczącą się w Miasteczku Śląskim, nieopodal miejsca skażenia. Każdorazowo, w Laboratorium Hydrogeologii AGH, przeprowadzałam dokładne analizy parametrów fizykochemicznych wody. Ponieważ prowadzone przeze mnie testy miały charakter interdyscyplinarny, wykorzystywałam wiele różnorodnych narzędzi analitycznych. Testy akumulacji i usuwania toksycznych pierwiastków z roztworu (prace P1, P2 i P4) Do określenia poziomów akumulacji pierwiastków oraz stopnia ich usuwania z roztworu, zastosowałam spektrometrię atomową, emisyjną, ze wzbudzeniem w plazmie sprzężonej indukcyjnie (ICP-OES) oraz spektrometrię mas, z jonizacją w plazmie sprzężonej indukcyjnie (ICP-MS). W pracach dotyczących chromu odwołuję się do dwóch stopni utlenienia tego pierwiastka, mając na uwadze formę, w jakiej był on wprowadzony do roztworu. Dokładne określenie specjacji pierwiastka w tkance rośliny wymagałoby zastosowania synchrotronu; metody spektrometrii atomowej dają informację dotyczącą ilości pierwiastka, bez rozróżnienia jego walencyjności. Jednakże, w pracy P1, dzięki zastosowaniu 1,5-difenylokarbazydu, a w pracy P2, dzięki strąceniu Cr(III), dokonałam rozróżnienia stopnia utlenienia Cr w roztworze. W pracy P4, Tl, Cd, Zn i Pb były identyfikowane jako suma wszystkich stopni utlenienia. Dotyczy to zwłaszcza Tl, gdyż występuje on jako Tl(I) oraz Tl(III). Cd, Zn i Pb występują w wodach głównie na +2 stopniu utlenienia. Maksymalny poziom akumulacji Cr, po zastosowaniu roztworu Cr(VI), wynosił 7 315 mg kg-1 suchej masy (s.m.) (ok. 0,7%). W przypadku Cr(III) wartość ta była ok. czterokrotnie wyższa i wynosiła 28 385 mg kg-1 s.m. (ok. 3%) (praca P1). Te maksymalne wartości akumulacji stwierdzałam po inkubacji roślin w bardzo wysokich, niefizjologicznych stężeniach badanego pierwiastka, wynoszących 4 mM, czyli 208 mg dm-3. Stężenia te odpowiadają koncentracji Cr w wodach popłucznych i ściekach, gdyż średnia zawartość Cr w rzekach wynosi jedynie 0,7 g dm-3. Gdy zastosowałam niższe stężenia pierwiastka w medium (praca P2), mierzyłam 7 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 jednocześnie niższą zawartość Cr w tkankach, natomiast znacząco poprawiała się kondycja fizjologiczna roślin (co omówię w następnym podrozdziale). Z akumulacją Cr była związana zdolność pędów do usuwania Cr z roztworu (prace P1 i P2). Wynik ten odnotowywałam przy zastosowaniu odpowiednio dobranej ilości biomasy roślin i roztworu (ok. 40 : 1). Maksymalną zdolność usuwania Cr stwierdzałam dla roztworów Cr(III) o wyjściowym stężeniu 0,5 mM (26 mg dm-3). W takim roztworze pędy roślin usuwały 99% początkowej ilości pierwiastka. Oczywiście, dla niższych stężeń Cr(III) dochodziłoby do 100% usuwania Cr z roztworu. Niestety, w przypadku roztworów Cr(VI) nie zanotowałam całkowitego usunięcia Cr przez pędy roślin. Jednakże, tak samo jak w przypadku Cr(III), niższa zawartość jonów Cr w medium, była skorelowana z wyższą wydajnością w jego usuwaniu przez rośliny. Zarówno zdolność do akumulacji, jak wynikająca z niej zdolność do usuwania chromu z medium, w przypadku Cr(VI) była zawsze ok. 4-5 krotnie niższa niż Cr(III). Oprócz analizy poziomów akumulacji/usuwania Cr, policzyłam również współczynniki biokoncentracji tego metalu (ang. bioconcentration factor, BCF) (praca P1). BCF jest definiowany jako stosunek ilości pierwiastka w tkance (w mg kg -1 s.m.) do ilości pierwiastka w roztworze (w mg kg-1). Jego wartość informuje o zdolności rośliny do koncentracji pierwiastka w tkankach. Jednym z warunków hiperakumulacji metalu jest wartość BCF > 1. Po wyliczeniu BCF, okazało się, że jego wartości są bardzo wysokie. Wynosiły one maksymalnie 112 oraz 517, odpowiednio w przypadku roztworów Cr(VI) i Cr(III). Chciałabym podkreślić, iż obserwowana przeze mnie zdolność Callitriche cophocarpa do akumulacji Cr i jego biokoncentracji jest bardzo znacząca i w warunkach naturalnych odpowiadałaby hiperakumulacji tego metalu. Zgodnie z definicją, hiperakumualtorem Cr jest gatunek, który w naturalnych warunkach posiada zdolność do akumulacji tego pierwiastka w tkankach > 300 mg kg-1, oczywiście przy jednoczesnym BCF > 1. Do tej pory, w literaturze, opisano 5 gatunków hiperakumulatorów Cr. W grupie tej jedynie 1 gatunek to roślina wodna – Leersia hexandra, pochodząca z południowych Chin. Poziomy akumulacji Cr, po inkubacji w roztworze zawierającym jony Cr o danej specjacji, są ściśle związane z gatunkiem rośliny. Na przykład rośliny z rodziny Brassicaceae wykazują większe powinowactwo, mierzone ilością zakumulowanego pierwiastka, w stosunku do formy sześcio-, aniżeli trójwartościowej. Z kolei, w przypadku C. cophocarpa, podobnie jak Leersia hexandra, poziom akumulacji Cr jest większy, gdy inkubację prowadzi się w roztworze Cr(III) aniniżeli Cr(VI). C. cophocarpa wyróżnia się na tle innych, znanych wodnych gatunków fitoremediatorów chromu tym, iż Cr jest akumulowany w pędach rośliny. Większość roślin wodnych, takich jak np. Eichhornia crassipes, bardzo efektywny fitoremediator wód rozprzestrzeniony w rejonach o gorącym klimacie, dokonuje ryzofiltracji związków metali ciężkich. Podobnie jak rośliny lądowe, rośliny wodne zatrzymują toksyczny pierwiastek w korzeniach, nie dopuszczając do jego dalszej migracji w obrębie innych organów. Zdolność Callitriche do akumulacji Cr w pędach ma bezpośrednie znaczenie środowiskowe. Jest to związane z większym prawdopodobieństwem usunięcia nieuszkodzonych pędów aniżeli nieuszkodzonych korzeni. W razie niepełnego usunięcia lub zniszczenia korzeni, toksyczny pierwiastek nadal stanowi zagrożenie środowiskowe, pozostając z fragmentami korzeni w osadzie. 8 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 W przeprowadzonych badaniach nie wyznaczyłam maksymalnej pojemności sorpcyjnej Callitriche w stosunku do jonów Cr. Obecnie, we współpracy z dr hab. Joanną Kyzioł-Komosińską z Instytutu Podstaw Inżynierii Środowiska PAN w Zabrzu oraz dr Wojciechem Laskiem, właścicielem firmy ChemTech-ProSynTech, opracowuję tzw. modele izoterm sorpcyjnych. Wyniki tych badań (abstrakt a18) zostaną przeze mnie zaprezentowane w bieżącym roku na międzynarodowej konferencji organizowanej przez Międzynarodowe Towarzystwo Fitotechnologiczne (International Phytotechnology Society), którego jestem członkiem. Do w/w badań wykorzystana została wysuszona biomasa roślin, inkubowana w warunkach ekstremalnie wysokich stężeń Cr i skrajnych wartości pH. Jednak, bez względu na wynik otrzymany w modelach izoterm, niezwykła zdolność żywych roślin do akumulacji Cr, którą wykazałam w prezentowanym cyklu prac jest porównywalna do akumulacji Cr przez komercyjne sorbenty. Oprócz analizy zdolności Callitriche do akumulacji Cr(VI) i Cr(III), przeprowadziłam również badania związane z fiotoekstrakcją Tl, Cd, Zn i Pb, zidentyfikowanych przez mnie w strumieniu Graniczna Woda (praca P4). Ciekawą obserwacją przeprowadzoną wspólnie z dr hab. Bartoszem Płachno z Uniwersytetu Jagiellońskiego, która była dla mnie inspiracją do zapoczątkowania prac eksperymentalnych nad fitoremediacją tego systemu wodnego, był brak roślin wyższych w korycie strumienia. Dodatkowo, w ścisłym sąsiedztwie strumienia, stwierdziliśmy bardzo ograniczoną liczbę gatunków roślin lądowych. Wśród nich dominował Caradminopsis halleri, gatunek znany jako metalofit. Po przeprowadzeniu analiz chemicznych okazało się, że wodzie pochodzącej z Granicznej Wody, w znaczących ilościach znajduje się Tl, Cd, Zn i Pb. Standardy dotyczące jakości wód powierzchniowych (US EPA Water Quality Standards oraz Rozporządzenie Ministra Środowiska i Gospodarki Wodnej z dn. 9 listopada 2011 r.) zostały przekroczone w następujący sposób: Tl 120-krotnie, Cd 40-krotnie, Zn 10krotnie i Pb 7-krotnie. Po 10-dniowej inkubacji pędów Callitriche w zanieczyszczonej wodzie, stwierdziłam znaczącą akumulację badanych pierwiastków w tkankach rośliny (mg kg-1 s.m.): Zn (1120) < Tl (251) < Cd (71) < Pb (35). Wyliczone przeze mnie współczynniki biokoncentracji tych metali ciężkich miały niezwykle wysokie wartości: Cd (1177) < Tl (1043) < Zn (718) < Pb (597). Chciałabym podkreślić także fakt, iż 10-dniowa inkubacja była wystarczająca, aby woda osiągnęła standardy jakości, za wyjątkiem standardu dla talu. Ten fakt należy wiązać z ogromną toksycznością tego pierwiastka, która hipotetycznie może limitować jego fitoekstrakcję. Aby potwierdzić fitoremediacyjne działanie pędów rzęśli w stosunku do wody pochodzącej ze skażonego strumienia, we współpracy z dr Agnieszką Baran z Katedry Chemii Rolnej i Środowiskowej UR w Krakowie, przeprowadziłam testy biodostępności trujących pierwiastków (praca P4). Znaczenie testów środowiskowych wynika z faktu, że pierwiastki wykazują różną toksyczność w zależności od formy, w jakiej występują w roztworze (por. podrozdział „Wprowadzenie – osadzenie tematyki w kontekście badań nad fitoremediacją wód z zanieczyszczeń związkami metali ciężkich”). Może się zdarzyć, iż wysoka zawartość pierwiastka, wykazana metodami AAS/ICP, nie jest skorelowana z wysoką toksycznością roztworu. W pracach nad Cr, dodawałam go do medium w postaci soli, które ulegały dysocjacji. Natomiast w przypadku skażonych próbek z naturalnego środowiska, nie posiadałam wiedzy na temat form, w jakich 9 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 występują badane pierwiastki w wodzie. Do oceny toksyczności wody użyłyśmy testu Microtox®, wykorzystującego bakterie luminescencyjne Vibrio fischeri. Zasada tej metody opiera się na tym, iż w obecności trujących substancji, takich jak np. wolne jony metali ciężkich, luminescencja bakterii ulega osłabieniu. Próbki zanieczyszczonej wody poddałyśmy analizie przed oraz po zakończeniu inkubacji z pędami rośliny. Kontrolę stanowiły pędy inkubowane w wodzie niewykazującej toksyczności (klasa I), pochodzącej z naturalnego, niezanieczyszczonego stanowiska rośliny. Skażone próbki wody w teście Microtox® posiadały II klasę ostrej toksyczności. Po 10-dniowej inkubacji z pędami rośliny, ich toksyczność została całkowicie zniesiona. Potwierdzało to uzyskane wcześniej wyniki efektywnej remediacji Tl, Cd, Zn i Pb przez Callitriche. Mechanizmy wiązania, redukcji i transportu chromu (prace P1, P2 i P3) W trakcie przeprowadzania testów akumulacji Cr, zastanawiałam się nad biotechnologicznym sposobem wykorzystania roślin wiążących dużą ilość chromu w swoich tkankach. Oczywiście, kondycja fizjologiczna roślin pogarszała się wraz ze zwiększaniem stopnia akumulacji Cr. Dlatego w tym przypadku myślałam bardziej o wykorzystaniu biomasy jako materii organicznej aniżeli żywych pędów. W roku 2010, rozpoczęłam poszukiwania osób, które zajmowałyby się w Polsce badaniami nad technologicznym wykorzystaniem materii organicznej, jako sorbentów związków metali ciężkich. Przeglądając naukowe bazy danych odkryłam prace wspomnianej już dr hab. Joanny Kyzioł-Komosińskiej z Instytutu Podstaw Inżynierii Środowiska PAN w Zabrzu, z którą nawiązałam współpracę. Ustaliłyśmy, że przed testami odzysku Cr z biomasy roślin, należy sprawdzić, w jaki sposób jest on wiązany do tkanki. Przeprowadziłyśmy zatem analizy siły wiązania Cr, których wyniki zostały zaprezentowane w pracy P1. Określenie siły wiązania ma również podstawowe znaczenie przy ocenie mobilności pierwiastka w środowisku oraz przy postępowaniu ze skażonym materiałem roślinnym. W badaniach zastosowałyśmy 6-stopniową metodę chemicznej ekstrakcji sekwencyjnej. Dzięki użyciu tej metody możliwe było wyznaczenie udziału jonów metali w poszczególnych frakcjach: mobilnych, mobilizowalnych oraz silnie związanych z matrycą. Tym samym mogłyśmy określić siłę wiązania Cr z centrami sorpcyjnymi i jego podatność na uwalnianie. Zastosowałyśmy wysokie, częściowo skrajnie niefizjologiczne stężenia Cr, charakterystyczne dla wód popłucznych i ścieków (por. podrozdział „Testy akumulacji i usuwania toksycznych pierwiastków z roztworu”). Wyniki, które uzyskałyśmy, wskazywały na bardzo duże różnice w wiązaniu Cr, w zależności od jego stopnia utlenienia. Rośliny po inkubacji w roztworze Cr(III) niezwykle silnie wiązały ten toksyczny pierwiastek. W tym przypadku ponad 71% ogólnej puli zakumulowanego Cr znajdowało się w postaci kompleksów chelatowych lub innych, bardzo stabilnych kompleksów metaloorganicznych. Tak silne związanie z matrycą oznacza brak zagrożenia wtórnego zanieczyszczenia wody przez rośliny, które wcześniej były poddane ekspozycji na Cr(III). Odwrotny wynik uzyskałyśmy w przypadku roślin inkubowanych w medium zawierającym sole Cr(VI). W tym przypadku większość zakumulowanego Cr pozostawała we frakcjach nietrwałych: albo rozpuszczalnej w wodzie (34%) albo wysoce mobilnej (23%). Wynik ten oznacza, iż pędy Callitriche poddane działaniu 10 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 Cr(VI), akumulują go, choć może być on łatwo uwalniany do otaczającego środowiska. Dlatego wskazana jest duża ostrożność przy postępowaniu z takim materiałem oraz pożądana jest jego szybka utylizacja. W pracy P2 zajęłam się analizami redukcji Cr(VI) do Cr(III), która uważana jest za główny mechanizm detoksyfikacji Cr(VI). Wynika to ze znacząco niższej toksyczności Cr w postaci trójwartościowej. Badania te wykonałam m.in. dzięki otrzymaniu w roku 2011 wsparcia finansowego w postaci indywidualnego stypendium Rektora UR dla pracowników Uczelni. Konwersja Cr(VI) Cr(III) w warunkach abiotycznych może być przeprowadzana w roztworach, np. przez związki Fe(II) lub S(II). Redukcja Cr(VI) do Cr(III) zachodzi również z udziałem organizmów żywych. Jednak najwięcej prac badawczych poświęconych jest mikroorganizmom, które są zdolne do redukcji zarówno wewnątrz- jak i zewnątrzkomórkowej. W bioredukcji wykorzystywane są związki niskocząsteczkowe, np. glutation, cysteina lub NAD(P)H. W przypadku bakterii znane są również enzymy katalizujące ten proces, których jak dotychczas nie udało się jednak znaleźć u roślin. W badaniach redukcji Cr(VI) przez Callitriche wykorzystałam spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego, w zakresie niskich częstotliwości pola magnetycznego, tzw. L-band EPR. Spektrometr EPR stanowi unikatowe wyposażenie Zakładu Biochemii, Instytutu Biologii Roślin i Biotechnologii UR w Krakowie. Został on skonstruowany przez dr Tadeusza Walczaka z Department of Diagnostic Radiology, Dartmouth Medical School, Hanower, USA. Analizy EPR wykonywałam we współpracy z dr Anną Kostecką-Gugała z Zakładu Biochemii. Spektrometria EPR to jedna z metod badania związków chemicznych posiadających niesparowane elektrony. Dlatego też L-band EPR pozwolił nam na pomiar stopnia redukcji Cr(VI), poprzez rejestrowanie sygnału pochodzącego od Cr(V), będącego niestabilnym rodnikiem, produktem pośrednim w reakcji redukcji Cr(VI) Cr(III). Stopień redukcji chromianów był skorelowany z wielkością amplitudy sygnału Cr(V). Wspólnie z dr Kostecką-Gugała przeprowadziłyśmy 5-dniowe analizy EPR redukcji Cr(VI) wewnątrz tkanek, jak i w medium, którego podstawę stanowiła, tak jak we wszystkich pracach, woda rzeczna. W badaniach uwzględniałyśmy zawsze Cr(III), który pojawiał się w roztworze na skutek obecności nieorganicznych reduktorów (np. siarczków). W analizach wykluczyłyśmy zachodzenie reakcji odwrotnej, czyli utleniania Cr(III) Cr(VI). Oprócz analiz widm EPR rodnika Cr(V), w przypadku roztworów stosowałam również metody miareczkowe, w oparciu o odpowiednią normę. Dzięki uzyskanym wynikom stwierdziłam, że konwersja Cr(VI) zachodzi wyłącznie w pędach rośliny. Callitriche nie wydziela do medium zewnątrzkomórkowych reduktorów zdolnych do detoksyfikacji Cr. Oznacza to, że fitoekstrakcja Cr(VI) przez pędy rośliny zachodzi z równoczesną jego wewnątrz-, lecz nie zewnątrztkankową redukcją. Nie dochodzi zatem do fitostabilizacji Cr(III) w medium. Wynik ten ma również znaczenie aplikacyjne. Otóż, gdyby akumulacji Cr(VI) towarzyszyła jego redukcja w roztworze otaczającym zanurzone tkanki, wówczas powstający Cr(III) mógłby ulegać wytrąceniu w wodzie o pH neutralnym lub zasadowym. Pozostając w osadzie, mógłby w dalszej kolejności być remobilizowany przy zmianie parametrów fizykochemicznych wody, a wówczas dochodziłoby do jej wtórnego zanieczyszczenia. W pracy P3 poświęciłam się analizom dystrybucji jonów Cr w pędach Callitriche, zarówno po ekspozycji roślin na Cr sześcio- jak i trójwartościowy. Badania 11 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 przeprowadziłam na pędach, skupiając się na dojrzałych liściach i łodygach. Do badań tych zainspirowała mnie praca Espinoza-Quiñones i wsp. (Water Research 2009), dotycząca mapowania Cr w oparciu o metody spektroskopii rentgenowskiej. Przeszukując zasoby internetowe pod kątem wyposażenia laboratoriów analitycznych w odpowiednią aparaturę, trafiłam na pracownię Zespołu Badań Biomedycznych i Środowiskowych, na Wydziale Fizyki i Informatyki Stosowanej AGH, dysponującą spektrometrem fluorescencyjnym stosowanym do analizy pierwiastkowej próbek metalicznych (X-ray fluorescence spectrometer; XRF). Mapowanie Cr w liściach i łodygach rośliny metodą XRF przeprowadziłam w ścisłej współpracy z dr Pawłem Wróblem i dr hab. Dariuszem Węgrzynkiem z w/w Zespołu. Analizy wykonane tą metodą są bardzo czułe (detekcja na poziomie µg na g próbki), jednak rozdzielczość otrzymanego obrazu nie jest najwyższa. Dlatego też do badań zaprosiłam dr hab. Grzegorza Tylko z Zakładu Obrazowania Komórki UJ oraz dr hab. Bartosza Płachno z UJ, we współpracy z którymi dokonałam jednoczesnej mikroanalizy składu pierwiastkowego tkanek wraz z bardzo dokładną lokalizacją struktur odpowiedzialnych za akumulację Cr w liściach i łodygach rośliny. Ta ostatnia metoda, stanowiąca połączenie elektronowej mikroskopii skaningowej z mikroanalizą pierwiastkową (SEM-EDS), stanowiła cenne uzupełnienie techniki XRF. Choć nie była tak czuła jak poprzednia (detekcja na poziomie mg na g próbki), dawała bardzo dokładną informacje dotyczącą morfologii analizowanych struktur. Rozmieszczenie Cr w pędach Callitriche było uzależnione od specjacji Cr, w jakim inkubowałam rośliny. Jeśli rośliny poddałam działaniu Cr(III), Cr znajdowany był wyłącznie w trichomach (włoskach) znajdujących się na powierzchni epidermy, zarówno liści jak i łodyg. Włoski pełniłyby tu funkcję zabezpieczającą przed wnikaniem jonów Cr z roztworu zewnętrznego w głąb tkanek. Podobne zjawisko zostało stwierdzone przez Lavid i wsp. dla Nyphea (Planta 2011). Natomiast, po inkubacji pędów w chromie sześciowartościowym, pierwiastek ten znajdowałam głównie w wiązkach przewodzących oraz w pojedynczych włoskach, szczególnie na powierzchni łodyg. Tę odmienną lokalizację Cr, ściśle zależną od jego stopnia utlenienia, można wiązać z odmiennymi własnościami fizykochemicznymi tych dwóch form. Cr(III) w roztworach występuje głównie jako kation i jest silnie sorbowany przez roślinę, co udowodniłam w pracy P1. Cr(VI) z kolei występuje w postaci wysoce mobilnych (łatwo rozpuszczalnych) anionów i jest stosunkowo słabo sorbowany. Dlatego też w formie tej może pozostawać w roztworze wypełniającym wiązki przewodzące. Obecność Cr w trichomach, po ekspozycji łodyg na Cr(VI), można tłumaczyć jego redukcją do formy Cr(III) (proszę porównać z pracą P2). W pracy P3, potwierdziłam również wcześniejsze wyniki uzyskane metodami spektrometrii atomowej (ICP), związane ze znacznie wyższą akumulacją Cr po ekspozycji roślin na Cr(III) aniżeli Cr(VI). Poziomy akumulacji Cr w pędach rośliny można było zaszeregować następująco: Cr(III) łodyga < Cr(III) liść < Cr(VI) łodyga < Cr(VI) liść. Wyniki przedstawione w pracy P3 po raz kolejny potwierdziły całkowitą odmienność oddziaływania Cr(VI) i Cr(III) na roślinę. 12 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 Analizy stanu fizjologicznego roślin w warunkach stresu (prace P1,P2 i P4) Testując organizm pod kątem jego znaczenia bioremediacyjnego, nie można zapominać o jego fizjologicznej kondycji w warunkach stresu abiotycznego. Związki metali ciężkich mają szeroko opisane bardzo toksyczne oddziaływanie na organizmy żywe. Dlatego też, równolegle z testami akumulacji, każdorazowo monitorowałam kondycję fizjologiczną roślin. W analizach stanu aparatu fotosyntetycznego wykorzystywałam spektrofotometr UV-Vis (prace P1, P4) oraz spektrofluorymetr (prace P1, P2, P4) służący do pomiarów parametrów fluorescencji chlorofilu a. Do analizy uszkodzeń błon komórkowych zastosowałam konduktometr (praca P3). Ponadto, do oceny morfologii pędów używałam lupy binokularnej i mikroskopu świetlnego (praca P4). W pracach P1 i P4 udowodniłam wysoką odporność aparatu fotosyntetycznego rzęśli na wysokie stężenie toksycznych pierwiastków metalicznych: Cr, Tl, Cd, Zn i Pb. Wraz ze zwiększeniem stężenia Cr w roztworze (praca P1), spadała aktywność fotosyntetyczna rośliny. Wykazałam jednak, iż po 5-dniowym stosowaniu Cr(VI)/Cr(III) w całkowicie niefizjologicznych stężeniach 0,5 mM (26 mg dm-3) i 1 mM (52 mg dm-3), wydajność konwersji energii w obrębie fotosystemu II (PSII), czyli parametr Fv/Fm, pozostaje na poziomie mierzonym u roślin kontrolnych. W oparciu o pomiary wycieku elektrolitów przez błony (praca P2) udowodniłam również, że kondycja fizjologiczna rośliny w obecności Cr(III) jest lepsza aniżeli w obecności Cr(VI). C. cophocarpa wykazuje wysoką odporność aparatu fotosyntetycznego nie tylko na chrom, lecz również na ekstremalnie toksyczne związki talu i kadmu, a także cynku i ołowiu. W pracy P4, współpracując z dr Krzysztofem Tokarzem, stwierdziliśmy, że parametry fluorescencji chl a, takie jak: Fv/Fm – maksymalna fotochemiczna wydajność PSII, qP – fotochemiczne wygaszanie fluorescencji oraz ΦPSII – wydajność kwantowa PSII, pozostają, po 10-dniowej inkubacji w skażonym roztworze, na poziomie mierzonym u roślin kontrolnych. W pracy P4 udowodniłam także, że zarówno zawartość barwników fotosynetycznych, jak również morfologia roślin, np. pokrój roślin, kształt blaszek liściowych, długość międzywęźli, nie ulegają zmianie pod wpływem działania toksycznych pierwiastków. Podsumowanie W przeciwdziałaniu istniejącym zagrożeniom wynikającym z zatrucia wód ważne są zarówno badania nad mechanizmami, jak również nad metodami oczyszczania zdegradowanego środowiska. W prezentowanym cyklu publikacji starałam się zwrócić uwagę na te dwa aspekty. Liczba doniesień literaturowych dotyczących fitoakumulacji kadmu, cynku i ołowiu, jak również mechanizmów oddziaływania tych pierwiastków na rośliny jest stosunkowo duża. Natomiast, znacząco mniejsza jest ilość dostępnych informacji na temat fitoremediacji chromu, a drastycznie mała na temat talu. Chciałabym również podkreślić fakt, iż fitoremediacja bazująca na roślinach lądowych jest również szerzej opisywana aniżeli remediacja środowiska z wykorzystaniem gatunków roślin wodnych. 13 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 W publikacjach składających się na osiągnięcie będące podstawą do ubiegania się o stopień doktora habilitowanego udowodniłam wyjątkowe zdolności pędów Callitriche cophocarpa do akumulacji związków Cr, a także do oczyszczania wód z nadmiernych stężeń Tl, Cd, Zn i Pb. Postawiony w przedstawionym cyklu publikacji cel zrealizowałam w oparciu o wielopłaszczyznowe badania, w odniesieniu zarówno do procesów fizykochemicznych, jak i kontrolowanych metabolizmem żywej rośliny. Wykazałam, iż: 1) maksymalna, chociaż wciąż niewysycona, akumulacja Cr dochodzi do 3% suchej masy rośliny; 2) rośliny są zdolne do usunięcia jonów Cr(III) z roztworu prawie ze 100% wydajnością; 3) Cr jest akumulowany z roztworów Cr(III) z kilkukrotnie wyższą wydajnością aniżeli z roztworów Cr(VI) 4) Cr wiąże się z tkanką rośliny w sposób zależny od stopnia utlenienia, w jakim występuje w roztworze, co ma duże przełożenie środowiskowe; po inkubacji roślin w roztworze Cr(III) Cr wiąże się bardzo silnie w postaci kompleksów chelatowych lub metaloorganicznych; po inkubacji w Cr(VI) Cr może być łatwo remobilizowany, gdyż występuje w postaci słabo związanej z matrycą; 5) C. cophocarpa przeprowadza wewnątrztkankową redukcję toksycznej formy Cr(VI) bez redukcji Cr(VI) w roztworze; oznacza to brak fitostabilizacji Cr opartego na wydzielaniu do roztworu czynników redukujących, jak ma to miejsce w przypadku niektórych mikroorganizmów; 6) dystrybucja Cr w tkankach rośliny zależy od specjacji pierwiastka: Cr jest akumulowany w dużych ilościach wyłącznie we włoskach/trichomach na powierzchni liści i łodyg po inkubacji roślin w Cr(III); u roślin poddanych działaniu Cr(VI) Cr jest obecny głównie we wiązkach przewodzących w znacznie niższych ilościach; 7) Callitriche posiada ponadprzeciętne zdolności do fitoekstrakcji niezwykle toksycznych związków Tl oraz Cd, a także Zn i Pb; 8) remediacja Tl, Cd, Zn i Pb opiera się na silnej biokoncentracji wymienionych pierwiastków w tkankach rośliny, z jednoczesnym całkowitym zniesieniem toksyczności skażonej wcześniej wody; 9) zdolność Callitriche do akumulacji związków metali ciężkich w pędach ma bezpośrednie znaczenie środowiskowe, które związane jest z większym prawdopodobieństwem usunięcia nieuszkodzonych pędów aniżeli nieuszkodzonych korzeni; 10) aparat fotosyntetyczny C. cophocarpa na zanieczyszczenia badanymi związkami metali. wykazuje wysoką tolerancję Uzyskane wyniki mogą przyczynić się do rozwoju wiedzy na temat mechanizmów kontrolujących fitoremediację związków metali w systemach wodnych. Ponieważ badany przeze mnie gatunek jest szeroko rozprzestrzeniony w Polsce i na świecie, jest zimozielony i posiada stosunkowo duże przyrosty biomasy, zaprezentowane wyniki mogą również znaleźć przełożenie aplikacyjne. 14 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 Wszystkie badania przedstawione w opisanym cyklu publikacji zostały sfinansowane ze środków kierowanego przeze mnie projektu badawczego Narodowego Centrum Nauki o numerze DEC-2011/03/B/NZ9/00952. Kierunki i kontynuacja badań Ze względu na niezwykłe zdolności Callitriche cophocarpa do fitoremediacji związków metali ciężkich chciałabym kontynuować badania w kierunku biotechnologicznego wdrożenia rośliny w oczyszczanie wód. Ten kierunek badań ma duże znaczenie, ze względu na to, że potencjalne zanieczyszczenie obejmujące ogromne objętości wody może zostać skoncentrowane w znacznie mniejszej objętości roślin. Biomasa roślin w dalszej kolejności może zostać poddana odzyskowi metalu. Prace nad odzyskiem metalu są już przeze mnie zaplanowane do realizacji. Ponadto, w ramach badań nad biotechnologicznym wykorzystaniem Callitriche rozpoczęłam także analizy mające na celu określenie maksymalnej pojemności sorpcyjnej rzęśli, w oparciu o liniowe i nieliniowe modele izoterm sorpcyjnych. Celem tych badań jest analiza zdolności sorpcyjnych Callitriche pod kątem jej ewentualnego wykorzystania jako naturalnego sorbentu organicznego. Niezależnie, poza testami aplikacyjnymi, chciałabym również kontynuować badania fizjologiczno-biochemiczne nad mechanizmami odpowiedzi rośliny na stres abiotyczny, jakim jest dla niej wysokie stężenie pierwiastków metalicznych. III. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych (artystycznych) Wszystkie cytowane prace zostały opisane w „Wykazie prac”, załącznik 4, p. II (część dotycząca prac spoza osiągnięcia habilitacyjnego). Prace wykonane przed uzyskaniem doktoratu Badania nad indukowanymi światłem ruchami chloroplastów (praca A1; abstrakty a1, a3, a4, a5, a6) Moje zainteresowania fotobiologią rozpoczęły jeszcze na studiach magisterskich i były od samego początku związane z pracownią fotobiologiczną, kierowaną przez prof. dr hab. Halinę Gabryś. Początkowo, swoją uwagę skupiałam na mutantach fotomorfogenetycznych Arabidopsis. Ostatecznie jednak zajęłam się sterowanymi światłem ruchami wewnątrzkomórkowymi. Prace te miały charakter badań podstawowych. Pod opieką prof. Gabryś wykonałam w Zakładzie Fizjologii i Biochemii Roślin Instytutu Biologii Molekularnej UJ pracę magisterską, pt. „Wstępna charakterystyka reakcji ruchowych chloroplastów w liściach paproci”. Tematyka poruszona w mojej pracy dotyczyła wpływu światła na ruch chloroplastów w saprofitach 5 gatunków paproci, o szerokiej rozpiętości ekologicznej. W analizach wykorzystywałam fitofotometr, skonstruowany przez dr Tadeusza Walczaka. To unikatowe urządzenie pozwalało na precyzyjną rejestrację parametrów ruchów, takich 15 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 jak np. amplituda ruchu, początkową szybkość reakcji, czas wysycenia reakcji i in. W badaniach odkryłam, iż światło niebieskie indukuje ruch u wszystkich badanych gatunków, jakkolwiek amplituda ruchu jest skorelowana z wymaganiami siedliskowymi roślin. Gatunki o największej plastyczności środowiskowej, takie jak Adiantum capillusveneris oraz Pteris cretica, wykazywały największa dynamikę przebiegu reakcji. Wykazałam również, iż w przypadku A. capillus veneris oraz Ceratopteris cornuta, również światło czerwone jest zaangażowane w indukcję ruchów, chociaż mechanizm ruchu był odmienny dla tych dwóch gatunków. Po rozpoczęciu studiów doktoranckich, przez pierwszy rok, kontynuowałam badania z tego zakresu. Ich wyniki zostały przedstawione na Europejskim Sympozjum Fotomorfogenetycznym w Marburgu (a3). Po wzbogaceniu o analizy mikroskopowe oraz wyraźne wykazanie fitochromu w ruchach chloroplastów u A. capillus-veneris, zostały następnie opublikowane w Plant, Cell & Environment (A1). W październiku 1995 roku, rozpoczęłam w tej samej jednostce, pod kierunkiem prof. Haliny Gabryś, studia doktoranckie. Tym razem, zaplanowane badania dotyczyły mechanizmów ruchu chloroplastów i plastydów w modelu in vitro. Tytuł mojej pracy doktorskiej brzmiał „Badania nad mechanizmem ruchów chloroplastów w komórkach i protoplastach Nicotiana tabacum”. Celem głównym badań było wykazanie roli ściany komórkowej w przemieszczeniach chloroplastów/plastydów. Dodatkowo, chodziło również o wykazanie w tym układzie roli cytoszkieletu aktynowego. Zaplanowane badania były całkowicie nowatorskie. W ówczesnym czasie, na świecie, było tylko kilka ośrodków zajmujących się ruchami chloroplastów. Oprócz naszego zespołu problem ten badali naukowcy z Anglii, Japonii i Niemczech. Nikt jednak nie zajmował się tego typu modelami. Zadania, które otrzymałam do realizacji były bardzo ciekawe, lecz jednocześnie wymagały ode mnie opanowania trudnych technik. Podstawową z nich była izolacji oraz regeneracja protoplastów Arabidopsis thaliana w warunkach in vitro, gdyż początkowo modelem do badań miały być regenerujące protoplasty pozyskane z mezofilu liści tego gatunku. Aby nabrać biegłości w stosowaniu technik in vitro, w roku 1997 skorzystałam z 6 miesięcznego stypendium Tempus w Laboratorium Biotechnologii Roślin, na Uniwersytecie Lizbońskim, w Portugalii. Niestety, pomimo zdobytego doświadczenia w kulturach in vitro, pierwsze 3 lata moich badań nad regeneracją mezofilowych protoplastów Arabidopsis zakończyły się porażką. W roku 1998, po intensywnych poszukiwaniach informacji dotyczących warunków izolacji i regeneracji protoplastów Arabidopsis, trafiłam na publikacje prof. Jean-Pierre Verbelena, z Uniwersytetu w Antwerpii. Prof. Verbelen zachęcił mnie do zmiany modelu roślinnego na tytoń, gdyż, jak twierdził, regeneracja protoplastów z liści rzodkiewnika była praktycznie niewykonalna. Nasiona tytoniu oraz młode rośliny in vitro do wstępnych analiz ruchów w liściach otrzymałam od prof. Tadeusza Kobyłki i dr Barbary Nowak z Katedry Botaniki UR w Krakowie. Na początku roku 1999, dzięki stypendium European Science Foundation, wybrałam się na miesięczny pobyt do laboratorium prof. Verbelena, gdzie oprócz technik regeneracyjnych zapoznałam się również z protokołami barwienia cytoszkieletu aktynowego w protoplastach. Po powrocie ze stypendium rozpoczęłam bardzo intensywne doświadczenia z wykorzystaniem modelu tytoniowego. Wykazałam, iż w liściach tytoniu ruch chloroplastów, podobnie jak u innych roślin wyższych, pozostaje pod kontrolą światła 16 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 niebieskiego. Światło to nie jest jednak aktywne w ruchach plastydów w trakcie regeneracji komórki. Przemieszczenia plastydów podczas regeneracji komórek odbywały się w sposób przypadkowy, niezależny od intensywności i barwy światła. Charakterystyczne reakcje ruchowe (tzw. reakcja do położenia płaskiego i profilowego) przywracane były dopiero po pełnym zregenerowaniu mezofilu. Bardzo ciekawą obserwacją był wpływ obniżonej temperatury na ruch chloroplastów w protoplastach. Otóż, chłodzenie całych roślin przez okres kilkunastu godzin poprzedzających izolację, powodowało, iż ruch chloroplastów w protoplastach, do 1 doby po izolacji, odbywał się w sposób kontrolowany światłem, dokładnie tak jak w liściach. Jednak po rozpoczęciu przez protoplast regeneracji ściany komórkowej, bez względu na temperaturę, światło przestawało być czynnikiem kontrolującym ten proces. We współpracy z dr hab. Małgorzatą Lekką z Instytutu Fizyki Jądrowej PAN w Krakowie, w oparciu o mikroskop sił atomowych, wykazałam również różnice w elastyczności protoplastów otrzymanych z roślin poddanych działaniu chłodu oraz kontrolnych. Badania te zostały zrealizowane w ramach grantu KBN dla młodych naukowców, którym kierowałam, pt. „Mechanizmy ruchów chloroplastów w protoplastach Nicotiana tabacum: badania z użyciem Skaningowego Mikroskopu Sił”. W trakcie wykonywania pracy doktorskiej, oprócz badań nad kinetyką ruchów, zoptymalizowałam także trudną technikę barwienia fluorescencyjnego cytoszkieletu aktynowego w protoplastach i komórkach tytoniu. Było to możliwe dzięki odbytemu stażowi w zespole prof. Verbelena (por. wyżej). Różnice w układzie aktyny wizualizowałam zarówno z wykorzystaniem mikroskopu fluorescencyjnego, jak i konfokalnego. Wykazałam, że filamenty aktynowe, a nie mikrotubule, są bezpośrednio zaangażowane w kinetykę ruchu u tytoniu. Stwierdziłam wreszcie, że obecność ściany komórkowej jest ważna, lecz nie krytyczna w ruchu chloroplastów w protoplastach, gdyż brak ściany może być zastąpiony nieznanymi czynnikami indukowanymi przez działanie chłodu. Wyniki badań prowadzonych w ramach pracy doktorskiej zostały przeze mnie zaprezentowane na Europejskim Sympozjum Fotomorfogemetycznym w Berlinie (a4 i a5), konferencji Polskiego Towarzystwa Biologii Komórki w Krakowie (a1), a także na Kongresie Fotobiologicznym w San Francisco (a6). Prace wykonane po doktoracie Kontynuacja badań nad mechanizmami ruchów chloroplastów (prace A2 i A4) Po obronieniu pracy doktorskiej i otrzymaniu w roku 2001 zatrudnienia w Zakładzie Biochemii UR w Krakowie, przez pewien czas kontynuowałam, we współpracy z prof. Haliną Gabryś, badania dotyczące tematyki realizowanej w pracy doktorskiej. Po opracowaniu wyników doktoratu, w szczególności dotyczących elastyczności protoplastów, powstała praca opublikowana w Acta Physiologiae Plantarum (A2). Ponadto, optymalizowałyśmy jeszcze procedury barwienia aktyny w komórkach i liściach Nicotiana. Zdjęcie z mikroskopu konfokalnego, na którym uwidoczniłam przebieg włókien aktynowych w pojedynczej, regenerującej z protoplastu komórce tytoniu, zostało w roku 2006 nagrodzone przez producenta 17 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 znaczników fluorescencyjnych, renomowaną firmę Molecular Probes/Invitrogen (USA). Poza tym, było ono również głównym zdjęciem jednego z numerów elektronicznego biuletynu tej firmy (ProbesOnline Newsletter an Invitrogen Publication), rozsyłanego do ok. 40 000 osób miesięcznie. Wyniki dotyczące roli aktyny w fotoindukowanych światłem ruchach plastydów, w modelu regenerujących protoplastów tytoniu, znalazły się w pracy opublikowanej przez International Journal of Developmental Biology (A4). Analizy własności prozdrowotnych (prace A6, B6, N1, N2; abstrakty a2, a7, a15, a16 ) Badania nad własnościami prozdrowotnymi produktów pszczelarskich, roślin i suplementów diety, związane były z miejscem mojego zatrudnienia, jakim przez okres prawie 10-letni był Zakład Biochemii Wydziału Ogrodniczego Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie. Na początku roku 2001, zaraz po zatrudnieniu w/w jednostce, podjęłam się zadania wykonania niezbędnych analiz oraz przygotowania projektu grantowego KBN, pt. „Określenie i opracowanie parametrów charakteryzujących jakość jadu pszczelego oraz izolacja i charakterystyka peptydowych alergenów”. Praca nad przygotowaniem projektu była dla mnie dużym wyzwaniem, biorąc pod uwagę moje wcześniejsze doświadczenia, związane w głównej mierze z fotobiologią komórki roślinnej. Dzięki zaangażowaniu w przygotowanie projektu w bardzo szybkim tempie przyswoiłam techniki stosowane w laboratoriach biochemicznych, takie jak np. szybką chromatografię cieczową (FPLC). Projekt ten nie uzyskał jednak finansowania, pomimo wysokich ocen merytorycznych. W roku 2005, biorąc jako wykonawca udział w dwóch projektach współfinansowanych ze środków UE, przeprowadziłam frakcjonowanie metodą FPLC białek w ekstraktach miodów odmianowych (N1) i pyłków (N2). Badania te miały na celu ocenę aktywności antyutleniającej miodów oraz przydatności pyłku jako komponentu do produkcji parafarmaceutyków. Miodami o najwyższej aktywności antyutleniającej okazały się gryczany i wrzosowy. Z kolei pyłek okazał się cennym surowcem zwierającym wysoką ilość białek, łatwo przyswajalnych cukrów, oraz przeciwutleniaczy zarówno hydrofobowych (karotenoidy, tokoferole) jak i hydrofilowych (związki fenolowe). Wykonane analizy, zlecone przez Zrzeszenie Pszczelarzy „Apipol”, miały duże znaczenie praktyczne. Z produktami pszczelarskimi związane były również kilkumiesięczne analizy, które wykonywałam w roku 2008, w ramach ekspertyzy, pt. „Wstępne badania frakcji białkowych i melaninowych uzyskanych po obróbce martwych ciał pszczelich”. Wyniki tych badań zostały zaprezentowane przeze mnie na Kongresie EUROBIOTECH, w roku 2008, w Krakowie (a7). Własności antyutleniające związków fenolowych stały się przedmiotem moich kolejnych badań, realizowanych w ramach projektu MNiSW, kierowanego przez dr Annę Kostecką-Gugała, pt. ”Charakterystyka polskich odmian maliny i jeżyny pod względem zawartości antyoksydantów o działaniu prozdrowotnym”. Do realizacji tego grantu, w roku 2010, zostałam zaproszona jako wykonawca. Wyniki badań opisujące aktywność antyrodnikową ekstraktów pochodzących z kilkunastu polskich odmian malin i jeżyn takich zostały przedstawione w roku 2012, podczas konferencji „2nd International Conference and Workshop”, która miała miejsce w Lublinie (a15). 18 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 Odkrywając Callitriche cophocarpa do celów fitoremediacji chromu, trafiłam na bardzo ciekawe informacje o jej potencjalnych własnościach prozdrowotnych. Pochodziły one ze strony internetowej prowadzonej przez dr Henryka Różańskiego, zajmującego się fitoterapiami. W roku 2011 zaprojektowałam doświadczenie, którego celem była analiza zawartości związków fenolowych i karotenoidów oraz aktywności antyrodnikowej ekstraktów C. cophocarpa. Jako układ odniesienia wybrałam popularne, dostępne komercyjnie suplementy diety w postaci mikroglonów, takich jak Chlorella i Spirulina. Dzięki przeprowadzonym rozdziałom chromatograficznym z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz pomiarom spektrofotometrycznym, wykazałam wysoką zawartość pochodnych kwasów fenolowych (głównie kwasu synapinowego) oraz bogatą zawartość flawonoidów w roślinie. Dodatkowo, rzęśl cechowała się również stosunkowo wysoką zawartością luteiny i β-karotenu. Chlorella i Spirulina okazały się ubogim źródłem antyutleniaczy fenolowych i karotenoidowych. Analizy zawartości antyutleniaczy zostały również wzbogacone o pomiar aktywności antyrodnikowej ekstraktów metodami spektrofotometrycznymi oraz spektroskopii rezonansu magnetycznego (EPR). Uzyskane w tych badaniach wyniki ukazały się w druku w Episteme (B6) oraz Central European Journal of Chemistry (A6), a także zaprezentowane na wspomnianej już konferencji w Lublinie (a16) oraz, w roku 2013, na Ogólnopolskiej Ogrodniczej Konferencji Naukowej w Krakowie (a2). W mojej opinii, istnieje poważne merytoryczne i ekonomiczne uzasadnienie kontynuowania badań nad własnościami prozdrowotnymi C. cophocarpa. Bioremediacja i fitoremediacja Bioremediacja związków ropopochodnych przez mikroorganizmy (prace A3 i B1) Bioremediacja związków ropopochodnych oraz innych związków organicznych, jak np. formaldehydu, była głównym obszarem zainteresowań zespołu badawczego, którego byłam członkiem, pracując jako adiunkt w Zakładzie Biochemii Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie. Stąd też brałam udział w pracach doświadczalnych dotyczących wykorzystania potencjału metabolicznego unikatowej biocenozy złożonej z kilkudziesięciu gatunków bakterii i jednokomórkowych drożdży. Biocenoza ta, nazwana biopreparatem ZB-01, została opracowana przez prof. Henryka Kołoczka i dr hab. Pawła Kaszyckiego. Biopreparat ZB-01 znajdował bardzo szerokie zastosowanie. Używano go do rekultywacji środowiska gruntowo-wodnego, zanieczyszczonego m.in. produktami ropopochodnymi. Zespół współpracował z wieloma podmiotami gospodarczymi (np. Rafinerią w Trzebini), dlatego też jego prace oprócz aspektu czysto naukowego miały też realny wymiar aplikacyjny. Mój udział w pracach badawczych miał na celu wyznaczenie optymalnych parametrów stabilizacji biopreparatu. Opracowanie takich warunków wynikało z konieczności znalezienia skutecznych metod jego przechowywania, które byłyby uzasadnione naukowo i zarazem ekonomicznie. Jako warunki przechowywania biopreparatu wyznaczyłam magazynowanie go w niskiej temperaturze, tj. –20°C oraz –70°C. Oprócz tego zastosowałam również liofilizację, która wywoływała w komórkach stres 19 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 podwójny: gwałtownego zamrożenia (sublimację wody prowadziłam używając próbek poddanych działaniu ciekłego azotu) oraz dehydratację. W badaniach tych testowałam trehalozę − nieredukujący disacharyd o potwierdzonym literaturowo (przede wszystkim u bezkręgowców) przeciwdziałaniu stresowi wodnemu i temperaturowemu. Wyniki tej pracy zostały opublikowane w Acta Scientarum Polonorum, sekcja Biotechnologia (B1). Zastosowanie trehalozy pozytywnie wpływało na przechowywanie biopreparatu w obniżonej temperaturze. Biorąc jednak pod uwagę stosunkowo wysoki koszt trehalozy, na kolejnym etapie, działanie trehalozy porównałam z innymi, szeroko stosowanymi stabilizatorami komórek bakteryjnych: sacharozą, glicerolem i dimetylosulfotlenkiem (DMSO). Tym razem prowadzone eksperymenty zostały przeze mnie wzbogacone o analizy chromatograficzne metodą chromatografii gazowej (GC). We współpracy z dr Anną Białecką z Centrum Badań Mikrobiologicznych i Autoszczepionek w Krakowie dokonałam także identyfikacji mikroorganizmów poddanych działaniu stabilizatorów. Wyniki tej pracy wskazywały na to, iż zarówno trehaloza jak i sacharoza, utrzymywały bioróżnorodność biopreparatu i jego metaboliczny potencjał po półrocznym przechowywaniu, w postaci bezpośrednio zamrożonej w -20°C, jak i liofilizatów. Stosowanie sacharozy, która podobnie do trehalozy jest nieredukującym disacharydem, okazało się zatem bardziej ekonomicznie uzasadnione aniżeli znacznie droższej trehalozy. DMSO i glicerol nie sprawdziły się jako stabilizatory biopreparatu w testowanych warunkach. Wyniki tej pracy zostały opublikowane w Polish Journal of Environmental Studies (A3). Fitoremediacja związków metali (prace A5, A7, B2, B3, B4, B5; abstrakty a8, a9, a10, a11, a12, a13, a14, a16, a17, a18, a19, a20, a21, a22) Badaniom dotyczącym fitoremediacji związków metali ciężkich poświęciłam się, po odkryciu w roku 2008 niezwykłych zdolności fitoremediacyjnych rzęśli długoszyjkowej, co zostało przeze mnie opisane szczegółowiej w p. II C. Prace opisane w niniejszym podrozdziale mają w większości charakter wstępny w stosunku do analiz, których wyniki zostały zaprezentowane w ciągu publikacji składających się na osiągnięcie będące podstawą do ubiegania sie o stopień doktora habilitowanego. W roku 2009 po raz pierwszy wykazałam zdolności Callitriche cophocarpa do detoksyfikacji Cr(VI), przeprowadzając pomiary kinetyczne, z wykorzystaniem, wspomnianej już wcześniej, metody L-band EPR. Wspólnie z dr Anną Kostecką-Gugała mierzyłyśmy redukcję chromianów w czasie rzeczywistym, w pędach i korzeniach rośliny. Wyniki te zestawiłyśmy z podobnymi analizami, które przeprowadziłyśmy na fitoremediatorach, takich jak Eichhornia crassipess (hiacynt wodny) i Lemna minor (rzęsa drobna), stosowanych w praktyce biotechnologii oczyszczania wód. Wyniki tej pracy, wskazujące na wysoką efektywność redukcji chromianów przez pędy Callitriche, a zarazem na odmienne mechanizmy zaangażowane w redukcję Cr(VI) u trzech badanych gatunków, zostały opublikowane w Ochronie Środowiska i Zasobów Naturalnych (B2). Wyniki związane z opisaną powyżej tematyką zostały również w roku 2009 zaprezentowane przeze mnie na międzynarodowej konferencji Polskiego Towarzystwa Biologii Eksperymentalnej Roślin (PTBER) w Krakowie (a8), a także 20 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 na międzynarodowej konferencji organizowanej przez Instytut Ochrony Środowiska w Warszawie (a9). Najbardziej znaczącą pracą opisującą odkryty przeze mnie potencjał fitoremediacyjny rzęśli w stosunku do jonów chromu, była praca opublikowana w Chemosphere (A5), w roku 2010. Przedstawione w tej publikacji badania obejmowały: testy akumulacji Cr z roztworów Cr(VI) o stężeniu 50 (2,6 mg dm-3) do 700 µM (36,4 mg dm-3), wyznaczenie BCF, analizy fluorescencji chlorofilu oraz zawartości barwników fotosyntetycznych w warunkach stresu, a także analizy morfologii pędów. Te ostatnie testy przeprowadziłam, między innymi, poprzez zastosowanie metody mikroskopii sił atomowych (AFM). Badania topografii liści metodą AFM wykonałam wspólnie z dr hab. Małgorzata Lekką z Instytutu Fizyki Jądrowej PAN w Krakowie, z którą wcześniej prowadziłam już współpracę, mierząc elastyczność protoplastów tytoniu. Najważniejszym osiągnięciem zaprezentowanym w opisanej publikacji było udowodnienie zdolności rzęśli do hiperakumulacji Cr w pędach, w warunkach laboratoryjnych. Rośliny poddane przez 3 tygodnie działaniu Cr(VI) o wyjściowym stężeniu 50 µM (2,6 mg dm-3), posiadały kondycję fizjologiczną porównywalną z roślinami kontrolnymi. Jednocześnie, akumulowały Cr w ilości > 1000 mg kg-1 s.m. Ciekawym podsumowaniem przeprowadzonych eksperymentów było również stwierdzenie przydatności metody AFM do wczesnego wykrywania wpływu stresu abiotycznego na rośliny wodne. Zastosowanie AFM umożliwiało pomiar pierwszych zmian w topografii epidermy rośliny już po 1 dniu inkubacji pędów w Cr(VI). Pierwsze zauważalne zmiany w poddanych działaniu Cr(VI) preparatach liści Callitriche, z wykorzystaniem mikroskopii konwencjonalnej (świetlnej), były obserwowane dopiero po 5 dniach inkubacji. W roku 2010 wyniki swoich badań zaprezentowałam również na międzynarodowej konferencji poświęconej bio/fitoremediacji, która odbyła się w Pizie, we Włoszech (a10). Celem pracy B3, która ukazała się w roku 2011 w Ochronie Środowiska i Zasobów Naturalnych, było wykazanie korelacji pomiędzy zdolnością pędów rzęśli do akumulacji Cr, a ich aktywnością metaboliczną. Ta ostatnia określana była poprzez pomiar zawartości związków fenolowych w oparciu o metody chromatograficzne (HPLC) oraz pomiar aktywności PSII. Eksperymenty przeprowadzone w trakcie realizacji powyższej pracy przyniosły bardzo ciekawe wyniki. Otóż, rośliny pozyskiwane latem, cechowały się najwyższą zdolnością do akumulacji chromu. Były jednak najbardziej podatne na jego toksyczne oddziaływanie. Z kolei, pędy Callitriche zebrane jesienią posiadały najwyższą odporność, przy jednocześnie najniższej zdolności do fitoekstrakcji tego pierwiastka. Pędy jesienne zawierały również wysoki poziom ochronnych związków fenolowych. Kontynuacją badań nad aktywnością fizjologiczną rzęśli poddanej działaniu Cr zajęłam się także w kolejnej pracy, opublikowanej w tym samym czasopiśmie i roku, co praca opisana powyżej (B4). Tym razem, wspólnie z dr Anną Kołton z mojej macierzystej jednostki i dr Andrzejem Waloszkiem z UJ, testowaliśmy wpływ dwóch specjacji Cr: Cr(III) i Cr(VI) na szereg parametrów jasnej fazy fotosyntezy, zawartość barwników fotosyntetycznych oraz morfologię pędów. Przeprowadziliśmy również wizualizację przestrzennego rozkładu parametru Fv/Fm. W pracy tej stwierdziliśmy istotną korelację pomiędzy niektórymi parametrami fotosyntezy a specjacją Cr. Rośliny poddane działaniu Cr(VI) wykazywały w porównaniu 21 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Załącznik 2 z kontrolą istotny spadek zawartości chlorofilu a oraz znaczące zmniejszenie wydajności świetlnej fazy fotosyntezy. Przy zastosowanym stężeniu Cr (tj. 1 mM, czyli 52 mg dm-3) wykazaliśmy jedynie nieznaczną toksyczność Cr(III) w stosunku do pędów rzęśli. W roku 2011 wyniki swoich prac przedstawiłam również na międzynarodowej konferencji PTBER we Wrocławiu (a11) oraz na międzynarodowej konferencji organizowanej przez Instytut Ochrony Środowiska w Warszawie (a12). Z kolei, w roku 2012, wyniki badań nad wpływem Cr(III) i Cr(VI) na C. cophocarpa, przedstawiałam podczas międzynarodowej konferencji organizowanej przez International Phytotechnology Society (IPS), w Hasselt, w Belgii (a13). Zostały one także zaprezentowane na Europejskiej Konferencji Spektroskopii Promieniowania X, która odbyła się we Wiedniu (a14). Ostatnią publikacją w moim dotychczasowym dorobku, w której podjęłam się wyjaśnienia mechanizmów oddziaływania Cr na C. cophocarpa jest praca opublikowana w Acta Physiologiae Plantarum (A7). Zamieszczone w niej badania dotyczyły mechanizmu oddziaływania Cr(VI) i Cr(III) na epidermę liści rośliny, która stanowi pierwszą barierę na styku z zanieczyszczonym, wodnym środowiskiem. Do realizacji badań zaprosiłam dr hab. Małgorzatę Lekką (IFJ PAN w Krakowie) oraz dr Pawła Wróbla (AGH). W pracy tej, w oparciu o wspominane już metody mikroskopii sił atomowych oraz rentgenowskiej spektroskopii fluorescencyjnej, wykazaliśmy ważne korelacje pomiędzy: 1) elastycznością epidermy i poziomem akumulacji chromu oraz, 2) elastycznością epidermy i zawartością wapnia. Po raz kolejny został udowodniony odmienny wpływ Cr na roślinę, ściśle zależny od jego specjacji. Otóż, w stosunku do kontroli, liście poddane działaniu Cr(III) akumulowały go znacznie więcej, jednocześnie ich epiderma wykazywała zwiększoną elastyczność. Ten spadek sztywności był związany z równoczesnym obniżeniem poziomu Ca. Z drugiej strony, liście roślin inkubowanych w Cr(VI) wykazywały spadek elastyczności przy jednoczesnym wzroście poziomu Ca. Interpretując uzyskane wyniki oparłam się na odmiennych własnościach chemicznych tych dwóch form chromu w roztworze. Wskazałam na hipotetyczną możliwość wypierania Ca2+, sieciującego polisacharydy ścian komórkowych, przez kationy Cr3+. Oprócz opisanej powyżej publikacji oryginalnej, wyniki badań, którym poświęciłam się w latach 2013 i 2014, zostaną przeze mnie zaprezentowane na międzynarodowej konferencji fitoremediacyjnej, organizowanej przez International Phytotechnology Society, w Heraklionie, w Grecji (abstrakty a20, a21, a22). Poza pracami nad fitoremediacją związków chromu przez rzęśl długoszyjkową, uczestniczyłam również w eksperymentach poświęconych oddziaływaniu tego pierwiastka na mięsożerną, wyższą roślinę wodną Utricularia gibba (pływacz karłowaty). Wyniki tych badań, dotyczących kondycji fizjologicznej pędów i pułapek rośliny zostały przeze mnie przedstawione w roku 2013 podczas konferencji PTBER w Łodzi (a18), a obecnie są w fazie przygotowań do druku. Dodatkowo, uczestniczyłam również w opracowywaniu wyników badań nad pochodzącymi z kultur in vitro metalofitami (m.in. z rodzaju Alyssum), stosowanymi do fitoremediacji gleb zanieczyszczonych związkami kadmu, cynku i ołowiu (abstrakty a17 i a19). W publikacji B5 znaleźć można przegląd prac dotyczących wykorzystania organizmów autotroficznych w remediacji środowiska skażonego pierwiastkami metalicznymi. 22 Joanna Augustynowicz Autoreferat / Zatqcznik 2 PODSUMOWANIE NAJWAZNIEJSZYCH OSIAGNI^C Moj dorobek naukowy obejmuje: 18 prac eksperymentalnych (po doktoracie 17), z tego 11 z listy filadelfijskiej, 1 prac^ przeglqdow^ (po doktoracie 1). W 83% wymienionych publikacji jestem pierwszym autorem, z czego we wszystkich posiadajgcych IF. Ponadto, w moim dorobku naukowym znajdujq siQ 22 doniesienia konferencyjne (po doktoracie 17), 2 referaty ustne (po doktoracie 1), udziat w 13 konferencjach (po doktoracie 10), kierownictwo 2 grantow (po doktoracie 1), wykonawstwo w 6 (po doktoracie w 5), w tym 2 wspotfinansowanych ze srodkow UE, oraz 4 nagrody za dziatalnosc naukowq (wszystkie po doktoracie). Po uzyskaniu stopnia doktora bratam rowniez udziat w opracowaniu 2 skryptow, 6 ekspertyz, 5 prac popularno-naukowych, bytam promotorem 9 prac dyplomowych (2 magisterskich i 7 inzynierskich), zostatam promotorem pomocniczym 1 rozprawy doktorskiej. Wygtositam takze 9 referatow/wyktadow popularyzujqcych wiedzQ oraz wykonatam 10 recenzji publikacji (wszystkie z listy filadelfijskiej). Sumaryczny IF wszystkich moich publikacji, zgodny z rokiem wydania, wynosi 21,100 (po doktoracie 17,521), suma punktow MNiSW 285 (po doktoracie 264). Wg aktualnych wykazow dane te wynoszq: IF 24,160 (po doktoracie 19,025), suma punktow MNiSW 342 (po doktoracie 297). 23
