Termin „klonowanie” kojarzy się zwykle z tworzeniem idealnych
advertisement
Termin „klonowanie” kojarzy się zwykle z tworzeniem idealnych kopii całego organizmu. Istnieje jednak inny rodzaj tej techniki, który polega na powielaniu samego materiału genetycznego. Jest to proces bazujący na replikacji DNA, w którym pożądana sekwencja zostaje namnożona dzięki podziałom mitotycznym komórek gospodarza lub bezpośredniemu kopiowaniu zawierającego ją wektora. Metoda ta pozwala na izolację oraz powielenie konkretnych genów w celu poddawania ich dalszym analizom. Określenie roli kodowanych białek lub fragmentów RNA umożliwia identyfikację funkcji klonowanych sekwencji oraz wykrycie ich ewentualnych mutacji, prowadzących do powstawania defektów związanych z konkretnymi chorobami. Dzięki tej technice można także modyfikować organizm gospodarza i nadawać mu pożądane cechy takie jak zdolność do produkcji insuliny, odporność na owady… itp. Aby przeprowadzić klonowanie molekularne potrzebny jest odpowiedni fragment DNA, czyli sekwencja którą zamierzamy powielić. Najczęściej jest ona wyizolowywana z komórek dawcy lub chemicznie syntetyzowana z wykorzystaniem techniki PCR, czyli Łańcuchowej Reakcji Polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction). Użyty odcinek DNA może pochodzić od dowolnego organizmu. Musi on jednak zostać połączony z odpowiednim nośnikiem, zdolnym do autonomicznej replikacji w komórkach biorcy. Tak zwany wektor klonujący jest jednym z typów wektora genetycznego, czyli sztucznie skonstruowanej cząsteczki DNA, przeznaczonej do przenoszenia dodatkowych informacji genetycznych. W klonowaniu wykorzystuje się głównie wektory plazmidowe i wirusowe, zapewniające powielanie obcego DNA w organizmie gospodarza. Dobry wektor powinien być przekazywany jedynie z komórek macierzystych do potomnych. W jego strukturę wprowadza się również silny promotor warunkujący wysoką ekspresję oraz syntetyczny nukleotyd rozpoznawany przez różne enzymy restrykcyjne, czyli inaczej polilinker (ang.Multiple Cloning Sites - MCS). Umożliwia on wbudowanie w strukturę nośnika fragmentu przeznaczonego do klonowania - insertu lub inaczej wstawki. Wektor jest również zaopatrzony w sekwencje markerowe, np. geny odporności na antybiotyki umożliwiające selekcję transformantów. Może on również zawierać geny reporterowe, warunkujące charakterystyczny wygląd komórek, np. niebieskie zabarwienie wywołane obecnością β-galaktozydazy. Żaden z wprowadzanych genów nie może być jednak szkodliwy dla organizmu biorcy. Gospodarzem mogą być szczepy bakteryjne, drożdżowe lub eukariotyczne linie komórkowa o ściśle określonym i odpowiednio zmodyfikowanym genotypie. Wybór eukariotycznego gospodarza wiąże się z użyciem wektora zdolnego do replikacji w tym organizmie. Najczęściej stosuje się komórki bakteryjne, gdyż ich hodowla jest mało kłopotliwa i umożliwia wyizolowanie dużej ilości DNA oraz produktu białkowego. Bakterie trzeba jednak wcześniej wprowadzić na drogę kompetencji, czyli pobudzić ich zdolności do pobierania plazmidów z otoczenia. Można tego dokonać za pomocą indukcji chemicznej, np. poprzez traktowanie E. coli chlorkiem wapnia. Uproszczony schemat procesu klonowania DNA obejmuje cztery podstawowe etapy: 1. fragmentacja - przeznaczony do klonowania odcinek DNA musi zostać pocięty za pomocą odpowiednich restryktaz. Jest to klasa enzymów przecinających nici DNA w miejscach wyznaczonych przez sekwencje nukleotydowe o symetrycznym charakterze. Każdy enzym tnie tylko ściśle określony układ zasad azotowych, co warunkuje jego wysoką specyficzność. 2. ligacja - te same enzymy wykorzystuje się do cięcia wektora klonującego, dzięki czemu uzyskuje się na nim końce komplementarne do klonowanej sekwencji. Mogą one następnie zostać połączone za pomocą ligazy DNA. 3. transfekcja - uzyskane w ten sposób hybrydowe cząsteczki DNA wprowadza się do komórek biorcy, np. miesza się je z bakteriami o wzbudzonej kompetencji. Gospodarz powinien zapewnić ekspresję oraz namnażanie klonowanego fragmentu. 4. selekcja - dzięki genom odporności na antybiotyki, bakterie, które pochłonęły plazmid, mogą rosnąć na różnicujących pożywkach. W ten sposób selekcjonuje się uzyskane klony. Stransformowane bakterie tworzą na pożywkach kolonie, a każda z nich zawiera taki sam plazmid, czyli to samo DNA. Komórki w różnych koloniach mają różne plazmidy, a zatem zawierają różne DNA. W przypadku transformacji bakterii plazmidami zawierającymi geny warunkujące oporność na antybiotyki, ich wysianie na płytki selekcyjne należy poprzedzić inkubacją na zwykłej pożywce. Pozwala to na pobudzenie aktywności genu markerowego. Uzyskane klony należy również sprawdzić pod kątem obecności zrekombinowanego genu. W tym celu wykorzystuje się reakcję PCR przeprowadzaną na plazmidzie wyizolowanym lizą alkaliczną lub strawionym odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. O obecności klonowanego genu świadczy uzyskanie fragmentów DNA o określonej długości.
