kultury in vitro Plik

1
2
Wyróżniamy dwie drogi morfogenezy w kulturach in vitro: bezpośrednią i pośrednią.
W pośredniej morfogenezie obserwujemy tworzenie się tkanki kalusowej, z której
mogą rozwijad się rośliny lub na jej powierzchni powstają zarodki somatyczne, a
dopiero potem rośliny. W organogenezie bezpośredniej nie ma stadium kalusa i na
powierzchni eksplantatu tworzą się np. najpierw zarodki somatyczne (bezpośrednia
somatyczna embriogeneza) lub rozwija się roślina.
3
4
5
Do uwalniania roślin od szczególnie uporczywych patogenów stosuje się głównie hodowle
merystemów wierzchołkowych pędów.
Używając tego terminu, mamy na myśli bardzo drobne eksplantaty, wielkości 0,2 – 3 mm, zwykle
poniżej 1 mm, zawierające tylko merystem wierzchołkowy pędu i ewentualnie kilka najmłodszych
zawiązków liściowych.
W przypadku większych eksplantatów, wyraźnie widocznych gołym okiem mówilibyśmy po prostu o
hodowlach wierzchołków pędów.
Jak wspomniano wyżej, hodowle wierzchołków pędów prowadzone są często jako forma
mikrorozmnażania roślin, natomiast powodem do prowadzenia hodowli merystemów
wierzchołkowych pędów (bardziej kłopotliwych i trudniejszych do założenia) jest fakt, że merystemy
te zwykle nie zawierają wirusów i innych fitopatogenów, i to nawet wtedy gdy patogeny te
opanowały już pozostałe tkanki rośliny. Może się też zdarzyd, że merystemy wierzchołkowe
zawierają niewielkie ilości patogenów i pozbywają się ich podczas kultury.
Termoterapia to traktowanie roślin podwyższoną temperaturą (32 – 40°C) przez kilka dni do kilku
miesięcy.
W chemioterapii wykorzystuje się analogi roślinnych metabolitów, zwane antymetabolitami
(substancje przypominające naturalne produkty przemiany materii, zwłaszcza nukleotydy, ale nieco
się od nich różniące; wirusy czasami tej drobnej różnicy „nie zauważają”, na swoją zgubę –
antymetabolity zakłócają cykl rozwojowy wirusów, głównie przez wbudowywanie się do ich
genomów).
Elektroterapia to wykorzystanie impulsów pola elektrycznego do leczenia chorób wirusowych.
uwalnianie od wirusów
6
więcej
Możliwe są dwa zasadnicze kierunki rozwoju androgenicznego:
bezpośredni rozwój mikrospory w zarodek,
pośredni - polega na podziałach mikrospory prowadzących do rozwoju kalusa i dopiero z niego
ewentualnie powstanie roślina. Ten wariant jest mniej pożądany, gdyż rośliny pochodzące z kalusa
mają zwykle zróżnicowaną liczbę chromosomów.
Kultury izolowanych pylników i mikrospor służą do indukowania procesu androgenezy i uzyskania
roślin haploidalnych Androgeneza jest procesem rozwoju rośliny z gametofitu męskiego. U roślin
wyższych proces taki można indukowad przez poddanie pylników lub izolowanych mikrospor
kulturze na sztucznej pożywce in vitro.
Rośliny androgeniczne są najczęściej haploidami. Stąd też konieczne jest podwojenie liczby
chromosomów, w celu uzyskania linii DH (doubled haploid) - homozygotycznych. Do tego celu
stosujemy kolchicynę na etapie kultury in vitro lub na rośliny haploidalne in vivo.
Linie podwojonych haploidów mają szerokie zastosowania zarówno w badaniach podstawowych, jak i
programach hodowlanych.
Są przydatne między innymi przy mapowaniu genów, analizach genetycznych, indukowaniu mutacji,
transformacji, somatycznej hybrydyzacji.
W kulturze pylników lub mikrospor otrzymano rośliny haploidalne i podwojone haploidy (DH) u
kilkuset gatunków dzikich i uprawnych, jednakże są stosowane na szeroką skalę u kilku rodzajów:
Solanaceae, Poaceae, Brassica
7
powrót
Na schemacie w pierwszej cześci (A) przedstawiono normalną gametofityczną drogę
rozwoju pyłku (przypomnij sobie wiadomości z Botaniki oraz I zjazdu Genetyki”.
Poniżej (B) jednojądrowe ziarno pyłku (EM) podlega silnej wakuolizacji (SM), jądro
przechodzi podziały mitotyczne dając wielokomórkowe struktury w obrębie ziarna
pyłku (MCS). Następnie struktury rozrywają egzynę, wydostają się na zewnątrz (do
środowiska kultury in vitro) cały czas się dzieląc formują zarodkopodobne struktury
(ELS). Struktuy te rozwijają się potem w haploidalne rośliny. W przypadku procesu
adrogenezy mówimy w takim przypadku o zmianie drogi rozwoju pyłku z
gametofitycznego na sporofityczny. W trakcie prowadzenie kultury częśd mikrospor
zamiera (C).
8
9
Na ekranie widzisz proces gynogenezy u żyta, po pobudzeniu komórki jajowej do
rozwoju w zarodek po przepyleniu pyłkiem kukurydzy.
• – nasiona z zarodkami po skrzyżowaniu żyta z pszenicą
• odseparowane z kłosa nasiona
• Sterylizacja materiału
• Wyizolowane zarodki po sterylizacji
• rozwijające się zarodki w haploidalne rośliny i brak regenracji
• Haploidalne rośliny żyta uzyskane na drodze gynogenezy
• Uwaga Powrót do slajdu 45
10
Dzięki wykorzystaniu podwojonych haploidów w hodowli roślin, czas niezbędny do
otrzymania nowej odmiany uległ skróceniu, bo skrócił się okres wyprowadzania
czystych linii (można to obecnie osiągnąd w ciągu roku). Pozostaje jednak koniecznośd
przeprowadzenia agrobotanicznej oceny wyselekcjonowanych form i to w kilku
pokoleniach, w związku z tym cykl hodowany nadal trwa kilka lat (np. 4), lecz nie
około dziesięciu, jak to jest przy stosowaniu metod bardziej tradycyjnych.
11
W centrach merystematycznych (a) utworzonych w kalusie mogą powstawad
przybyszowe korzenie, pędy (b), liście i kwiaty oraz przybyszowe zarodki.
Organogeneza w kulturach kalusa jest regulowana głównie proporcją
auksyn do cytokinin w pożywce.
Kalus pod względem genetycznym jest tkanką niestabilną, występują w nim zarówno
zmiany chromosomów, jak i struktury chromosomów. W czasie długotrwałej hodowli
kalusa, zmiany zachodzące w materiale genetycznym kumulują się prowadząc do
postępującej utraty totipotencji komórek. Aby przedłużyd zdolnośd do regeneracji
stosuje się różne regulatory wzrostu dodawane do pożywki.
Pożywka wykorzystywana do kultury kalusa może byd:
zestalona (agarowa) - sprzyja wcześniejszemu różnicowaniu się
komórek kalusa,
płynna - mechanicznie wytrząsane kultury kalusowe w na pożywkach
płynnych nazywane są zawiesinami komórek.
12
13
14
15
16