Targeting acetylation and deacetylation in Rheumatoid Arthritis
advertisement
Acetylacja białek w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Wpływ inhibitorów deacetylaz białkowych na przeżywalność komórek THP-1 i ludzkich pierwotnych makrofagów. Aleksander Grabiec 12 czerwca 2007 Promotor: dr hab. Joanna Bereta Doświadczenia przeprowadzono w laboratorium Dr Krisa Reedquista Division of Clinical Immunology and Rheumatology Academic Medical Center University of Amsterdam, The Netherlands Reumatoidalne zapalenie stawów (RA) • Choroba autoimmunologiczna charakteryzująca się chronicznym stanem zapalnym stawu prowadzącym do trwałego uszkodzenia kości i chrząstki • Dotyka ok. 1% populacji • Patofizjologia związana z akumulacją aktywowanych komórek układu immunologicznego w stawie Biologiczna rola acetylacji i deacetylacji Modyfikacje struktury chromatyny odgrywają kluczową rolę w regulacji ekspresji genów: – W stanie spoczynku DNA ciasno owinięte wokół oktameru histonów –zamknięta konformacja chromatyny – wyciszona ekspresja genów – Aktywacja komórki – histony ulegają acetylacji (acetylotransferazy histonów, HATs) – otwarta konformacja chromatyny – inicjacja transkrypcji genów – Usunięcie grup acetylowych przez deacetylazy histonów kondensacja chromatyny i wyciszenie genów – Acetylacja odgrywa kluczową rolę w stymulacji ekspresji genów promujących rozwój stanu zapalnego Peter J. Barnes, 2006 Deacetylacja białek nie-histonowych • • • • NF-B p53 JAK/STAT FoxO Ścieżki transdukcji sygnału regulowane przez odwracalną acetylację są substratami dla: deacetylaz histonów (HDACs) sirtuin – rodzina deacetylaz zależnych od NAD Ścieżki sygnałowe, których aktywacja/modulacja jest istotna dla promocji stanu zapalnego i przeżycia komórki w RA są regulowane przez odwracalną acetylację Acetylacja w stanie patologicznym – astma • Wzmożona aktywność HAT i zredukowana aktywność HDAC w drogach oddechowych pacjentów chorujących na astmę • Normalna aktywność HAT i HDAC w PBMC Zmiany aktywności HAT i HDAC pojawiają się lokalnie w drogach oddechowych prowadząc do rozwoju chronicznego stanu zapalnego Peter J. Barnes, 2004 Deacetylazy histonów jako nowy cel terapeutyczny w leczeniu RA? Analiza wpływu inhibitorów deacetylaz histonów na komórki istotne w patofizjologii RA oraz na zwierzęce modele RA: In vitro: – Uczulają synowiocyty (FLS) na apoptozę indukowaną przez TRAIL (Jungel et al., Annals of the Rheumatic diseases, 2006) – Blokują produkcję metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej (MMPs) przez ludzkie chondrocyty (Young et al., Arthritis Research and Therapy, 2005) In vivo: – Hamują zapalenie stawów indukowane adjuwantem u szczurów (Chung et al., Molecular therapy, 2003) – Hamują zapalenie stawów indukowane autoprzeciwciałami u myszy (Nishida et al., Arthritis and Rheumatism, 2004) Cele badawcze • Jaki jest poziom acetylacji białek w błonie maziowej pacjentów z RA? – Czy występują różnice w poziomie acetylacji pomiędzy różnymi komórkami w obrębie błony maziowej? – Czy te różnicę są związane z konkretnymi typami komórek? • Czy inhibitory deacetylaz białkowych mogą wywoływać apoptozę w komórkach istotnych w patofizjologii RA? • W jaki sposób zahamowanie aktywności deacetylaz wpływa na produkcję cytokin prozapalnych? Hiperacetylacja białek jądrowych w błonie maziowej pacjentów z RA Pacjent 2 Pacjent 1 kontrola acetylowana lizyna CD3 Czy różnice w stopniu acetylacji białek jądrowych są związane z konkretnym typem komórek? Podwójne barwienie immunofluorescencyjne błony maziowej pacjentów z RA: • • Zielone barwienie – acetylowana lizyna Czerwone barwienie – markery powierzchniowe komórek: – – – – – CD3 – limfocyty T CD22 – limfocyty B CD55 – FLS CD68 makrofagi CD163 CD3 CD22 CD55 CD68 CD163 kontrola Analiza ilościowa podwójnego barwienia immunofluorescencyjnego % komórek wykazujących hiperacetylację 60 • Podwójne barwienie wycinków tkanek pochodzących od 4 pacjentów z RA 50 40 • Analiza ilości jąder komórkowych wykazujących hiperacetylację przypadających na 100 komórek każdego typu 30 20 10 0 CD3 CD22 CD55 CD68 CD163 Hiperacetylacja białek występuje głównie w makrofagach i synowiocytach błony maziowej Czy zahamowanie aktywności deacetylazowej wpływa na przeżywalność komórek in vitro? Komórki: – THP-1 – ludzka białaczkowa linia monocytarna – Ludzkie pierwotne makrofagi trichostatyna A 24-godzinna inkubacja z inhibitorami deacetylaz: – trichostatyna A – antybiotyk przeciwgrzybiczy wykazujący aktywność cytostatyczną, specyficzny inhibitor aktywności HDAC – nikotynoamid – inhibitor sirtuin nikotynoamid Pomiar apoptozy – barwienie aneksyną V sprzęgniętą z FITC, kontrbarwienie jodkiem propydyny analiza cytometryczna Czy zahamowanie aktywności deacetylazowej wpływa na przeżywalność komórek in vitro? Nic [mM] TSA [μM] 20 10 5,0 2,0 0,25 35 30 25 20 15 10 5 0 medium 10 20 5,0 % kom. apoptotycznych TSA [μM] 2,0 1,0 0,5 0,25 0,1 medium % kom. apoptotycznych 35 30 25 20 15 10 5 0 1,0 makrofagi THP-1 Nic [mM] TSA i nikotynoamid indukują apoptozę w komórkach THP-1 i ludzkich makrofagach Jak zahamowanie aktywności deacetylazowej wpływa na pro-apoptotyczne właściwości TNFα? 30 25 makrofagi % kom. apoptotycznych % kom. apoptotycznych THP-1 medium TNF 10 ng/ml 20 15 10 5 0 med 0,1 0,25 0,5 TSA [M] 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 medium TNF 10 ng/ml med 1,0 2,0 TSA [M] Koinkubacja z TNFα: – uczula ludzkie makrofagi na apoptozę indukowaną inhibitorami deacetylaz – zwiększa pro-apoptotyczne właściwości inhibitorów deacetylaz w komórkach THP-1 Jaki jest molekularny mechanizm apoptozy indukowanej przez inhibitory deacetylacji białek? Hipoteza: Trichostatyna A i nikotynoamid modulują profil ekspresji genów pro- i anty-apoptotycznych Metoda: MLPA – multiplex ligation-dependent probe amplification : – Umożliwia oszacowanie ilości kopii 40 różnych sekwencji DNA – Amplifikacja genów bezpośrednio zaangażowanych w regulację apoptozy – Ilość każdego produktu amplifikacji odzwierciedla względną ilość kopii analizowanej sekwencji docelowej Zasada działania testu MLPA gene A Odwrotna transkrypcja gene A hemi-probe A’ PCR primer sequence X A A’ hybridization sequences PCR primer sequence X Para pół-sond hybrydyzuje z przylegającymi sekwencjami docelowymi gene B gene A ligacja PCR primer sequence Y stuffer sequence B B B’ hybridization sequences Hybrydyzacja sondy PCR primer sequence Y stuffer sequence A hemi-probe B’ hemi-probe B cDNA gene B Struktura sondy: hemi-probe A mRNA gene B primer X primer X primer Y primer Y ligation product A ligation product B Reakcja PCR wykorzystująca jedną parę starterów dla wszystkich produktów ligacji Product A Product B Produkt amplifikacji ma unikalną długość dla każdego genu, ilość produktu reprezentuje względną ekspresję analizowanego genu TSA i nikotynoamid regulują ekspresję genów pro- i antyapoptotycznych w komórkach THP-1 Geny anty-apoptotyczne: Bcl-2 A1/Bfl-1 0.8 relative expression relative expression 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 medium TSA 0.6 0.4 0.2 0.0 Nic medium TSA Nic Geny pro-apoptotyczne: Bmf MAP-1 1.25 relative expression relative expression 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 medium TSA Nic 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 medium TSA Nic Potwierdzenie zmiany profilu ekspresji genów na poziomie białka stabilizujące potencjał błony mitochondrialnej) A1 Bmf Actin – Zarówno TSA jak i, w mniejszym stopniu, nikotynamid indukują ekspresję pro-apoptotycznego białka Bmf (białko z rodziny BH3-only, indukuje apoptozę przez inaktywację Bcl-2) Nic 20 mM medium – Nikotynamid powoduje obniżenie ekspresji anty-apoptotycznego białka A1 (białko z rodziny Bcl-2, TSA 1 μM W komórkach THP-1: Jaki jest molekularny mechanizm apoptozy indukowanej przez inhibitory deacetylacji białek? Hipoteza: TSA i nikotynoamid regulują ekspresję genów pro- i antyapoptotycznych poprzez indukcję hiperacetylacji białek niehistonowych Metoda: – Liza makrofagów stymulowanych TSA i nikotynoamidem – Analiza western blotting – przeciwciała przeciwko acetylowanej lizynie B 37,8 37,8 30,9 30,9 17,2 17,2 24 h 240’ 120’ 60’ Nic 20 mM 30’ medium 24 h 240’ 120’ 60’ TSA 2 μM 30’ medium A 25 med TNF 10 ng/ml 20 15 10 5 0 med 1,0 2,0 TSA [μM] 10 20 Nic [mM] 2.5 stężenie IL-6 [ng/ml] stężenie TNFα [ng/ml] Analiza wpływu inhibitorów deacetylaz na profil ekspresji cytokin prozapalnych med TNF 10 ng/ml 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 med 1,0 2,0 TSA [μM] 10 20 Nic [mM] Zahamowanie aktywności deacetylazowej nie wpływa na produkcję IL-6 i TNFα przez niestymulowane makrofagi Inhibitory deacetylaz hamują indukowaną TNFα produkcję IL-6 i TNFα przez makrofagi Wnioski • Białka jądrowe ulegają hiperacetylacji w błonie maziowej pacjentów z RA, przy czym wysoki poziom acetylacji charakteryzuje przede wszystkim makrofagi i synowiocyty • Inhibitory deacetylacji indukują apoptozę w komórkach THP-1 i ludzkich makrofagach oraz uczulają komórki na apoptozę indukowaną TNFα • Apoptozie indukowanej przez inhibitory deacetylaz nie towarzyszy stymulacja produkcji cytokin prozapalnych – TSA i nikotynoamid obniżają produkcję IL-6 i TNF przez aktywowane makrofagi Inhibitory deacytelaz białkowych ze względu na swoje pro-apoptotyczne i przeciwzapalne właściwości mogą wykazywać wysoki potencjał terapeutyczny w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów
