Streszczenie Rak jelita grubego (RJG) jest istotnym problemem
advertisement
Streszczenie Rak jelita grubego (RJG) jest istotnym problemem zdrowotnym. Pod względem częstości występowania w grupie nowotworów w Polsce rak ten zajmuje obecnie trzecie miejsce zarówno u mężczyzn, jak i u kobiet. Ponadto, obserwuje się stały trend wzrastającej zachorowalności na ten nowotwór złośliwy. Przeprowadzone dotychczas badania mikroskopowe, dotyczące zmian splotozwojów jelitowego układu nerwowego (ENS), zachodzących pod wpływem raka naciekającego ścianę jelita grubego, wykazały zmiany morfologiczne splotozwojów oraz zmiany w lokalizacji różnych neuropeptydów, w tym galaniny. Ludzka galanina (Gal) jest 30-aminokwasowym neuropeptydem występującym w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym, a także w tkankach obwodowych. Obecność Gal oraz jej receptorów wykazano także w tkance RJG, sugerując rolę Gal w rozwoju i progresji tego nowotworu. Ponadto, zaobserwowano znamienny wzrost stężenia Gal w surowicy krwi koreańskich chorych na RJG w porównaniu do osób zdrowych. Celem badań było ustalenie stężenia Gal w surowicy krwi chorych na RJG w populacji polskiej a także sprawdzenie czy ściana jelita grubego lub tkanka guza RJG wydzielają istotne ilości Gal, poprzez wykonanie pomiaru jej zawartości w homogenatach poszczególnych warstw ściany jelita grubego zawierających splotozwoje oraz oddzielnie w samej tkance nowotworu. Założono także przeprowadzenie analizy morfometrycznej występowania Gal przy pomocy metody immunohistochemicznej w warstwach ściany jelita grubego zawierających splotozwoje ENS w bezpośredniej bliskości i odlegle od nacieku nowotworowego. Materiał do badań stanowiła krew pobrana od 68 chorych na RJG oraz od 39 zdrowych ochotników. Od 31 chorych na RJG pobrano pooperacyjny materiał tkankowy. Z odpowiednio rozdzielonych części ściany jelita przygotowano homogenaty tkankowe. Metodą immunoenzymatyczną (ELISA) wykonano pomiar stężenia Gal w surowicy krwi w grupie badanej i w grupie kontrolnej oraz pomiar zawartości Gal w poszczególnych warstwach ściany jelita grubego oraz w tkance nowotworowej. Z wycinków pełnej ściany jelita przygotowano, po uprzednim utrwaleniu w 4% roztworze formaliny, skrawki parafinowe o grubości 5 µm, w celu wykrycia Gal oraz komórek stanu zapalnego (neutrofili i makrofagów) metodą immunohistochemiczną, zaś na skrawkach mrożeniowych wykonano potrójne barwienia immunofluorescencyjne w celu wykazania koekspresji kaspazy 3, kaspazy 8 i Gal. Wykazano, że średnie stężenie Gal w surowicy chorych na RJG wyniosło 119.47 pg/ml i było istotnie wyższe od średniego stężenia neuropeptydu w surowicy w grupie kontrolnej - 50.14 pg/ml. Spośród homogenatów tkankowych najwyższą zawartość Gal stwierdzono w tkance guza oraz w błonie śluzowej odcinka kontrolnego ściany jelita, odpowiednio 408.71 ± 30.28 pg/g i 462.73 ± 28.54 pg/g. Zawartość Gal w błonie śluzowej w pobliżu nacieku raka wynosiła 306.63 ± 27.60 pg/g i była istotnie niższa niż w dwóch pierwszych lokalizacjach. Zawartość Gal w błonie mięśniowej z pogranicza nacieku raka wynosiła 286.66 ± 13.43 pg/g i była istotnie wyższa niż zawartość Gal w błonie mięśniowej odcinka kontrolnego jelita. Na podstawie analizy morfometrycznej skrawków uzyskanych od 22 chorych wykazano atrofię splotozwojów ENS w pobliżu nacieku raka, ponieważ średnia powierzchnia zwojów nerwowych w błonie mięśniowej w pobliżu nacieku raka była niższa o około 50% niż w odcinku kontrolnym. Analiza statystyczna nie wykazała korelacji pomiędzy stężeniem Gal w surowicy krwi chorych na RJG, atrofią zwojów nerwowych w pobliżu nacieku raka oraz zawartością Gal w homogenatach tkankowych poszczególnych fragmentów ściany jelita i tkance RJG a danymi kliniczno-patologicznymi pacjentów. Przeprowadzona analiza morfologiczna, polegające na ustaleniu odsetka komórek kaspazo-3- i kaspazo-8-immunoreaktywnych w kolokalizacji z Gal w populacji wszystkich neuronów, nie wykazała różnic w obecności neuronów kaspazo-8- jak i kaspazo-3-dodatnich, porównując odcinek jelita leżący w pobliżu nacieku raka do odcinka leżącego odlegle od guza nowotworowego. Ponadto, stwierdzono trzykrotnie większą liczbę neuronów z koekspresją kaspazy 3 i Gal niż neuronów z koekspresją kaspazy 8 i Gal. Powyższe obserwacje nasuwają hipotezę, biorąc pod uwagę uznaną neuroprotekcyjną rolę Gal, że w przebiegu RJG dochodzi do aktywacji w obrębie splotozwojów mięśniówkowych zewnątrzpochodnej ścieżki apoptozy z wyciszeniem tego procesu na etapie efektorowym spowodowanym przez obecność Gal (obserwowana koekspresja). Dodatkowo, przeprowadzona analiza obecności makrofagów i neutrofili, nie wykazała ich akumulacji w obrębie i w pobliżu splotozwojów mięśniówkowych leżących na pograniczu nacieku raka, co wyklucza ich udział w atrofii tych splotozwojów w pobliżu nacieku RJG. Podsumowując, w badaniu stwierdzono wyższe stężenie Gal w surowicy krwi pacjentów chorych na RJG w populacji polskiej w porównaniu do stężenia Gal u osób zdrowych. Wykazano istotnie wyższą zawartość Gal w tkance raka niż w błonie mięśniowej zawierającej splotozwoje galaninergiczne obu lokalizacji, co wraz z wysoką immunoreaktywnością Gal w obrębie komórek RJG sugeruje, że tkanka raka może stanowić istotne źródło tego neuropeptydu w surowicy krwi chorych. Powyższe obserwacje mogą świadczyć o potencjalnej roli Gal jako tkankowego oraz obecnego w surowicy biomarkera w przebiegu RJG. Wyniki analizy immunohistochemicznej oraz immunofluorescencyjnej wykluczyły proces zapalny jak i zmiany martwicze, a także apoptozę jako przyczynę atrofii splotozwojów ENS.
