metoda real - time pcr w diagnostyce zakażeń wirusem epsteina-barr

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 253 - 258
Agnieszka Trzcińska, Joanna Siennicka
METODA REAL - TIME PCR W DIAGNOSTYCE ZAKAŻEŃ
WIRUSEM EPSTEINA-BARR
Zakład Wirusologii NIZP-PZH w Warszawie
Kierownik: doc. dr hab. Bogumiła Litwińska
Przeprowadzono porównawczą ocenę wyników wykrywania DNA EBV przy
zastosowaniu metody real-time PCR oraz nested PCR.
Wirus Epsteina-Barr (EBV); Herpeswirus typu 4 człowieka (HHV-4) jest jednym z najpowszechniej występujących wirusów u ludzi. EBV wykazuje tropizm przede wszystkim do
limfocytów B, ale jest zdolny do zakażenia również limfocytów T, komórek nabłonkowych
i innych komórek (7). Po zakażeniu pierwotnym, do którego dochodzi najczęściej w pierwszej dekadzie życia, w większości przypadków ustalane jest latentne zakażenie wirusem,
które może ulegać okresowym reaktywacjom. Wirus Epsteina – Barr jest czynnikiem etiologicznym wielu chorób i pierwszym wirusem, dla którego został określony bezpośredni
związek z procesem nowotworzenia (16). Szerokie spektrum łagodnych i złośliwych chorób
nowotworowych etiologicznie związanych z EBV jest unikalną cechą tego patogenu wśród
innych DNA wirusów (10).
W chwili obecnej diagnostyka laboratoryjna zakażenia EBV jest prowadzona w różnorodny sposób, z wykorzystaniem wielu metod diagnostycznych (od testów serologicznych
do ilościowych metod genetycznych) stosowanych w zależności od celu prowadzonej
diagnostyki. Oznaczenia serologiczne są metodą z wyboru przy potwierdzaniu ostrych
i dokumentowaniu przebytych zakażeń EBV u osób zdrowych (5). Ilościowe metody genetyczne są coraz powszechniej używane przy diagnozowaniu, monitorowaniu oraz leczeniu
chorób związanych z EBV, szczególnie potransplantacyjnych zaburzeń limfoproliferacyjnych (PTLD) (1, 8). Wśród tych metod real-time PCR jest najczęściej stosowaną metodą
do oznaczania poziomu DNA wirusa EBV (viral load) (6).
Celem niniejszej pracy była analiza wyników uzyskanych metodą real-time PCR oraz
„home made” nested PCR, stosowanej w Zakładzie Wirusologii NIZP-PZH do rutynowej
diagnostyki, w grupie pacjentów z serologicznie potwierdzonym aktualnym lub niedawno
przebytym zakażeniem EBV.
MATERIAŁ I METODY
Materiał do badań stanowiły próbki surowic przesyłane do Zakładu Wirusologii w celu
rutynowych badań diagnostycznych. W próbkach surowic oznaczano obecność przeciwciał
254
Nr 3
A. Trzcińska, J. Siennicka
swoistych dla EBV w klasie IgM i IgG dla antygenu kapsydowego wirusa (VCA), IgG dla
antygenu jądrowego (EBNA) i wczesnego (EA). Oznaczeń dokonywano metodą ELISA
przy zastosowaniu komercyjnych testów: ETI-EBV-M reverse, ETI-VCA-G, ETI-EBNAG (DiaSorin), Anti-EBV EA IgG ELISA (Biotest). Do oznaczeń metodami genetycznymi
wybrano surowice osób z serologicznie potwierdzonym aktualnym lub niedawno przebytym
zakażeniem EBV, u których wykryto obecność przeciwciał w klasie IgM dla antygenu kapsydowego VCA (40 surowic, I grupa) lub obecność przeciwciał w klasie IgG dla antygenu
wczesnego EA, przy jednoczesnym braku przeciwciał IgM dla VCA (20 surowic, II Grupa).
Charakterystykę serologiczną grupy I i II podano w tabeli I. Obecność anty-VCA IgM lub
anty-EA IgG jest potwierdzeniem aktualnego lub niedawno przebytego zakażenia EBV. Przy
czym, zgodnie ze wzorem interpretacji podanym przez producenta testów, przyjęto że obecność anty-EA IgG przy braku anty-VCA IgM i obecności anty-VCA IgG i/lub anty-EBNA
IgG jest charakterystyczna dla reaktywacji zakażenia EBV. Natomiast obecność anty-VCA
IgM może przemawiać za istnieniem zakażenia pierwotnego, w szczególności przy braku
przeciwciał anty-EBNA IgG, które są wytwarzane relatywnie późno.
Tab ela I .
Wyniki oznaczeń serologicznych w badanych grupach pacjentów.
I grupa (średnia wieku 15,21 ± 12,13)
Liczba surowic
VCA - IgM VCA-IgG EA-IgG EBNA-IgG
o danym wzorze
serologicznym
+
+
+
+
14
+
+
4
+
+
+
16
+
+
1
+
+
nb
2
+
+
nb
+
1
+
nb
1
+
nb
nb
nb
1
II grupa (średnia wieku 22,20 ± 15,34)
VCA - IgM VCA-IgG EA-IgG EBNA-IgG
liczba surowic
+
+
+
18
+
+
2
Liczba próbek w
których wykryto
DNA metodą PCR
0
1
10
1
0
1
0
0
(+) w PCR
0
0
nb – badanie nie zostało wykonane z powodu zbyt małej ilości surowicy
DNA z badanych próbek surowic oraz z kontroli negatywnej izolowano za pomocą zestawu firmy Affigene (Sangtec Molecular Diagnostics AB) – High Pure Viral Nucleic Acid Kit
zgodnie z modyfikacjami firmy Roche. Badania metodą real-time PCR wykonano przy użyciu
komercyjnego testu LightCycler® EBV Quant Kit fimy Roche zgodnie z procedurą podaną
przez producenta. Poziom wykrywalności - LOD (Limit of Detection) dla surowicy/plazmy
w przypadku testu LightCycler® EBV Quant Kit określono na 229 kopii DNA/ml. Badania
jakościową metodą nested PCR wykonywano zgodnie z procedurą opisaną przez Pozo i wsp.
(12), a detekcję produktów po amplifikacji przeprowadzano w 4% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny. Na podstawie wyników badań kontroli zewnętrznej (QCMD) czułość
zastosowanej metody nested PCR określono na powyżej 250 genomów/ml.
Nr 3
255
Diagnostyka zakażeń EBV
Wynik
AU/ml
Wynik
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
27,8
<10
>170
>170
58,7
>170
115
119
>170
17,7
>170
81,9
>170
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
12,8
<5
15,5
104
11,4
6,33
7,1
<5
9,8
<5
5,9
<5
<5
+
-
0,316
0,473
1,079
nb
0,553
1,214
0,156
0,986
1,642
0,286
2,06
1,242
0,846
+
+
+
nb
+
+
+
+
+
+
+
+
1,32 x 104
2,63 x 103
4,40 x 104
2,80 x 103
5,23 x 102
1,77 x 103
-----------8,86 x 103
4,24 x 103
1,08 x 104
4,95 x 103
5,13 x 103
------------
Wynik
AU/ml
75
79,3
>140
25,4
>140
103
122
>140
39,9
39
>140
37,1
130
Wynik
Wynik
4
4
5
5
6
6
9
11
12
12
18
18
20
Wynik
AU/ml
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Wiek pacjenta
Tab ela I I . Wyniki uzyskane dla surowic, w których stwierdzono obecność DNA EBV metodą
real-time lub/i nested PCR
ELISA
PCR
EBNANested
VCA-IgM VCA-IgG
EA-IgG
Real-time PCR
IgG
PCR
Lp
kopie DNA/
Absorbancja
ml
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Wykrywanie kwasów nukleinowych ma duże znaczenie w diagnostyce w wirusologii
klinicznej. Zarówno jakościowe, jak i ilościowe metody molekularne są obecnie rutynowo
stosowane w większości laboratoriów wirusologicznych. Dostępne zaplecze techniczne,
automatyzacja niektórych etapów procesu diagnostycznego daje możliwość rozwinięcia
i wprowadzenia systemów wykrywania większości wirusów, jak również uzyskania klinicznie istotnych informacji, niezbędnych przy ustalaniu optymalnej terapii przeciwwirusowej
(11). Jedną z technik jakościowego i ilościowego wykrywania DNA i RNA wirusów jest
PCR, metoda pozwalająca m.in. na szybką detekcję tych wirusów, których wykrycie przy
pomocy tradycyjnych metod wirusologicznych było do tej pory trudne, lub wręcz niemożliwe (14). Real-time PCR jest najczęściej stosowaną metodą do pomiaru viral load, wartości
niezwykle istotnej w monitorowaniu odpowiedzi na zastosowane leczenie w zakażeniach
takimi wirusami jak HIV, CMV, HBV, HCV czy EBV (18). Biorąc pod uwagę zdolność
EBV do ustalania zakażenia latentnego uważa się, że wykrycie obecności DNA tego wirusa
jest niewystarczające do diagnozowania chorób z nim związanych. Ilościowy pomiar EBV
DNA, w odpowiednio dobranym materiale klinicznym, jest istotny do rozróżnienia niskiego
poziomu replikacji wirusa u osób klinicznie zdrowych od wysokiego poziomu replikacji,
charakterystycznego dla chorób związanych z EBV (6, 9, 13). Jak wykazują liczne badania kliniczne, pomiar viral load dla EBV może odgrywać istotną rolę w diagnozowaniu
i monitorowaniu nowotworów związanych z EBV, np. raka nosogardzieli, PTLD, choroby
256
A. Trzcińska, J. Siennicka
Nr 3
Hodgkin’a i innych (4, 9). Podstawowym narzędziem w diagnostyce pierwotnego/ostrego
zakażenia EBV pozostają jednak nadal testy serologiczne. Jednakże, biorąc pod uwagę
osoby z niedoborami immunologicznymi, u których reakcja odpornościowa, a więc również
produkcja przeciwciał, może być nietypowa, do rozpoznania pierwotnego/ostrego zakażenia EBV u tych osób również niezwykle przydatne okazują się być ilościowe metody
genetyczne (5, 17).
Podczas ostrej, litycznej fazy zakażenia, wirusowe DNA może być wykrywane w surowicy (2). W prezentowanych badaniach zastosowano metodę real-time PCR do określenia
poziomu EBV DNA w surowicach osób, u których badaniem serologicznym wykryto
obecność przeciwciał anty-VCA IgM (I grupa) lub obecność przeciwciał anty-EA IgG, przy
jednoczesnym braku przeciwciał anty-VCA IgM (II grupa). Otrzymane wyniki porównano
z wynikami metody nested PCR dla tych samych próbek surowic.
Ogółem zgodnych wyników (dodatnich i ujemnych) w obu metodach PCR uzyskano
57/60 (95%): 10 zgodnie dodatnich i 47 zgodnie ujemnych. Trzy wyniki niezgodne dotyczyły
2 przypadków wykrycia DNA EBV tylko metodą nested PCR, oraz 1 przypadku wykrycia
DNA wirusa tylko metodą real-time PCR (Tabela II). Koncentracja DNA EBV mierzona
metodą real-time PCR w próbkach dodatnich wyniosła od 5,23 x 102 do 4,40 x 104 kopii
DNA/ml, przy czym próbka surowicy, w której stwierdzono najniższą koncentrację DNA
wirusa, w badaniu nested PCR była ujemna.
Obecność DNA EBV którąkolwiek z metod PCR wykrywano jedynie wśród osób
z I grupy (13/40). Brak DNA EBV w próbkach surowic pacjentów, u których stwierdzono
obecność markerów serologicznych świadczących o reaktywacji zakażenia (II Grupa) może
być związany z fazą choroby, jak również z długością utrzymywania się wirusa we krwi.
Bauer i wsp. (2) wykazali, że w przypadku pierwotnego zakażenia EBV istnieje ścisły
związek pomiędzy wykryciem DNA wirusa a czasem jaki upłynął od momentu pojawienia
się pierwszych objawów chorobowych. DNA EBV było zawsze wykrywane do 12 dnia od
pojawienia się objawów, natomiast po 22 dniu nie obserwowano już dodatnich wyników
oznaczeń PCR. Analiza zależności pomiędzy statusem serologicznym pacjentów włączonych do tego badania a obecnością DNA EBV wykazała, że w większości (12/13; 92,3%)
próbek surowic, w których wykryto obecność kwasu nukleinowego wirusa, nie stwierdzano
obecności przeciwciał anty-EBNA IgG. Biorąc pod uwagę, że wzór serologiczny reprezentowany przez te próbki: anty-VCA IgM (+), anty-VCA IgG (+) i anty-EBNA IgG (-) jest
charakterystyczny dla wczesnej fazy zakażenia pierwotnego, można stwierdzić, że większość
wyników dodatnich uzyskanych metodą PCR dotyczyła właśnie tej fazy.
Jedynie w nielicznych pracach opisany jest związek pomiędzy mianem lub obecnością
swoistych dla EBV przeciwciał a viral load. Besson i wsp. (3) stwierdzili, że u pacjentów
z chorobą Hodgkin’a miano przeciwciał anty-VCA IgG wzrasta wraz ze wzrostem poziomu
DNA EBV w limfocytach krwi obwodowej, natomiast nie obserwowali korelacji pomiędzy anty-EBNA-1 IgG oraz anty-EA IgG a viral load. O pozytywnej korelacji pomiędzy
przeciwciałami anty-VCA IgG a viral load w grupie pacjentów zakażonych HIV donoszą
Stevens i wsp. (15). Wyniki prezentowanej pracy wskazują na brak związku pomiędzy
poziomem przeciwciał (AU/ml) w próbce a liczbą kopii wykrytego DNA (regresja liniowa,
r2 < 0,1; p > 0,05).
Otrzymane wyniki wskazują, że metoda real-time PCR w zastosowanym wariancie,
jest wiarygodnym narzędziem diagnozowania wczesnej fazy zakażenia pierwotnego i może
Nr 3
Diagnostyka zakażeń EBV
257
stanowić test potwierdzenia dla wyników oznaczeń serologicznych w przypadkach wątpliwych. Stosowana w rutynowych badaniach diagnostycznych w Zakładzie Wirusologii
metoda nested PCR wykazała porównywalny w stosunku do zastosowanego wariantu metody
real-time PCR stopień wykrywalności DNA EBV.
A. Trzcińska, J. Siennicka
REAL - TIME PCR IN DETECTION OF EPSTEIN-BARR VIRUS INFECTION
SUMMARY
The aim of presented paper was to compare the results of EBV tests performed using real-time
PCR (LightCycler® EBV Quant Kit – Roche) and “home made” nested PCR in patients with serological
confirmed actual or recent EBV infection. In serum samples the presence of IgM and IgG antibody to
virus capsid antigen (VCA), IgG antibody to nuclear antigen (EBNA) and early antigen (EA) was tested.
Serum samples with the presence anty-VCA IgM (I Group) or with anty EA IgG and without anty-VCA
IgM (II Group) were tested by PCR. Real-time PCR results were compared to nested PCR. In both
PCR methods 57/60 (95%) concordant results were obtained (10 positive and 47 negative samples).
In two serum samples positive result was obtained only by real-time PCR, in one serum sample only
by nested PCR. EBV DNA was detected only in serum samples from I Group. Negative EBV DNA
detection may be correlated to phase of infection (time after onset of disease) in which the sample was
collected, as well as with fact how long EBV is presence in blood. The results indicate that real-time
PCR is a reliable tool for diagnosis of primary EBV infection early in the course of disease and may
serve as test of confirmation in serologically indeterminate EBV infection (doubtful cases).
PIŚMIENNICTWO
1. Bakker NA, Verschuuren EA, Erasmus ME I inni. Epstein-Barr virus-Dna load monitoring late
after lung transplantation: a surrogate marker of the degree of immunosuppresion and a safe guide
to reduce immunosuppresion. Transplantation 2007; 83: 433 – 8.
2. Bauer CC, Aberle SW, Popow-Kraupp T I inni. Serum Epstein-Barr virus DNA load in primary
Epstein-Barr virus infection. J Med Virol 2005; 75: 54 – 8.
3. Besson C, Amiel C, Le-Pendeven C i inni. Positive correlation between Epstein-Barr virus viral
load and anti- viral capsid immunoglobulinGtiters determined for Hodgkin’s lymphoma patients
and their relatives. J Clin Microbiol 2006; 44: 47 – 50.
4. De Paoli P, Pratesi C, Bortolin MT. The Epstein Barr virus DNA levels as a tumor marker in
EBV-associated cancers. J Cancer Res Clin Oncol 2007; 133: 809 – 15.
5. Gulley ML. Molecular diagnosis of Epstei-barr virus-related diseases. J Mol Diagn 2001; 3: 1
– 10.
6. Gulley ML, Tang W. Laboratory assays for Epstein-Barr virus-related disease. J Mol Diagn 2008;
10: 279 – 92.
7. Hassan R, White LR, Stefanoff CG I inni. Epstein-Barr virus (EBV) detection and typing by PCR:
a contribution to diagnostic screening of EBV-positive Burkitt’s lymphoma. BMC Diagnostic
Pathology 2006; 1: 17.
8. Hayden RT, Hokanson KM, Pounds SB i inni. Multicenter comparison of different real-time PCR
assays for quantitative detection of Epstein-Barr virus. J Clin Microbiol 2008; 46: 157 – 63.
258
A. Trzcińska, J. Siennicka
Nr 3
9. Kimura H, Ito Y, Suzuki R, Nishiyama Y. Measuring Epstein-barr virus (EBV) load: the significance and application for each EBV-associated disease. Rev Med Virol 2008; 18: 305 – 19.
10. Kutok JL, Wang F. Spectrum of Epstein-Barr virus-associated diseases. Ann Rev Pathol 2006;
1: 375 – 404.
11. Niesters HG. Clinical virology in real time. J Clin Virol 2002; 25(Suppl 3): S3 – 12.
12. Pozo F, Tenorio A. Detection and typing of lymphotropic herpesviruses by multiplex polymerase
chain reaction. J Virol Methods 1999, 79: 9-19.
13. Sato T, Fujieda M, Tanaka E I inni. Monitoring of Epstein-Barr virus load and antibody in pediatric
renal transplant patients. Pediatr Int 2008; 50: 454 – 8.
14. Speers DJ. Clinical applications of molecular biology for infectious diseases. Clin Biochem Rev
2006; 27: 39 – 51.
15. Stevens SJ, Blank BS, Smits PH I inni. High Epstein-Barr virus (EBV) DNA loads in HIV-infected
patients: correlation with antiretroviral therapy and quantitative EBV serology. AIDS 2002; 16:
993 – 1001.
16. Uozaki H, Fukayama M. Epstein-Barr virus and gastric carcinoma – viral carcinogenesis through
epigenetic mechanisms. Int J Clin Exp Pathol 2008; 1: 198 – 216.
17. Yamashita N, Kimura H, Morishima T. Virological aspects of Epstein-Barr virus infections. Acta
Med Okayama 2005; 59: 239 – 46.
18. Yang S, Rothman RE. PCR-based diagnostics for infectious diseases: uses, limitations, and future
applications in acute-care setting. Lancet Infect Dis 2004; 4: 337 – 48.
Otrzymano: 28 VII 2009r
Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii NIZP-PZH.