Recenzja - Instytut Psychiatrii i Neurologii
advertisement
Recenzja pracy doktorskiej lekarza Mieszko Olczaka pt.: Ocena neurorozwojowej toksyczności Thimerosalu w modelu zwierzęcym - analiza behawioralna i neuropatologiczna w kontekście zaburzeń spektrum autyzmu Wprowadzenie do lecznictwa szczepień ochronnych, zapoczątkowane wynalezieniem w roku 1796 przez brytyjskiego lekarza Edwarda Jennera szczepionki przeciwko ospie, powstrzymało falę epidemii wielu groźnych, wyniszczających ludzkość chorób. Pomimo, iż szczepienia ochronne zapobiegające chorobom wieku rozwojowego znacząco zmniejszyły liczbę zachorowań wśród dzieci, niezwykle ważna jest dyskusja nad bezpieczeństwem stosowania obowiązkowych szczepień ochronnych, do której włącza się Autor niniejszej rozprawy doktorskiej, za pośrednictwem przedstawionych w tej pracy wyników badań. Wprowadzenie wielodawkowych opakowań szczepionek, które znacznie obniżyło koszt ich produkcji stało się możliwe dzięki zastosowaniu jako środka chroniącego przed kontaminacją bakteryjną organicznego związku rtęci – thimerosalu, zarejestrowanego w 1929 roku przez koncern Eli Lilly pod nazwą handlową Merthiolate, wykazującego niemal 60 krotnie skuteczniejsze działanie bakteriobójcze przeciw Gronkowcowi złocistemu w porównaniu do fenolu. Jednakże, spowodowane katastrofą ekologiczną w 1956 roku u mieszkańców obszaru zatoki Minamanta masowe zatrucia organicznymi związkami rtęci oraz opublikowane w latach 70-tych raporty przypadków klinicznych, wskazujące na potencjalną neurotoksyczność thimerosalu, zainicjowały dyskusję nad bezpieczeństwem jego stosowania w celu stabilizacji szczepionek oraz innych środków leczniczych i spowodowały, iż pod koniec lat 90-tych FDA zaleciła ograniczenie stosowania thimerosalu jako substancji konserwującej w szczepionkach pediatrycznych w USA. W tym samym czasie thimerosal, jako środek konserwujący szczepionki został wycofany z użycia w krajach Europy Zachodniej, jednakże nadal związek ten jest stosowany w niektórych szczepionkach dla niemowląt i dzieci w Polsce, Rumunii, Bośni i Hercegowinie oraz w wielu krajach trzeciego świata. Inspiracją przedstawionej do oceny pracy doktorskiej lekarza Mieszko Olczaka wykonanej pod kierunkiem pani prof. Doroty Majewskiej, prowadzącej badania nad neurotoksycznością zawartego w thimerosalu organicznego związku rtęci, stała się hipoteza łącząca autyzm dziecięcy oraz zaburzenia z grupy spektrum autyzmu z neurotoksycznością rtęci zawartej w szczepionkach podawanych we wczesnym okresie życia, pojawiająca się w publikacjach naukowych pochodzących z ostatniego dziesięciolecia. Rozprawa doktorska lekarza Mieszko Olczaka jest obszernym, liczącym 182 strony opracowaniem naukowym, o typowym dla tego typu opracowań układzie. W interesująco napisanym wstępie Autor rozprawy przedstawił charakterystykę chemiczną badanego preparatu, dane dotyczące jego toksyczności i farmakokinetyki oraz historię zastosowania thimerosalu w medycynie. Przedstawione we wstępie pracy szczegółowe dane dotyczące szczepionek zawierających thimerosal stosowanych w USA, informacje dotyczące powikłań poszczepiennych pochodzące z amerykańskiej bazy danych VAERS (Vaccine Adverse Event Reporting System) oraz dane z Narodowego Instytutu Leków dotyczące zawartości thimerosalu w szczepionkach dostępnych na polskim rynku świadczą o doskonałym przygotowaniu doktoranta do podjętego wyzwania naukowego oraz przekonują o zasadności zaplanowanych w doktoracie badań. Na szczególną uwagę zasługuje część wstępu poświecona zaburzeniom spektrum autyzmu, w której doktorant przedstawił różnorodność postaci klinicznych, zmiany neuropatologiczne i biochemiczne oraz liczne modele zwierzęce tych zaburzeń. Cel pracy lekarza Mieszko Olczaka, wynikający z przedstawionych we wstępie rozprawy przesłanek, stanowiła eksperymentalna weryfikacja hipotezy zakładającej, iż thimerosal podawany niemowlętom w szczepionkach uczestniczy w patogenezie autyzmu i innych zaburzeń neurologicznych u dzieci. W celu weryfikacji tej hipotezy Autor rozprawy postanowił odpowiedzieć na sześć szczegółowych pytań wymienionych w rozdziale Cel pracy, z których ostatnie zostało sformułowane w następujący sposób: „Czy zaobserwowane zmiany u zwierząt mogą wskazywać, iż thimerosal ma bezpośredni związek z występowaniem chorób z grupy spektrum autyzmu u ludzi?” Otrzymanie odpowiedzi na przedstawione w celu pracy szczegółowe pytania wiązało się z przeprowadzeniem szeregu badań wymagających opanowania wielu różnorodnych metod. Autor pracy wykazał się doskonałym opanowaniem warsztatu badawczego, 2 począwszy od badań farmakokinetycznych poprzez szereg testów behawioralnych, aż do badań neuropatologicznych. Wykonanie tych badań wymagało olbrzymiego nakładu pracy, ponieważ thimerosal był podawany w 4-krotnych iniekcjach domięśniowych w szerokim zakresie dawek szczurzym oseskom szczepu Wistar obu płci i w wybranych testach szczepu Lewis. Ocena rozwoju zwierząt została dokonana w oparciu o 5 – krotne pomiary masy ciała, ich aktywność motoryczna i reakcje lękowe w teście otwartego pola, a wrażliwość na bodźce bólowe w teście gorącej płyty. Wzajemne relacje zwierząt zostały ocenione w teście interakcji społecznych, a ich funkcje poznawcze w teście pamięci przestrzennej (labiryncie wodnym Morrisa). Do oceny aktywności układu dopaminergicznego Autor pracy wykorzystał test katalepsji haloperidolowej oraz ocenił gęstość receptorów D2 w prążkowiu, a do określenia aktywności układu opioidowego wykonał test gorącej płyty z dodatkowym blokowaniem receptorów opioidowych naloksonem, test katalepsji indukowanej morfiną oraz określił gęstość receptorów opioidowych μ w istocie szarej okołowodociągowej. Ponadto, u 8-tygodniowych szczurów szczepu Wistar, które otrzymały thimerosal w dawkach 12 i 240 μg Hg/kg został oceniony obraz morfologiczny kory czołowej i skroniowej, hipokampa i kory móżdżku w barwieniu H+E oraz została wykonana reakcja immunohistochemiczna na synaptofizynę w preparatach hipokampa w celu oceny gęstości synaptycznej i na GFAP oraz aktywną kaspazę 3 w korze móżdżku w celu uwidocznienia zmian w komórkach glejowych. Imponująca ilość wyników przeprowadzonych badań została przedstawiona na 37 rycinach i 71 mikrofotografiach dokumentujących obrazy mikroskopowe tkanki mózgowej oraz precyzyjnie omówiona w rozdziale Wyniki. Wyjaśniona w rozdziale Materiał Badawczy i Metodyka koncepcja użycia różnych dawek thimerosalu, wykorzystanie 2 różnych szczepów szczurów oraz przeprowadzenie badań u zwierząt w różnym wieku spowodowało, iż olbrzymia ilość otrzymanych wyników okazała się niełatwa do interpretacji. Na podstawie przeprowadzonych badań Autor rozprawy wykazał, iż podanie szczurzym oseskom szczepu Wistar thimerosalu w sposób naśladujący szczepienia ochronne u niemowląt spowodowało statystycznie znamienne osłabienie aktywności motorycznej oraz nasilenie reakcji lękowych u 5-tygodniowych szczurów i znoszone przez nalokson zmniejszenie wrażliwości na bodźce bólowe u 6-tygodniowych szczurów oraz zmniejszenie gęstości receptorów D2 w prążkowiu i wzrost gęstości receptorów opioidowych μ już w dawkach odpowiadających zawartości thimerosalu w szczepionkach dla dzieci. Ponadto, 3 podanie zwierzętom szczepu Wistar dwóch najwyższych dawek thimerosalu (1440 i 3000 μg Hg/kg) nie wpływało na zachowanie 10-tygodniowych samców i 11-tygodniowych samic w labiryncie wodnym Morrisa, natomiast zmieniało interakcje socjalne zwierząt, zwiększając liczbę incydentów zachowań anty-socjalnych i zmniejszając pro-socjalnych u samców, a u samic zmniejszając liczbę obu typów zachowań ocenianą w 8 tygodniu życia. Podany w 2 najwyższych dawkach samcom szczurów szczepu Wistar thimerosal osłabiał katalepsję haloperidolową oraz nasilał katalepsję morfinową, ocenianą odpowiednio w 12 i 16 tygodniu życia zwierząt. W trzech wybranych testach behawioralnych wykonanych u zwierząt szczepu Lewis: teście otwartego pola, teście gorącej płyty i labiryncie wodnym Morrisa, stwierdzono jedynie osłabienie wrażliwości na bodziec bólowy po podaniu dwóch najwyższych dawek badanego związku. Starannie wykonane i bardzo dobrze udokumentowane badania morfologiczne mózgowia wykonane u 8-tygodniowych samców szczepu Wistar wykazały już po najniższej dawce obecność w neuronach kory przedczołowej, skroniowej i hipokampie licznych zmian ischemicznych i zmian o typie schorzenia przewlekłego oraz nasiloną klazmatodendrozę astocytów w sąsiedztwie uszkodzonych neuronów hipokampa, w którym stwierdzono osłabienie reakcji na synaptofizynę. Ocena morfologiczna móżdżku ujawniła liczne zmiany ischemiczne i homogenizacyjne w komórkach Purkiniego oraz odcinkowy zanik gleju Bergmana, z dodatnią reakcją na aktywną kaspazę 3 w pozostałych komórkach. Pomimo olbrzymiej ilości wyników Autor rozprawy po mistrzowsku przeprowadził szczegółową, niezwykle dojrzałą dyskusję odnoszącą wyniki własnych badań do badań innych autorów, ze szczególnym ich odniesieniem do zburzeń spektrum autyzmu opisywanych w zwierzęcych modelach doświadczalnych oraz w badaniach klinicznych. Ponadto, zwrócił uwagę na dysproporcję pomiędzy znacznym nasileniem zmian patologicznych w OUN, a umiarkowanymi zaburzeniami obserwowanymi w testach behawioralnych, co jak słusznie zauważył może wiązać się z wysokim potencjałem kompensacyjnym mózgowia młodych zwierząt. Omawiając wyniki badań układu dopaminergicznego przedstawił interesującą propozycję wyjaśnienia zaobserwowanych w badaniach, złożonych zaburzeń w tym układzie neurotransmisyjnym: osłabienia katalepsji haloperidolowej z równoczesnym zmniejszeniem gęstości receptorów D2 i zmniejszeniem aktywności motorycznej zwierząt. Proponuję rozważenie w dyskusji tych wyników toksycznego działania thimerosalu, ponieważ osłabienie katalepsji zaobserwowano po najwyższych (prawdopodobnie toksycznych) dawkach badanego związku. W kolejnym rozdziale Autor rozprawy zamieścił podsumowanie wyników, a w następnym wnioski z których 1 do 17 stanowią syntetyczne podsumowanie wyników, zatem 4 korzystniejsze dla rozprawy byłoby zamieszczenia ich na końcu poprzedniego rozdziału, a w rozdziale Wnioski pozostawienie pięciu wniosków (18 -24) określonych jako wnioski ogólne. Uważam, iż przedstawione przez doktoranta, ostrożnie sformułowane wnioski ogólne odpowiadają na pytania postawione w celu pracy. I chociaż na podstawie przeprowadzonych przez lekarza Mieszko Olczaka badań nie można udzielić ostatecznej odpowiedzi na pytanie czy istnieje bezpośredni związek pomiędzy thimerosalem, a występowaniem chorób z grupy spektrum autyzmu, jednakże wykazane w niniejszej rozprawie podobieństwo zaburzeń behawioralnych i zmian patologicznych w OUN, po podaniu szczurzym oseskom thimerosalu w modelu odzwierciedlającym szczepienia ochronne u dzieci, ze zmianami opisanymi w zwierzęcych modelach autyzmu wskazuje na możliwość udziału organicznych związków rtęci w patogenezie tych zaburzeń. Pomimo, iż znalezienie ostatecznej odpowiedzi na powyższe pytanie wymaga dalszych badań, wyniki badań przedstawione w rozprawie doktorskiej lekarza Mieszko Olczaka, w pełni upoważniają jej Autora do wysunięcia wniosku, iż z powodu znacznej neurotoksyczności thimerosalu w rozwijających się organizmach, związek ten powinien być bezwzględnie wycofany ze wszystkich szczepionek i innych środków przeznaczonych dla ludzi, a w szczególności dla dzieci. Pracę uzupełniają zamieszczony na początku spis treści, a na jej końcu spis użytych w tekście skrótów, spis rycin i tabel, streszczenie pracy w języku polskim i angielskim. Prawidłowo dobrane i zacytowane piśmiennictwo obejmuje 297 prawie wyłącznie anglojęzycznych, w większości pochodzących z ostatnich lat pozycji literaturowych, w tym adresy 7 stron internetowych. Z obowiązku recenzenta muszę nadmienić, iż w tak obszernym opracowaniu nie udało się jego Autorowi uniknąć drobnych niedociągnięć w postaci błędów edytorskich, bądź niezręcznych sformułowań, których lista została przekazana doktorantowi, a które w żaden sposób nie wpływają na merytoryczną wartość pracy. Przedstawiona do oceny rozprawa doktorska lekarza Mieszko Olczaka stanowi oryginalne osiągnięcie naukowe, wskazując na potencjalny związek pomiędzy ekspozycją na organiczne związki rtęci zawarte w thimerosalu wykorzystywanym jako środek bakteriostatyczny w szczepionkach dla dzieci i niemowląt, a niebezpieczeństwem wystąpienia zmian w ośrodkowym układzie nerwowym mogących stanowić podłoże zaburzeń z grupy spektrum autyzmu. 5 Starannie przemyślana, a następnie konsekwentnie zrealizowana koncepcja pracy, oparta na szeregu uzupełniających się metodach badawczych, pozwoliła na wszechstronną ocenę struktury i funkcji OUN u zwierząt otrzymujących iniekcje thimerosalu odpowiadające kalendarzowi szczepień u dzieci. Imponująca ilość przeprowadzonych badań w oparciu o różnorodne metody badawcze oraz bogactwo dobrze udokumentowanych wyników, które z powodzeniem mogłyby stanowić podstawę pracy habilitacyjnej, umiejętność dyskusji otrzymanych wyników, stanowiącej prawdziwy popis erudycji nie pozbawionej krytycyzmu w stosunku do wyników przeprowadzonych badań oraz przedstawienie ograniczeń pracy świadczą o wyjątkowej dojrzałości naukowej doktoranta. Ponadto, o wartości pracy oraz o dojrzałości naukowej jej Autora świadczy opublikowanie części wyników niniejszej pracy w postaci 4 publikacji w czasopismach naukowych o międzynarodowym zasięgu. Przedstawiona do oceny rozprawa doktorska lekarza Mieszko Olczaka pt.: „Ocena neurorozwojowej toksyczności Thimerosalu w modelu zwierzęcym - analiza behawioralna i neuropatologiczna w kontekście zaburzeń spektrum autyzmu” w pełni odpowiada warunkom określonym w art. 13 Ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki oraz art. 251 Ustawy z dnia 27 lipca 2005 r. Prawo o szkolnictwie wyższym (Dz.U. Nr 65, poz.595 z 2003r. oraz Dz.U. Nr 164 poz.1365 z 2005r). Mam zatem zaszczyt wystąpić do Wysokiej Rady Naukowej Instytutu Psychiatrii i Neurologii w Warszawie z wnioskiem o wyróżnienie rozprawy doktorskiej lekarza Mieszko Olczaka oraz o dopuszczenie doktoranta do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Prof. dr hab. med. Maria Małgorzata Winnicka Kierownik Zakładu Patologii Ogólnej i Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku 6
