Diagnostyka gruźlicy

III Konferencja Naukowo-Szkoleniowa
„Zakażenia Układu Oddechowego”
20-22 października 2006
NOWE METODY
DIAGNOSTYKI GRUŹLICY
Hanna Grubek-Jaworska
Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych
Pneumonologii i Alergologii Akademii
Medycznej w Warszawie
o
Około 80% zachorowań na gruźlicę wykrywa
się z objawów
o
Jedynym, niepodważalnym potwierdzeniem
wstępnego rozpoznania choroby jest
uzyskanie dodatnich wyników diagnostyki
mikrobiologicznej.
o
W 2005 r. wśród nowo zarejestrowanych
(9 280) jedynie u 5 409 potwierdzono
gruźlicę bakteriologicznie (58,3 %), wśród
chorych na gruźlicę płuc 61,2 %
Specyfika laboratoryjnej diagnostyki gruźlicy wiąże
się z:
o
niskim tempem namnażania się prątków
na pożywkach
o
koniecznością stosowania wielu technik
wykrywania zakażenia
mikroskopia
techniki hodowlane przyspieszające wzrost
techniki molekularne
Prawidłowa laboratoryjna diagnostyka gruźlicy
obejmuje
o
bakterioskopię
o
wyhodowanie prątków
o
określenie gatunku wyhodowanych prątków
o
określenie lekowrażliwości
o
Miarą nowoczesności laboratorium diagnostyki
gruźlicy jest spełnienie powyższych wymogów
diagnostycznych w maksymalnie krótkim czasie
o
Docelowo całość diagnostyki nie powinna
przekraczać 21- 25 dni
Laboratoria prątka gruźlicy
I Rzędu: mikroskopia
II Rzędu: hodowla
identyfikacja M.tuberculosis complex
ocena lekowrażliwości na INH,RMP,SM,EMB
III Rzędu: identyfikacja ważniejszych gatunków prątków
testy lekowrażliwości dla leków drugiej linii
testy lekowrażliwości dla prątków atypowych
Nowoczesna laboratoryjna diagnostyka gruźlicy
o bakterioskopia uzupełniona o metody molekularne
o wyhodowanie prątków
pożywka L-J
pożywki płynne z różnymi systemami detekcji
o określenie gatunku wyhodowanych prątków
konwencjonalne metody bioch.-mikrobiologiczne
metody molekularne
analiza kwasów mikolowych techniką HPLC
o określenie lekowrażliwości
metody fenotypowe
metody molekularne?
Mycobacterium sp.
barwienie metodą
Ziehl-Neelsena
mikroskopia w świetle
widzialnym
barwienie
auraminą
mikroskopia
w świetle UV
obecność prątków
wynik
O
Prawdopodobnie negatywny
(nie wystarczająca liczba
prątków dla wykrycia w
bekterioskopii)
1-2 / 300 pól
widzenia
Nie uznawany za pozytywny,
konieczność badania dalszych
próbek
1-9 / 100 pól
widzenia
+
1-9 / 10 pól
widzenia
++
1-9 / 1 pole
widzenia
+++
(średnio liczna)
> 9 / 1 pole
widzenia
++++
(liczne)
*/ przy powiększeniu 800 x - 1000x
(sporadyczne)
(nieliczne)
Bakterioskopia
(+)
(-)
Wykrywa chorych
silnie
prątkujących
Nie różnicuje prątków
żywych i martwych
Czas wykonania
około 3 godzin
Nie różnicuje gatunku
prątków
Niska cena
badania
Czułość w wykrywaniu
gruźlicy w plwocinie
około 30 %
AFB (+)
M.Tuberculosis
NTM (MOTT)
30 - 40%
60 – 70%
Chorzy - mikroskopia dodatnia
(n = 217)
Katedra i Klinika Chorób
Wewnętrznych, Pneumonologii i
Alergologii
(1999-2005)
mykobakteriozy
n=9
(7%)
TB
n = 82
(38%)
NTM
n = 135
(62%)
NTM
środowiskowe
lub
kolonizacja
n = 126
(93%)
potwierdenie TB wykluczenie TB
testem MTB
testem MTB
Przy wynikach AFB(+) zalecanym postępowaniem
jest wykonanie (możliwie z tej samej próbki klinicznej)
badania techniką molekularną, która pozwala
zidentyfikować genom prątków gruźlicy
Systemy molekularne dopuszczone do rutynowej
diagnostyki gruźlicy
o
Amplicor (MTB) test
(Roche Molecular System,Somerville, New Jersey)
rozpoznaje M.tuberculosis complex
PCR (6 – 8 godz)
o
Mycobacterium tuberculosis Direct Test (MTD)
(Gen-Probe Inc. San Diego, Ca)
rozpoznaje M.tuberculosis complex, M.avium complex, M.avium,
M.intracellulare, M.kansasii, M.gordonae,
rRNA (2 – 3 godz)
o
BDProbe Tec ET Mycobacterium tuberculosis complex Direct
Detection Assay (SDA - Strand Displacement Amplification)
(Becton Dickinson Biosciences, Sparks, Md.)
rozpoznaje M.tuberculosis complex, M.avium complex oraz
M.kansasii
SDA (1,5 godz)
Metody biologii molekularnej
(+)
Czas wykonania
badania – kilka /
kilkanaście godzin
Czułość wykrywania
gruźlicy około 70 - 90
%
(-)
Stosunkowo wysoka cena
badania
Szkolenie, aparatura
Możliwość identyfikacji
jedynie 5 gatunków
prątków:
Swoistość 97-100 %
•M.tbc complex,
Wykrywanie zakażeń w
•M.avium,
bardzo wczesnej fazie
•M.intracellulare,
•M.konsasii,
•M.gordonae
Jedynie metodą molekularną można w czasie kilku
godzin wykryć obecność prątków gruźlicy bezpośrednio
w materiale klinicznym
Amplicor
Próbka kliniczna
103 - 10 4
MTB
PCR
(Roche)
Dekontaminacja
Zagęszczanie
Izolacja DNA
101 - 10 2
PCR
Wykrycie produktów reakcji
o
W zakresie diagnostyki gruźlicy, czułość i
swoistość wymienionycvh systemów
molekularnych jest porównywalna
o
W rutynowej diagnostyce gruźlicy nie należy
stosować metod ”domowych”
o
Próbki kliniczne mogą być przesyłane pocztą
(do 5 dni) bez utraty wartości diagnostycznej w
zakresie zakażeń prątkowych
REKOMENDACJA CDC
próbka mikroskopowo dodatnia
amplifikacja
pozytywna
1x
amplifikacja
negatywna
2x
inhibicja
obecna
TB
badanie
następnych próbek
brak
mykobakterioza ?
REKOMENDACJA CDC
próbka mikroskopowo ujemna
amplifikacja
negatywna
2x
nie TB
amplifikacja
pozytywna
2x
TB
amplifikacja
zahamowana
?
Chorzy na gruźlicę (1999-2005)
metoda i wynik
AFB (+) hodowla (+)
Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych,
Pneumonologii i Alergologii Akademii
Medycznej w Warszawie (1999-2005)
liczba
chorych
62
AFB (-) hodowla (+)
51
AFB (+) hodowla (-)
20 *
AFB (-) hodowla (-)
9*
ogółem
* dodatni test molekularny (MTB)
142
w próbkach
9 / 51 chorych
wynik testu MTD
był ujemny
czułość
mikroskopii
58%
czułość
hodowli
79%
Systemy detekcji wzrostu prątków na
pożywkach płynnych
o
radiometryczny Bactec 460 Tb
(Becton Dickinson)
(możliwość różnicowania M.Tbc / NTM)
o
kolorymetryczny system - MB Bac T
(Organon Teknika Corporation)
(możliwość badania lekooporności na podstawowe leki
przeciwgruźlicze, osobne podłoża dla próbek
krwawych)
o
system fluorymetryczny MGIT
(Mycobacterial Growth Indicatory Tube)
(Beckton Dickinson)
(możliwość badania lekooporności na podstawowe leki
przeciwgruźlicze)
wyhodowane prątki
M.Tuberculosis
NTM (MOTT)
30 - 40%
60 – 70%
Chorzy – hodowle dodatnie (n = 312)
(1999-2005) Katedra i Klinika
Chorób Wewnętrznych,
Pneumonologii i Alergologii)
mykobakteriozy
n = 22
(11%)
TB
n = 113
(36%)
potwierdzenie
TB testem MTB
lub techniką
HPLC
NTM
n = 199
(64%)
wykluczenie TB
testem MTB,
typowanie gatunku
HPLC
NTM
środowiskowe
lub
kolonizacja
n = 170
(89%)
M.xenopi
n = 57
M.kansasii
n = 42
M.gordonae
n = 33
M.avium
n =10
M.abscseus
n=9
M.fortuitum
n=8
M.flavescens
n=1
M.scrofulaceum
n=1
M.neoaurum
n=1
M.nonchromogenicum n = 1
unidentified sp.
n=9
0,17
HPLC (high pressure liquid
chromatography)
M.tuberculosis
Wysokociśnieniowa
chromatografia cieczowa
0,12
0,07
LMW
HMW
0,02
3
4
5
6
7
8
9
10
Analiza składu kwasów
mykolowych:
-0,03
M.avium
0,17
0,12
0,02
3
Hydroliza
2.
Ekstrakcja chloroformem
3.
Przekształcenie kwasów
mykolowych w
bromofenacylowe pochodne
4.
Rozdział na kolumnie w fazie
odwróconej
5.
Wzór elucyjny badanej próby
6.
Analiza porównawcza z
biblioteką zgromadzonych
wzorów elucyjnych szczepów
wzoprcowych z ATCC
HMW
LMW
0,07
1.
4
5
6
7
8
9
10
-0,03
0,1
M.interjectum
0,08
0,06
LMW
0,04
HMW
0,02
0
3
-0,02
4
5
6
7
8
9
10
Porównanie czułości i czasochłonności
metod laboratoryjnych w wykrywaniu gruźlicy
czułość
czasochłonność
(%)
metody molekularne
hodowla
mikroskopia
70 – 90
70
33 – 50
1 dzień
kilka dni - 8 tyg
3 - 4 godz
próbka kliniczna (po wstępnym opracowaniu)
metoda
molekularna
bakterioskopia
hodowla
Tbc
ujemna
nie Tbc
bk -
bk+
wynik
24 h
dodatnia
test niacynowy
lub
metody
HPLC
molekularne
wynik
•MAC
•kilkadziesiąt gatunków
prątków
•M.kansasii
•M.tuberculosis
•M.tuberculosis
lekooporność
met. hodowlane lub met. molekularne
kilkanaście dni
do 10 tyg.
wynik
kilka godzin
do 40 dni
Ujemne wyniki badań laboratoryjnych nie
wykluczają rozwoju choroby bowiem żadna z
metod laboratoryjnych nie charakteryzuje się
100% czułością
Najczęstsze błędy laboratoryjne i
interpretacyjne lub zaniechania w
mikrobiologicznej diagnostyce gruźlicy
I
Jednoznaczna interpretacja mikroskopii
AFB (+) jako gruźlicy,
AFB (+) może wskazywać
o
o
o
o
gruźlicę
saprofit środowiskowy – (NTM / MOTT)
mykobakterioza
w przypadku materiałów bronchoskopowych
zanieczyszczenie instrumentarium
II
Brak typowania do gatunku wyrośniętych
szczepów prątków - poprzestanie na wykonaniu
testu niacynowego różnicujacego jedynie M.tbc
oraz MOTT
nie pozwala to na:
o
diagnozowanie mykobakterioz
o
wykrywanie systematycznych zanieczyszczeń
prątkami środowiskowymi
III
Zaniechanie wzywania na dodatkowe
badania mikrobiologiczne chorych ze
wskazaniami klinicznymi, u których
wyhodowano prątki niegruźlicze
Z tej grupy rekrutują się chorzy na
mykobakeriozy
IV
Brak systematycznej oceny
mikrobiologicznej czystości sprzętu
endoskopowego
Immunologiczna diagnostyka zakażenia
M.tuberculosis w warunkach in vitro
Diagnostyka uśpionych zakażeń M.tbc
Latent Tuberculosis Infection - LTBI
Odpowiedź na zakażenie M.tuberculosis
nasilenie
odpowiedzi
cell mediated immunity
przeciwciała
replikacja prątków
L a t e n t TB I n f e c t i o n
czas
zakażenie
choroba
Zjawisko, które było podstawą współcześnie
stosowanego testu tuberkulinowego opisał w 1890 roku
Robert Koch, kontynuatorami jego pracy byli Charles
Mantoux i Clemens von Pirquet
skórny test tuberkulinowy
(tuberculin skin test -TST) stosowany jest od
1907 roku.
test
skórny
pomiar testu tuberkulinowego
IFN-γ
stymulacja
IL- 8
TNF-
komórka
prezentująca
antygen
komórka
pamięci
IFN-γ
TNF-
krew - test
in vitro
pomiar produkcji IFN-γ
IL- 8
Czynniki negatywizujące TST:
o
Zależne od osoby badanej
infekcje (wirusowe, bakteryjne, grzybicze)
zaburzenia metaboliczne
niedożywienie
choroby narządów limfatycznych(np..białaczka, sarkoidoza)
leki (glikokortykoidy, leki immunosupresyjne)
wiek
o
Zależne od preparatu tuberkulinowego
nieodpowieednie rozcieńczenie
chemiczna denaturacja
adsorpcja na szkle
kontaminacja
o
Zła technika szczepienia
o
Zła technika odczytu
ekspozycja
na M.tbc
zakażenie 95 %
zakażanie
uśpione 95 %
nie dochodzi do
rozwoju choroby
90%
brak dowodów
zakażenia
5%
gruźlica
gruźlica
5%
5 -10 %
wg E.Tortoli 2005
o
Postępy immunologii i genomiki ostatnich lat
stworzyły test alternatywny dla skórnego testu
tuberkulinowego
o
Jest to test in vitro nowej generacji mierzący poziom
odporności komórkowej
o
Podstawą testu jest oddziaływanie na komórki w
warunkach in vitro wysoko swoistych dla
M.tuberculosis antygenów ESAT-6 oraz CP-10
stymulujących wydzielanie IFN-gamma
ESAT-6 - early secretory antigenic target 6
CP-10 - culture filtrate protein
Antygen
ESAT-6
M tuberculosis
BCG
moreau
pasteur
tokyo
danish
glaxo
montreal
niskocząsteczkowe
białka swoiste dla
M.tuberculosis
NTM
CFP-10
CFP-10
+
+
-
-
Antygen
M abscessus
M avium
M branderi
M celatum
M chelonae
M fortuitum
M gordonae
M intracellulare
M kansasii
M malmoense
M marinum
M genavense
M scrofulaceum
M smegmatis
M szulgai
M terrae
M vaccae
M xenopi
+
+
+
-
ESAT-6
+
+
+
-
QuantiFERON-TB Gold
Maj 2005 – test uzyskał aprobatę FDA U.S.
Badanie polega na wykrywaniu IFN-gamma w hodowlach
limfocytów heparynizowanej, pełnej krwi stymulowanych
syntetycznymi peptydami:
ESAT-6 (early secretory antigenic target-6)
CFP-10 (culture filtrate protein-10) swoistymi dla
M.tuberculosis oraz patogennych szczepów
M.bovis.
Białek ESAT-6 oraz CFP-10 nie stwierdza się w BCG oraz w
większości gatunków prątków środowiskowych z wyjątkami
M.kansasii, M.szulgai, M.marinum
Test jest rekomendowany przez CDC w każdej sytuacji, w
której wykonuje się TST włączając gruźlicę oraz kontakty z
TB (Latent Tuberculosis Infection -LTBI)
CDC MMWR Recomendations and Reports Dec16, 2005/54 (RR 15;49-55)
Quantiferon
metoda probówkowa
1
krew
inkubacja 16 - 24h w 37°C
kontrola
ujemna
ESAT6 + CFP10
mitogen
wirowanie
kolor
badanie plazmy w teście
ELISA wykrywającym IFN-γ
DO 450nm
2
dodanie substratu – pomiar kolorymetryczny
IFN-g IU/ml
odczytanie stężenia z krzywej standardowej
I etap – inkubacja leukocytów z antygenem, zebranie nadsączu
krew + antygen
kontrole:
krew bez Ag
krew + mitogen
Inkubacja w 37
16-24 godz.
wirowanie,2000g
przez 5-10 min
pobranie 200 μl
plazmy
ELISA – IFN-γ
konjugat +
badana
plazma lub
standard
inkubacja
min
płukanie,
120 dodanie
substratu
dodanie
roztworu
stopującego
odczytanie
stężenia z
krzywej
standard.
Quantiferon – metoda płytkowa
K
pobranie krwi
ESAT-6 CFP-10 mitogen
krew + antygeny
inkubacja 24h , wydzielenie IFN-γ
DO 450nm
KOLOR
IFN-g IU/ml
‘sandwich’ ELISA,
(incubacja 120 min)
dodanie substratu, reakcja barwna
odczyt stężenia IFNγ z krzywej standardowej
QuantiFERONTB Gold – interpretacja wyników
miogen – K
ESAT 6 – K
i / lub
CFP 10 – K
 0,5
 0,35
pozytywny
zakażenie
prawdopodobne
< 0,5
 0,35
pozytywny
zakażenie
prawdopodobne
 0,5
< 0,35
negatywny
zakażenie
nieprawdopodobne
< 0,5
< 0,35
nieokreślony brak wyniku
IU IFN- γ /ml
wynik
interpretacja
T SPOT- TB assay
metoda ocena liczby komórek syntetyzujących IFN-γ
kontrola
pobranie krwi
separacja leukocytów jednojądrzastych
ESAT-6 CFP-10 mitogen
inkubacja komórek stymulowanych antygenami w
naczyniach opłaszczonych przeciwciałem anty IFN-γ
kOLOR
inkubacja 24 h w 37oC
‘sandwich’ ELISA,
(Inkubacja 120 min)
ocena liczby barwnych plamek
T SPOT- TB assay
1
Zawiesinę leukocytów krwi (250 000/ml) nawarstwia się na płytkę opłaszczoną
przeciwciałem anty IFN-γ, dodaje antygeny swoiste dla TB  uwalniany IFN-γ
wychwytywany jest przez przeciwciała
2
Po odpłukaniu dodaje się wtórne przeciwciało znakowane enzymem, a nstępnie substrat, co
wizualizuje test  plamki barwne (1 plamka = 1 komórka T)
Jeżeli w kontroli negatywnej.>10 lub kontroli pozytywnej <20
test nie może być interpretowany
Korelacja IFN-γ / Mantoux
czułość
swoistość
IFN-γ
Mantoux
89.0%
65.7%
(105/118)
(50/76; 5 mm)
98.2%
35.4%
(213/217)
(73/113; 10 mm)
Mori et al Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004
FIG. 1. Individual IFN- response to PPD and either of the RD1 antigens ESAT-6 or CFP-10 (E6/C10) (for each
patient the highest IFN- responses) are shown. In the left panel, the responses of the TB suspect population (n
= 73); and in the right panel, the responses for the healthy control population (n = 39). The cutoff value for a
positive response was set at 0.35 IU/ml for ESAT-6 and CFP-10 and arbitrarily at 1.5 IU/ml for PPD. The dotted
lines represent the cutoff for the specific antigens and PPD.
Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, April 2005, p. 491-496, Vol. 12, No. 4
cutoff of 0.35 IU/ml for IFN- γ
T. Mori i wsp. Am J of Respir Crit Care Med Vol 170. pp. 59-64,
(2004)
Ograniczenia metodyczne Quantiferonu- TB Gold
(błędy techniczne)
o
użycie innych antykoagulantów niż heparyna
o
nieodpowiedni transport krwi
o
zbyt wysoke stężenie IFN-gamma we krwi
o
czas > 12 godzin po pobrania krwi
Ograniczenia merytoryczne Quantiferonu- TB Gold
o
test nie powinien być stosowany w
przypadkach zaniżonej liczby limfocytów
o
w przypadkach upośledzonej reaktywności
immunologicznej (HIV, AIDS, transplantacje,
immunosupresja polekowa)
o
u kobiet w ciąży
o
u osób poniżej 17 r.ż.
kierunki badań:
o
QFT-G u dzieci, szczególnie <5 r.ż.
o
QFT-G u osób z zaburzeniami układu
odpornościowego
o
czułość testuw gruźlicy pozapłucnej
o
przypadki TB w następstwie wykluczenia lub
potwierdzenia LTBI przez QFT-G
o
czas po ekspozycji na M.tbc niezbędny dla
pozytywizacji QFT-G
o
analiza ekonomiczna stosowania TST vs QFT-G
o
zmiany QFT-G u chorych leczonych z powodu LTBI
oraz TB – monitorowanie terapii
W diagnostyce rutynowej wiele spośród wspomnianych
nowszych technik mogą stosować jedynie wybrane
laboratoria
Techniki te stanowią w wielu przypadkach jedynie
uzupełnienie metod konwencjonalnych
Zaleca się łączenie nowych technik z diagnostyką
tradycyjną
dziękuję za uwagę