Białkowy chimeryczny receptor błonowy, zmodyfikowana komórka

advertisement
R Z EC Z PO SPO LITA
POLSKA
(12) OPIS PATENTOWY (19)PL
(21) Numer zgłoszenia:
(22) Data zgłoszenia:
315908
12.01.1995, PCT/US95/00454
(54)
( 30)
(87) Data i numer publikacji zgłoszenia
międzynarodowego:
17.08.1995, W095/21528,
PCT Gazette nr 35/95
C07K
C07K
C12N
C12N
C12N
14/73
14/735
15/07
15/13
15/63
U p raw n io n y z patentu:
Pierwszeństwo:
The General Hospital Corporation,
Boston, US
Zgłoszenie ogłoszono:
(72)
Twórcy wynalazku:
Brian Seed, Boston, US
Babak Banapour, El Sobrante, US
Charles Romeo, Belmont, US
Waldemar Kolanus, München, DE
09.12.1996 BUP 25/96
( 45)
(51) IntCl7:
Białkowy chimeryczny receptor błonowy, zmodyfikowana komórka,
DNA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy i wektor zawierający taki DNA
14.02.1994,US,08/195395
02.08.1994,US,08/284391
©
(13)B1
12.01.1995
(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(11) 180066
O udzieleniu patentu ogłoszono:
29.12.2000 WUP 12/00
(74)
Pełnom ocnik:
Ostrowska Elżbieta, POLSERYICE
PL 180066
B1
(5 7 )
1. Białkowy chim eryczny receptor błonowy, zawierający (a) pozakomórkową część zaw ierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał
część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragm ent CD4 je st oddzielony od wewnątrzkomórkowej części dom eną zaw ierającą sekwencję am inokw asow ą w ybraną z grupy obejmującej: fragment
CD7 posiadającą SEQ ID NO: 35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część
przezbłonow ą CD7, część przezbłonow ą CD5, część przezbłonową CD3 4, białkową - α
-ehlisę.
4. Zm odyfikowana kom órka pochodząca z grupy obejmującej (a) limfocyty T; (b) cytotoksyczne limfocyty T; (c) naturalne komórki zabijacze; (d) neutrofile; (e) granulocyty; (f) makrofagi; (g) komórki tuczne; (h) komórki HeLa; oraz (i) embrionalne komórki macierzyste, w ytwarzająca w wyniku ekspresji związany z błoną, białkowy chimeryczny receptor,
zawierający (a) pozakom órkow ą część zaw ierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200,
oraz (b) część w ewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora
komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części dom eną
przezbłonową, zaw ierającą sekwencję am inokw asow ą w ybraną z grupy obejmującej. CD7 posiadającą SEQ ID N O:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonowąCD 7, część przezbłonow ą
CD5, część przezbłonow ą CD34, je d n ą lub więcej białkowych α-helis.
9. W ektor zawierający D NA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakom órkow ą część
zaw ierającą fragm ent CD4 obejm ujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową,
którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy
czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części dom eną przezbłonową, zaw ierającą sekwencję aminokw asow ą w y b ra n ą z grupy obejm ującej: CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki
IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonow ą CD34, je d n ą lub
więcej białkowych α
-helis.
Białkowy chimeryczny receptor błonowy,
zmodyfikowana komórka,
DNA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy
i wektor, zawierający taki DNA
Zastrzeżenia
patentowe
1. Białkowy chimeryczny receptor błonowy, zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część
wewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T,
białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od
wewnątrzkomórkowej części domeną zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy
obejmującej: fragment CD7 posiadającą SEQ ID NO: 35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej
cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonowąCD7, część przezbłonowąCD5,
część przezbłonową CD34, białkową a-helisę.
2. Chimeryczny receptor według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera fragment CD4 posiadający SEQ ID NO: 31.
3. Chimeryczny receptor według zastrz. 1, znamienny tym, że białko receptora komórki T
stanowi ζ.
4. Zmodyfikowana komórka pochodząca z grupy obejmującej (a) limfocyty T; (b) cytotoksyczne limfocyty T; (c) naturalne komórki zabijacze; (d) neutrofile; (e) granulocyty; (f) makrofagi; (g) komórki tuczne; (h) komórki HeLa; oraz (i) embrionalne komórki macierzyste,
wytwarzająca w wyniku ekspresji związany z błoną, białkowy chimeryczny receptor, zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub
aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał
część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym
fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną przezbłonową, zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: CD7 posiadającą SEQ ID
NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część
przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub więcej
białkowych α-helis.
5. Komórka według zastrz. 4, znamienna tym, że fragment CD4 jest oddzielony od błony
komórki o co najmniej 48 A lub o co najmniej 72 A.
6. Komórka według zastrz. 4, znamienna tym, że białko receptora komórki T stanowi
7. DNA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200.
oraz (b) część wewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora
komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną przezbłonową, zawierającą sekwencję aminokwasowąwybranąz grupy obejmującej: CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i
CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonową CD7, część
przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub więcej białkowych -α
-helis.
8. DNA według zastrz. 7, znamienny tym, że zawiera SEQ ID N0:30.
9. Wektor zawierający DNA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub
aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał
część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym
fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną przezbłonową, zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: CD7 posiadającą SEQ ID
NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część
180 066
3
przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub więcej
białkowychα-helis.
10. Wektor według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera SEQ ID N0:30.
* * *
Przedmiotem wynalazku są funkcyjne chimery pomiędzy fragmentami CD4 i receptorami
komórki odporności, które są zdolne do kierowania komórek odporności, w celu przeprowadzenia lizy komórek zainfekowanych przez HIV, ale nie nadaje komórkom odporności podatności na
infekcję HIV. W związku z tym wynalazek dostarcza nowego i skutecznego sposobu terapii HIV.
Stan techniki wynalazku
Rozpoznawanie przez komórki T antygenu za pomocą receptora komórki T stanowi podstawę szeregu zjawisk immunologicznych. Komórki T kierują tak zwaną odpornością z udziałem
komórek. Obejmuje ona niszczenie przez komórki układu odpornościowego obcych tkanek lub
zainfekowanych komórek. Znanych jest szereg komórek T, obejmujących komórki „wspomagające” i „supresyjne”, które modulują reakcję odpornościową, oraz komórki cytotoksyczne (lub
„zabijacze”), które mogą bezpośrednio zabijać nieprawidłowe komórki.
Komórka T, która rozpoznaje i wiąże się z unikatowym antygenem występującym na powierzchni innej komórki, uaktywnia się; może się następnie mnożyć, a w przypadku, gdy jest to
komórka cytotoksyczna, może ona zabijać związaną komórkę.
H IV i immunopatogeneza
W 1984 roku wykazano, że HIV jest czynnikiem etiologicznym AIDS. Od tego czasu definicję AIDS korygowano szereg razy w odniesieniu do kryteriów, które powinny zostać uwzględnione w diagnozie. Jednak pomimo płynności parametrów diagnostycznych prostym wspólnym
mianownikiem AIDS jest infekcja HIV, a następnie rozwój trwałych uogólniających objawów
oraz chorób związanych z AIDS, takich jak wtórne infekcje, nowotwory i choroba neurologiczna. Harrison’s Principles of Internal Medicine, 12th Ed., McGraw Hill (1991).
HIV jest ludzkim retrowirusem należącym do grupy wirusów wolno działających. 4 rozpoznane ludzkie retrowirusy należą do dwóch różnych grup: ludzkie wirusy T-limfotropowe
(białaczki), HTLV-1 i HTLV-2, oraz ludzkie wirusy upośledzenia odporności, HIV-1 i HIV-2.
Pierwsze należą do wirusów przekształcających, drugie do wirusów cytopatycznych.
HIV-1 zidentyfikowano jako najczęstszą przyczynę AIDS w całym świecie. Homologia
sekwencji między HIV-1 i HIV-2 wynosi około 40%, przy czym HIV-2 jest ściślej spokrewniony
z pewnymi składnikami grupy małpich wirusów upośledzenia odporności (SIV). Patrz Curran J. i
inni, Science, 329:1357-1359 (1985); Weiss R. i inni, Nature, 324:572-575 (1986).
HIV zawiera zwykłe geny retrowirusowe (env, gag oraz pol), a także 6 dodatkowych genów uczestniczących w replikacji i innych czynnościach biologicznych wirusa. Jak to zaznaczono powyżej, wspólnym mianownikiem AIDS jest znaczące upośledzenie odporności, przede
wszystkim odporności z udziałem komórek. Takie upośledzenie odporności prowadzi do różnych chorób oportunistycznych, zwłaszcza pewnych infekcji i nowotworów.
Jako główną przyczynę niedoboru odporności w AIDS zidentyfikowano ilościowe i jakościowe zubożenie w podzbioru limfocytów pochodzących z grasicy (T), populacji T4. Ten podzbiór komórek jest określany fenotypowo przez obecność powierzchniowej cząsteczki CD4,
która, jak to wykazano, jest komórkowym receptorem dla HIV. Dalgleish i inni, Nature 312:763
(1984). Jakkolwiek komórki T4 stanowią główny typ komórek infekowanych przez HIV, to zasadniczo dowolna ludzka komórka, która w wyniku ekspresji zawiera na swojej powierzchni
cząsteczkę CD4, może wiązać HIV i być przezeń zainfekowana.
Tradycyjnie komórkom CD4+ przypisuje się rolę pomocnika/induktora, co wskazuje na ich
rolę w dostarczaniu sygnału uaktywniającego do komórek B, albo indukowaniu limfocytów T
przenoszących zwrotny marker CD8, tak że stają się komórkami cytotoksycznymi/supresyjnymi.
Reinherz i Schlossman, Celi 19:821-827 (1980); Goldstein i inni, Immunol. Rev. 68:5-42 (1982).
4
180 066
HIV wiąże się specyficznie z wysokim powinowactwem poprzez ciąg aminokwasów w kopercie wirusowej (gp 120) z częścią regionu VI cząsteczki CD4 zlokalizowaną w pobliżu jej
N-końca. Po związaniu, wirus zlewa się z błoną docelowej komórki i intemalizuje ją. Po internalizacji wykorzystuje on enzym odwrotną transkryptazę do transkrybowania swojego genomowego RNA w DNA, który integruje się z komórkowym DNA, gdzie istnieje przez cały okres
życia komórki jako „prowirus”.
Prowirus może pozostać uśpiony lub uaktywnić się i transkrybować mRNA i genomowy
RNA, co prowadzi do syntezy białka, złożenia, powstania nowego wiriona oraz odszczepienia
się wirusa od powierzchni komórki. Jakkolwiek dokładny mechanizm, według którego wirus
wywołuje śmierć komórki, nie został ustalony, uważa się, że podstawowy mechanizm obejmuje
masowe odszczepianie się wirusów z powierzchni komórki, co prowadzi do zniszczenia błony
plazmowej i powoduje utratę równowagi osmotycznej.
W czasie infekcji organizm gospodarza wytwarza przeciwciała przeciw białkom wirusa,
obejmującym podstawowe glikoproteiny kopertowe gp 120 i gp41. Pomimo tej humoralnej odporności choroba rozwija się, co prowadzi do śmiertelnego upośledzenia odporności charakteryzującego się licznymi oportunistycznymi infekcjami, obecnością pasożytów we krwi, otępieniem i
śmiercią. Niemożność przeciwwirusowych przeciwciał gospodarza do zatrzymania postępu choroby stanowi jeden z najbardziej dotkliwych i alarmujących aspektów infekcji i źle wróży próbom zastosowania szczepionek, opartych na konwencjonalnych rozwiązaniach.
Dwa czynniki mogą odgrywać rolę w skuteczności reakcji humoralnej na wirusy upośledzenia odporności. Po pierwsze, podobnie jak inne wirusy RNA (a zwłaszcza podobne retrowirusy), wirusy upośledzenia odporności wykazują wysoką szybkość mutacji w odpowiedzi na
nadzór odpornościowy gospodarza. Po drugie, same glikoproteiny kopertowe stanowią silnie glikozylowane cząsteczki zawierające niewiele epitopów przydatnych w wiązaniu przeciwciała z
wysokim powinowactwem. Słaby cel antygenowy, który stanowi koperta wirusowa, stwarza gospodarzowi niewiele szans na ograniczenie infekcji wirusowej poprzez wytwarzanie określonych przeciwciał.
Komórki zainfekowane wirusem HIV wytwarzają w wyniku ekspresji glikoproteinę gpl20
na powierzchni Gp 120 uczestniczy w zjawiskach fuzji między komórkami CD4+poprzez reakcje
zbliżone do tych, dzięki którym wirus wnika do niezainfekowanych komórek, co prowadzi do
powstania krótko żyjących wielojądrowych komórek olbrzymich. Powstawanie zespólni jest
uzależnione od bezpośredniego oddziaływania glikoproteiny kopertowej gpl20 z białkiem CD4.
Dalgleish i inni, supra; Klatzman D. i inni, Nature 312:763 (1984); MCDougal J.S. i inni, Science
231:382 (1986); Sodroski J. i inni, Nature 322:470 (1986); Lifson J.D. i inni, Nature 323:725
(1986); Sodroski, J. i inni, Nature 321:412 (1986).
Do dowodów na to, że wiązanie CD4-gp 120 jest odpowiedzialne za infekcję wirusową komórek przenoszących antygen CD4 należy odkrycie, że tworzy się specyficzny kompleks między gpl20 i CD4. MCDougal i inni, supra. Inni badacze wykazali, że linie komórek, które nie są
infekowane przez HIV, przekształcają się w dające się zainfekować linie komórek po transfekcji i
ekspresji CDNA ludzkiego genu CD4. Maddon i inni, Celi 46:333-348 (1986).
Zaproponowano programy terapeutyczne oparte na rozpuszczalnym CD4 jako pasywnym
czynniku zakłócającym adsorpcję wirusa i transmisję komórkową z udziałem zespólni, a liczne
grupy wykazały przydatność takiego podejścia in vitro (Deen i inni, Nature 331:82-84 (1988);
Fisher i inni, Nature 331:76-78 (1988); Hussey i inni, Nature 331:78-81 (1988); Smith i inni,
Science 238:1704-1707 (1987); Traunecker i inni, Nature 331:84-86 (1998)); następnie opracowano immunoglobulinowe białka fuzyjne CD4 o wydłużonych okresach półtrwania i nieznacznej
aktywności biologicznej (Capon i inni, Nature 337:525-531 (1989); Traunecker i inni, Nature 339,
68-70 (1989); Bym i inni, Nature 344:667-670 (1990); Zettlmeissl i inni, DNA Cell Biol, 9:347-353
(1990)). Jakkolwiek koniugaty immunotoksynowe CD4 lub białka fuzyjne wykazują silną cytotoksyczność względem zainfekowanych komórek in vitro (Chaudhary i inni, Nature 335:369-372
(1988); Till i inni, Science 242:1166-1168 (1988)), uśpienie zespołu upośledzenia odporności powoduje, że mało prawdopodobne jest, aby jakakolwiek jednorazowa terapia była skuteczna w
180 066
5
wyeliminowaniu obciążenia wirusowego, a antygenowość obcych białek fuzyjnych ograniczy
prawdopodobnie ich przydatność w leczeniu wymagającym powtarzanego dawkowania.
Próby na małpach zainfekowanych SIV wykazały, że rozpuszczalne CD4 podawane zwierzętom bez znaczącej cytopenii CD4 może zmniejszyć miano SIV i poprawić miary in vitro potencjału rdzeniowego (Watanabe i inni, Nature 337:267-270 (1989)). Jednakże, po przerwaniu
leczenia zaobserwowano szybki ponowny rozwój wirusów, co sugeruje, że długotrwałe podawanie może być konieczne, aby zapobiec stopniowemu osłabieniu układu odporności.
Komórka T i receptory Fc
Ekspresja na powierzchni komórki najbardziej rozpowszechnionej formy receptora antygenu komórki T (TCR) wymaga współekspresji co najmniej 6 różnych łańcuchów polipeptydowych (Weiss i inni, J. Exp. Med. 160:1284-1299 (1984); Orloühashi i inni, Nature 316:606-609
(1985); Berkhout i inni, J. Biol. Chem. 263:8528-8536 (1988); Sussman i inni, Celi 52:85-95
(1988)), łańcuchów wiążących antygen α/ß, 3 polipeptydów kompleksu CD3 iζ. Gdy któryś z
tych łańcuchów nie występuje, trwała ekspresja pozostałych elementów kompleksu nie zachodzi. ζ jest ograniczającym polipeptydem powierzchniowej ekspresji pełnego kompleksu (Sussman i inni, Cell 52:85-95 (1988)), a ponadto uważa się, że uczestniczy ono w co najmniej części
komórkowych programów uaktywniania uruchamianych przez rozpoznawanie ligandu przez receptor (Weissman i inni, EMBO J. 8:3641-3656 (1989); Frank i inni, Science 249:174-177
(1990)). Integralny homodimer błonowy typu I o 32kDa, ζ (zeta) zawiera domenę pozakomórkow ą o 9 resztach bez miejsc do N-połączonej addycji glikanu, oraz domenę wewnątrzkomórkową o 112 resztach (mysią) lub 113 resztach (ludzką) (Weissman i inni, Science 238:1018-1020
(1988); Weissman i inni, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:9709-9713 (1988)). Izoforma ζ określana
jako (eta) (Baniyash i inni, J. Biol. Chem. 263:9874-9878 (1988); Orloff i inni, J. Biol. Chem.
264:14812-14817 (1989)), powstająca przy wariantowej drodze rozszczepiania mRNA (Jin i
inni, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:3319-3233 (1990)), występuje w zmniejszonych ilościach w
komórkach, w których zachodzi ekspresja receptora antygenu. Uważa się, że heterodimery
uczestniczą w tworzeniu się fosforanów inozytolu, a także w zainicjowanej przez receptor programowanej śmierci komórki, określanej jako apoptoza (Merćep i inni, Science 242:571-574
(1988); Merćep i inni, Science 246:1162-1165 (1989)).
Podobnie jakηζ iη, zasocjowany z receptorem Fc łańcuch y jest wytwarzany w wyniku ekspresji w występujących na powierzchni komórki kompleksach z dodatkowymi polipeptydami, z
których część uczestniczy w rozpoznawaniu ligandu, a rola innych nie jest określona, y (gamma)
wykazuje homodimeryczną strukturę i ogólną organizację podobną do ζ , stanowiąc składnik zarówno receptora IgE z wysokim powinowactwem względem komórki tucznej/zasadochłonnej,
FceRI, który zawiera co najmniej 3 różne łańcuchy polipeptydowe (Blank i inni, Nature
337:187-189 (1989); Ra i inni, Nature 241:752-754 (1989)), oraz jednego z receptorów z niskim
powinowactwem względem IgG, reprezentowanych u myszy przez Fcγ RIIα (Ra i inni, J. Biol.
Chem. 264:15323-15327 (1989)), a także u ludzi przez ekspresję podtypu CD 16 w makrofagach i naturalnych komórek zabijaczy, CD16TM (przezbłonowy CD16) (Lanier i inni, Nature 342:803-805
(1989); Anderson i inni, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2274-2278 (1990)) oraz z polipeptydem o nieokreślonym znaczeniu (Anderson i inni, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 87:2274-2278 (1990)). Ostatnio
doniesiono, że y powstaje w wyniku ekspresji w mysiej linii komórek T. CTL, w których tworzy on
homodimery oraz heterodimery y-ζ, i y-η (Orloff i inni, Nature 347:189-191 (1990)).
Receptory Fc uczestniczą w fagocytozie kompleksów immunologicznych, transcytozie
oraz cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) (Ravetch i Kinet, Annu.
Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Unkeless i inni, Annu. Rev. Immunol 6:251-281 (1988); oraz
Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1:16-25 (1988)). Ostatnio wykazano, że jedna z mysich izoform
receptora Fc z niskim powinowactwem, FcRylllB1, uczestniczy w internalizacji celów powleczonych Ig w powleczonych klatryną studzienkach, a inny receptor z niskim powinowactwem,
FcrylllA uczestniczy w ADCC poprzez zasocjowanie z jednym lub więcej elementami z małej
grupy „cząsteczek wyzwalających” (Miettinen i inni, Celi 58:317-327 (1989); oraz Hunziker i
Mellman, J. Celi Biol. 109:3291-3302 (1989)). Te cząsteczki wyzwalające, receptor komórki T
6
180 066
(TCR) łańcuchζ, tłuszczowyηTCR oraz łańcuch y receptora Fc oddziałują z domenami rozpoznawania ligandu różnych receptorów układu odpornościowego oraz mogą autonomicznie inicjować komórkowe programy efektorowe, w tym cytolizę, po agregacji (Samelson i inni, Celi
43:223-231 (1985); Weissman i inni, Science 239:1018-1020 (1988); Jini inni, Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 87:3319-3323 (1990); Blank i inni, Nature 337:187-189 (1989); Lanier i inni, Nature
342:803-805 (1989); Kurosaki i Ravetch, Nature 342:805-807 (1989); Hibbs i inni, Science
246:1608-1611 (1989); Anderson i inni, Proc. Natl. Sci. USA 87:2274-2278 (1990); oraz Irving i
Weiss, Celi 64:891-901 (1991)).
Przy porównywaniu mysiej i ludzkiej rodziny receptora FC z niskim powinowactwem okazało się jednak, że ludzkie izoformy FcRyllA i C nie mają mysich odpowiedników. Częściowo z
tego względu ich rola nie została dotychczas określona.
W związku z tym, że same czynniki humoralne oparte na CD4 mogą mieć ograniczoną
przydatność in vivo, we wcześniejszych pracach rozwijano możliwość zwiększenia odporności
komórek na HIV. Zidentyfikowano preparaty chimer białkowych, w których pozakomórkowa
domena CDS jest złączona z przezbłonową i/lub wewnątrzkomórkową domeną receptora komórki T, receptora IgG F lub elementów przenoszących sygnał receptora komórki B (zgłoszenia
patentowe USA nr 07/847 566 i 07/665 961, które wprowadza się jako źródła literaturowe). Cytolityczne komórki T, w których zachodzi ekspresja chimery obejmujące pozakomórkową domenę
CD4 powodują silną, niezależną od MHC destrukcję celów komórkowych, w których zachodzi
ekspresja białek kopertowych HIV. Wyjątkowo ważnym i nowym elementem takiego podejścia
było zidentyfikowanie pojedynczego receptora komórki T, receptora Fc, oraz łańcuchów receptora komórki B, których agregacja wystarcza do zainicjowania odpowiedzi komórkowej. Jednym ze szczególnie użytecznych zastosowań takiego rozwiązania było wynalezienie chimer
pomiędzy CD4 oraz ζ, ηlub y, które kierują cytolityczne limfocyty T, tak, że rozpoznają one i zabijają komórki, w których zachodzi ekspresja gp120 HTV (zgłoszenia patentowe USA nr 07/847
566 i 07/665 961, które wprowadza się jako źródła literaturowe).
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakomórkowączęść zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy
1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4
jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną zawierającą sekwencję aminokwasową
wybraną z grupy obejmującej: fragment CD7 posiadającą SEQ ID NO: 35, zawiasę domen CH2 i
CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonową CD7, część
przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, białkowąa-helisę.
Korzystnie chimeryczny receptor według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera
fragment CD4 posiadający SEQ ID NO: 31 oraz równie korzystnie tym, że białko receptora komórki T stanowi ζ.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowana komórka pochodząca z grupy
obejmującej (a) limfocyty T; (b) cytotoksyczne limfocyty T; (c) naturalne komórki zabijacze; (d)
neutrofile; (e) granulocyty; (f) makrofagi; (g) komórki tuczne; (h) komórki HeLa; oraz (i) embrionalne komórki macierzyste, wytwarzająca w wyniku ekspresji związany z błoną, białkowy
chimeryczny receptor zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, którą
stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub
białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części
domeną przezbłonową, zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej:
CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonowąCD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową
CD34, jedną lub więcej białkowych α-helis.
Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że fragment CD4 jest oddzielony od błony komórki o co najmniej 48 A lub o co najmniej 72 A. Również korzystnie białko
180 066
7
receptora komórki T stanowi ζ . Kolejnym przedmiotem wynalazku jest DNA kodujący białkowy
chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment
CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz(b) część wewnątrzkomórkową
którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub
białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną przezbłonową, zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID
NO:33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub
więcej białkowych α-helis.
Korzystnie DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że SEQ ID N0:30.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor zawierający DNA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4
obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową,
którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B
lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części
domeną przezbłonową, zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej:
CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą
SEQ ID NO:33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34,
jedną lub więcej białkowychα-helis.
Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera SEQ ID N0:30.
Wynalazek ujawnia sposób kierowania komórkowej reakcji odpornościowej przeciw zainfekowanym przez HIV komórkom ssaka. Sposób obejmuje podawanie ssakowi skutecznej ilości
terapeutycznych komórek, przy czym w tych terapeutycznych komórkach zachodzi ekspresja
związanego z błoną, białkowego chimerycznego receptora obejmującego (a) pozakomórkową
część zawierającą fragment CD4 zdolny do specyficznego rozpoznawania komórki zainfekowanej przez HIV i wiązania się z nią, ale nie uczestniczy w infekcji HIV, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, która jest zdolna do sygnalizowania komórce terapeutycznej zniszczenie związanej z
receptorem komórki zainfekowanej przez HIV.
Zgodnie ze zbliżonym rozwiązaniem, przedmiotem ujawnienia jest zastosowanie terapeutycznych komórek, w których zachodzi ekspresja związanego z błoną, białkowego chimerycznego receptora obejmującego (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4, zdolny do
specyficznego rozpoznawania komórki zainfekowanej przez HIV i wiązania się z nią, ale nie
uczestniczy w infekcji HIV, oraz (b) część wewnątrzkomórkową która jest zdolna do sygnalizowania komórce terapeutycznej zniszczenie związanej z receptorem komórki zainfekowanej
przez HIV, do wytwarzania leku, stosowanego w leczeniu chorób związanych z HIV.
W drugim aspekcie ujawnienie dotyczy komórki, w której zachodzi ekspresja związanego
z błoną białkowego chimerycznego receptora obejmującego (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4, zdolny do specyficznego rozpoznawania komórki zainfekowanej przez
HIV i wiązania się z nią, ale nie uczestniczy w infekcji HIV, oraz (b) część wewnątrzkomórkową,
która jest zdolna do sygnalizowania komórce terapeutycznej zniszczenie, związanej z receptorem komórki zainfekowanej przez HIV.
W korzystnym wykonaniu obydwu aspektów fragment CD4 stanowią aminokwasy 1-394
z CD4 lub aminokwasy 1-200 z CD4; fragment CD4 oddzielony jest od części wewnątrzkomórkowej przezbłonową domeną pokazaną na fig. 26 lub przez zawiasę, domeny CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG 1 pokazaną na fig. 25;receptor obejmuje część przezbłonową CD7;receptor
obejmuje część przezbłonową CD5; receptor obejmuje część przezbłonową CD34; fragment
CD4 oddzielony jest od błony komórki terapeutycznej jedną lub więcej białkowymi α-helisami;
fragment CD4 oddzielony jest od błony komórki terapeutycznej o co najmniej 48A lub o co najmniej 72A; wewnątrzkomórkowa część przenoszącej sygnał części białka receptora komórki T
(npζ, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc; a komórka terapeutyczna wybrana jest
z grupy obejmującej: (a) limfocyty T; (b) cytotoksyczne limfocyty T; (c) naturalne komórki zabi-
8
180 066
jacze; (d) neutrofile; (e) granulocyty; (f) makrofagi; (g) komórki tuczne; (h) komórki HeLa; oraz
(i) embrionalne komórki macierzyste układu krwionośnego.
W innych wykonaniach wynalazek ujawnia DNA kodujące chimeryczny receptor według
wynalazku; oraz wektora zawierającego ten DNA chimerycznego receptora.
Jakkolwiek konkretne rozwiązanie według wynalazku stanowi chimera pomiędzy CD4 i ζ ,
to w ujawnionych celach wykorzystać można dowolny łańcuch receptora o działaniu podobnym
do tych cząsteczek, np. w granulocytach lub limfocytach. Do wyróżniających cech pożądanej wyzwalającej cząsteczki komórki odpornościowej należy zdolność do autonomicznej ekspresji (jako
pojedynczego łańcucha), zdolność do fuzji z pozakomórkową domeną CD4, tak że powstała chimera występuje na powierzchni komórki terapeutycznej, oraz zdolność do inicjowania komórkowych programów efektorowych w wyniku agregacji po napotkaniu docelowego ligandu.
Obecnie najdogodniejszym sposobem dostarczania chimer do komórek układu odporności
jest pewnego rodzaju terapia genowa. Jednakże w wyniku odtworzenia komórek układu odpornościowego z chimerycznymi receptorami poprzez zmieszanie komórek z odpowiednio rozpuszczonym, oczyszczonym białkiem chimerycznym, może również doprowadzić do powstania
skonstruowanej populacji komórek, zdolnych do rozpoznawania celów zainfekowanych przez
HIV. Podobne podejścia wykorzystano np. do wprowadzania cząsteczki CD4 do erytrocytów w
celach terapeutycznych. W takim przypadku skonstruowana populacja komórek nie powinna
być zdolna do samoodnawiania się.
Ujawnienie dotyczy funkcyjnych i uproszczonych chimer pomiędzy fragmentami CD4 i receptorem komórki T, receptorem komórki B i podjednostkami receptora FC, które są zdolne do
ukierunkowania komórek odpornościowych, tak, aby rozpoznawały one i dokonywały lizy komórek zainfekowanych przez HTV. Sposób kierowania reakcją komórkową u ssaków obejmuje podawanie ssakowi skutecznej ilości terapeutycznych komórek (np. cytotoksycznych limfocytów T),
które to komórki są zdolne do rozpoznawania i niszczenia komórki zainfekowanej przez HIV.
Przedmiotem ujawnienia są ponadto chimeryczne białka receptorowe, które kierują cytotoksyczne limfocyty T, tak, że rozpoznają one i dokonują lizy komórek zainfekowanych przez
HIV, komórki gospodarza transformowane wektorem zawierającym chimeryczne receptory,
oraz przeciwciała skierowane przeciw chimerycznym receptorom.
Te i inne warianty nie ograniczające zakresu wynalazku staną się oczywiste dla specjalistów po zapoznaniu się z poniższym szczegółowym opisem wynalazku.
W poniższym szczegółowym opisie wprowadzone będą odnośniki do różnych metodyk
znanych specjalistom biologii molekularnej i immunologii. Publikacje i inne materiały, w których przedstawiono takie znane metodyki, do których podano odnośniki, wprowadza się w
całości jako źródła literaturowe.
Do standardowych prac podających ogólne zasady technologii zrekombinowanego DNA,
należą: Watson i inni, Molecular Eiology of the Gene, Vol.I i II, Benjamin/Cummings Publishing
Company, Inc., wydawca, Menlo Park, CA (1987); Darnell i inni, Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Wydawca, New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley &
Sons, wydawcy, New York, N.Y. (1985); Old i inni, Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2 wydanie, University of California Press, Wydawca, Berkeley,
CA (1981); Maniatis i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, wydawca, Cold Spring Harbor, NY (1989); oraz Ausubel i inni, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989).
Definicje
„Klonowanie” oznacza zastosowanie in vitro technik rekombinacji do wstawiania określonego genu lub innej sekwencji DNA do cząsteczki wektora.
„cDNA” oznacza komplementarny DNA lub kopia DNA, wytworzony z matrycy RNA w
wyniku działania zależnej od RNA polimerazy DNA (odwrotnej transkryptazy). I tak „klon
CDNA” oznacza dwuniciową sekwencję DNA komplementarną z odpowiednią cząsteczką
RNA, przenoszony w wektorze klonowania.
180 066
9
„Biblioteka cDNA” oznacza zbiór zrekombinowanych cząsteczek DNA zawierających inserty cDNA, które zawierają kopie DNA z mRNA powstającego w wyniku ekspresji w komórce
przy wytwarzaniu biblioteki cDNA. Taką bibliotekę cDNA wytworzyć można sposobami znanymi specjalistom, opisanymi np. przez Ausubela i innych, supra, oraz Maniatisa i innych, supra.
Ogólnie, najpierw wydziela się RNA z komórek organizmu, którego genom jest pożądany do
klonowania określonego genu. Według wynalazku korzystnie wykorzystuje się w tym celu linie
komórek limfocytowych ssaków, zwłaszcza ludzi. Obecnie korzystnym wektorem jest szczep
wirusa krowianki WR.
„Wektor” oznacza cząsteczkę DNA pochodzącą np. z plazmidu, bakteriofaga albo wirusa
ssaka lub owada, w którym wykonać można insercję lub klonowanie fragmentów DNA. Wektor
będzie zawierać jedno lub więcej unikatowych miejsc restrykcyjnych oraz może być zdolny do
autonomicznej replikacji w określonym gospodarzu lub organizmie nośnym, tak że klonowana
sekwencja może być reprodukowana. „Wektor ekspresji DNA” oznacza dowolny autonomiczny
element zdolny do kierowania syntezą zrekombinowanego peptydu. Takie wektory ekspresji
DNA obejmują bakteryjne plazmidy i fagi, a także plazmidy i wirusy ssaków i owadów.
„Zasadniczo czysty” odnosi się do związku, np. białka, polipeptydu lub przeciwciała, zasadniczo wolnego od składników, które z natury towarzyszą mu. Ogólnie związek jest zasadniczo czysty, gdy co najmniej 60%, jeszcze korzystniej co najmniej 75%, a najkorzystniej co
najmniej 90% całości materiału w próbce stanowi właściwy związek. Czystość można oznaczyć
odpowiednim sposobem, np. na drodze chromatografii kolumnowej, elektroforezy na żelu poliakrylamidowym albo analizy HPLC. W odniesieniu do kwasów nukleinowych „zasadniczo czysty” oznacza sekwencję, segment lub fragment kwasu nukleinowego, który bezpośrednio nie
sąsiaduje (np. nie jest kowalencyjnie połączony) z obydwoma sekwencjami kodującymi, z którymi bezpośrednio sąsiaduje (np. z jedną na końcu 5', a z drugą na końcu 3 w występującym w naturze genomie organizmu, z którego pochodzi właściwy DNA według wynalazku.
Określenie „fragment” cząsteczki, taki jak dowolna z sekwencji cDNA według wynalazku,
odnosi się do dowolnego z sąsiadujących podzbiorów nukleotydowych cząsteczki. „Analog”
cząsteczki oznacza nienaturalną cząsteczkę zasadniczo podobną do całej cząsteczki lub jej fragmentu. Cząsteczka jest „zasadniczo podobna” do innej cząsteczki, gdy sekwencje aminokwasów
w obydwu cząsteczkach są zasadniczo takie same. Zasadniczo podobne cząsteczki aminokwasów będą wykazywać podobne działanie biologiczne. W użytym znaczeniu cząsteczka stanowi
„chemiczną pochodną” innej cząsteczki, gdy zawiera grupy chemiczne, nie stanowiące zazwyczaj części cząsteczki. Takie grupy mogą zwiększać rozpuszczalność, absorpcję, okres półtrwania
biologicznego cząsteczki itp. Grupy te mogą także obniżać toksyczność cząsteczki, eliminować lub
osłabiać jakiekolwiek niepożądane działanie uboczne cząsteczki itp. Grupy zdolne do wywierania
takiego wpływu ujawniono np. w publikacji Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 wyd., Mack
Publishing Co., Easton, Penn. (1980).
Określenie „funkcyjna pochodna” genu chimery receptorowej według wynalazku obejmuje „fragmenty” lub „analogi” genu, „zasadniczo podobne” pod względem sekwencji niikleotydowej i kodujące cząsteczkę o podobnej aktywności jak chimera receptora z komórki T, komórki B
lub Fc. Najkorzystniej pochodna wykazuje 90%, szczególnie korzystnie 70%, a korzystnie 40%
aktywności chimery receptora typu dzikiego. Aktywność pochodnej funkcyjnego receptora chimerycznego obejmuje specyficzne wiązanie (z pozakomórkowączęścią CD4) z komórką zainfekowaną przez HIV oraz wynikające stąd niszczenie komórki; dodatkowo chimeryczny receptor
nie nadaje komórce przenoszącej receptor podatności na infekcję HIV. Aktywność chimerycznego receptora można zbadać, wykonując np. dowolny z testów opisanych poniżej.
Przeprowadzić można rekombinację sekwencji DNA kodującej chimerę receptora CD4
według wynalazku, albo jej funkcyjnych pochodnych, z DNA wektora, z wykorzystaniem znanych technik, z wykorzystaniem tępo zakończonych lub lepko zakończonych końców do ligowania, trawienia enzymem restrykcyjnym w celu uzyskania odpowiednich końców, wypełniania w
odpowiedni sposób lepkich końców, obróbki fosfatazą alkaliczną, tak aby zapobiec niepożąda-
10
180 066
nemu połączeniu, oraz ligowania z odpowiednimi ligazami. Techniki takich manipulacji ujawniono w pracy Maniatisa i innych, supra. Są one dobrze znane specjalistom.
Cząsteczka kwasu nukleinowego, np. DNA, je s t,.zdolna do ekspresji” polipeptydu, jeśli
zawiera sekwencje nukleotydowe, które zawierają informację regulującą transkrypcję i translację, a sekwencje takie są „operacyjnie połączone” z sekwencjami nukleotydowymi, które kodują
polipeptyd. Operacyjne połączenie stanowi połączenie, w którym regulujące sekwencje DNA
oraz sekwencja DNA, która ma brać udział w ekspresji, połączone są w taki sposób, aby umożliwić ekspresję genu. Dokładny charakter regionów regulujących niezbędnych do zapewnienia
ekspresji genu może być odmienny dla różnych organizmów, z tym że zazwyczaj obejmuje on region promotora, który w prokariotach zawiera zarówno promotor (który kieruje inicjowaniem
transkrypcji RNA) jak i sekwencje DNA które, po transkrypcji w RNA, będą sygnalizować inicjowanie syntezy białka. Regiony takie zazwyczaj obejmują te 5'-nie kodujące sekwencje uczestniczące w inicjowaniu transkrypcji i translacji, takie jak sekwencja TATA, sekwencja czapeczkowa,
sekwencja CAAT itp.
W razie potrzeby nie kodujący region 3' względem sekwencji kodującej gen białka otrzymać można sposobami opisanymi powyżej. Region ten można zachować z uwagi na jego sekwencje regulujące terminację transkrypcji, np. terminację i poliadenylowanie. I tak, zachowując
region 3' sąsiadujący w naturze z sekwencją DNA kodującą białko uzyskać można sygnały terminacji transkrypcji. Gdy sygnały terminacji transkrypcji nie działają zadowalająco w komórce gospodarza, w której zachodzi ekspresja, to można go zamienić na region funkcyjny 3' w komórce
gospodarza.
Dwie sekwencje DNA (np. sekwencja regionu promotora i sekwencja kodująca chimerę
receptora CD4) są operacyjnie połączone, jeśli charakter połączenia między dwiema sekwencjami (1) nie spowoduje wprowadzenia mutacji przesuwającej ramkę, (2) nie zakłóca zdolności sekwencji regionu promotora do kierowania transkrypcją sekwencji genu chimery receptora albo (3)
nie zakłóca możliwości transkrypcji sekwencji genu chimery receptora przez sekwencję regionu
promotora. Region promotora powinien być operacyjnie połączony z sekwencją DNA, jeśli promotor ma być zdolny do skutecznej transkrypcji sekwencji DNA. Dlatego też, aby nastąpiła ekspresja białka, niezbędne sątranskrypcyjne i translacyjne sygnały rozpoznawane przez odpowiedniego
gospodarza.
Wynalazek obejmuje ekspresję białka chimery receptora CD4 (lub jego funkcyjnej pochodnej) w komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych, z tym że ekspresja w eukariotach
(a zwłaszcza w ludzkich limfocytach) jest korzystna.
Przeciwciała według wynalazku wytwarzać można dowolnym z szeregu sposobów. Tak
np. komórki, w których zachodzi ekspresja białka chimery receptora CD4 lub jego fimkcyjnej pochodnej, można wprowadzić do zwierzęcia, w celu wywołania u niego wytwarzania surowic zawierających poliklonalne przeciwciała zdolne do wiązania się z chimerą.
Zgodnie z korzystnym sposobem, przeciwciała według wynalazku stanowią przeciwciała
monoklonalne. Takie monoklonalne przeciwciała wytwarzać można techniką z hybrydomą (Kohler i inni, Nature 256:495 (1975); Kohler i inni, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler i inni,
Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling i inni, w: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., str. 563-684 (1981)). Ogólnie procedury takie obejmują immunizację
zwierzęcia antygenem chimery receptora CD4. Wydziela się limfocyty śledzionowe zwierzęcia i
przeprowadza się ich fuzję z odpowiednią linią komórek szpiczaka. Według wynalazku zastosować można dowolną odpowiednią linię komórek szpiczaka. Po fuzji uzyskane komórki hybrydomy selektywnie utrzymuje się w ośrodku HAT, po czym klonuje się je metodą ograniczonego
rozcieńczania, którą opisali Wand i inni (Gastroenterology 80:225-232 (1981). Komórki hybrydomy uzyskane w wyniku takiej selekcji bada się następnie w celu zidentyfikowania klonów,
które wydzielają przeciwciała zdolne do wiązania chimery.
Przeciwciała według wynalazku mogą również stanowić przeciwciała poliklonalne albo,
korzystnie, poliklonalne przeciwciała specyficzne względem regionu.
180 066
11
Przeciwciała przeciw chimerze receptora CD4 według wynalazku można zastosować do
monitorowania ilości chimery receptora (lub komórek przenoszących chimerę receptora) u pacjenta. Takie przeciwciała nadają się do stosowania w standardowym teście immunodiagnostycznym, znanym specjalistom, takim jak test immunometryczny lub „sandwiczowy”, taki jak test
sandwiczowy współbieżny, sandwiczowy przeciwbieżny lub sandwiczowy równoczesny. Przeciwciała stosować można w wielu różnych kombinacjach, co mogą łatwo ustalić specjaliści bez
niepotrzebnego eksperymentowania, tak aby przeprowadzić testy immunologiczne o dopuszczalnej specyficzności, czułości i dokładności.
Do standardowych prac podających ogólne zasady immunologii należą: Roitt, Essential Immunology, 6 wyd., Blackwell Scientific Publications, wydawca, Oxford (1988); Kimball, Introduction to Immunology, 2 wyd., Macmillan Publishing Co., wydawca, New York (1986); Roitt i inni,
Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., wydawca, London, (1985); Campbell, „Monoclonal
Antibody Technology”, w Burdon i inni, redakcja Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Volume 13, Elsevier, wydawca, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The
Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, wydawca, New York (1982); oraz
Kennett i inni, redakcja, Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological
Analyses, Plenum Press, wydawca, New York (1980).
Określenie „detekcja” obejmuje oznaczanie obecności lub braku substancji, albo ilościowe
oznaczanie substancji. Określenie to odnosi się do zastosowania materiałów, kompozycji i sposobów według wynalazku, w oznaczeniach jakościowych i ilościowych.
Przeciwciała i zasadniczo oczyszczony antygen według wynalazku idealnie nadają się do
wytwarzania zestawu. Taki zestaw może zawierać opakowanie podzielone na przedziały, w których umocowane są pojemniki, takie jak fiolki, probówki itp., z których każdy zawiera odrębne
składniki do wykonywania testu.
Istnieje wiele rodzajów testów, które można wykonywać z wykorzystaniem zestawów, takie jak np. testy konkurencyjne i nie konkurencyjne. Do typowych przykładowych testów, które
można przeprowadzać z wykorzystaniem przeciwciał według wynalazku, należą testy radioimmunologiczne (RIA), immunotesty enzymatyczne (EIA), enzymatyczne testy immunoadsorpcyjne (ELISA) oraz testy immunometryczne lub sandwiczowe.
Określenie „test immunometryczny” lub „immunologiczny test sandwiczowy” obejmują
test sandwiczowy współbieżny, sandwiczowy przeciwbieżny lub sandwiczowy równoczesny.
Określenia te są dobrze znane specjalistom. Dla specjalistów zrozumiałe jest również, że przeciwciała według wynalazku mogą być przydatne również w innych odmianach i formach testów,
znanych obecnie lub opracowanych w przyszłości. Testy takie uważa się za objęte zakresem wynalazku.
Określenie „specyficznie rozpoznaje i wiąże” oznacza, że przeciwciało rozpoznaje i wiąże
polipeptyd chimery receptora, ale zasadniczo nie rozpoznaje i nie wiąże innych niespokrewnionych cząsteczek w próbce, np. w próbce biologicznej.
„Komórka terapeutyczna” oznacza komórkę, która została transformowana chimerą receptora CD4 według wynalazku, tak że jest zdolna do rozpoznawania i niszczenia komórki zainfekowanej przez HTV; korzystnie takie komórki terapeutyczne stanowiąkomórki układu krwiotwórczego.
Określenie „pozakomórkowy” oznacza, że co najmniej część cząsteczki wystaje z powierzchni komórki. Określenie ’’wewnątrzkomórkowy” oznacza, że co najmniej część cząsteczki
wystaje do cytoplazmy komórki terapeutycznej. Określenie „przezbłonowy” oznacza, że co najmniej część cząsteczki przechodzi przez błonę komórkową. W użytym znaczeniu określenia
„część pozakomórkowa”, „część wewnątrzkomórkowa” i „część przezbłonowa” mogą obejmować flankujące sekwencje aminokwasów, które wystają do sąsiednich przedziałów komórki.
„Oligomeryzowanie” oznacza tworzenie kompleksu z innymi białkami z utworzeniem dimerów, trimerów, tetramerów i innych oligomerów wyższego rzędu. Takie oligomery mogą być
homooligomerami lub heterooligomerami. „Część oligomeryzująca” stanowi ten region cząsteczki, który kieruje tworzeniem kompleksu (czyli oligomeru).
12
180 066
Określenie „cytolityczny” oznacza zdolny do niszczenia komórki (np. komórki zainfekowanej przez HIV) lub zdolny do niszczenia czynnika infekcyjnego (np. wirusa HIV).
„Wirus upośledzenia odporności” oznacza retrowirusa, który w formie dzikiej jest zdolny do
infekowania komórek T4 gospodarza spośród naczelnych i wykazuje wirusową morfogenezę i morfologię charakterystyczną dla podrodziny wirusów wolno działających. Określenie to obejmuje
bez żadnych ograniczeń wszystkie warianty HIV i SIV, w tym HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm,
SIVmnd, SIVsmm, SlVman, SIVmand i SIVcpz.
„Niezależny od MHC” oznacza, że cytolityczna reakcja komórkowa nie wymaga obecności antygenu MHC klasy II na powierzchni docelowej komórki.
Określenie „funkcyjna pochodna przenosząca sygnał cytolityczny” oznacza funkcyjnąpochodną (określoną powyżej), która jest zdolna do ukierunkowania co najmniej 40%, jeszcze korzystniej co najmniej 70%, a najkorzystniej co najmniej 90% aktywności biologicznej cząsteczki
typu dzikiego. W użytym znaczeniu „funkcyjna pochodna przenosząca sygnał cytolityczny”
może działać przez bezpośrednie sygnalizowanie komórce terapeutycznej, aby zniszczyła ona
związany z receptorem czynnik lub komórkę (np. w przypadku wewnątrzkomórkowej części chimerycznego receptora), albo też może działać bezpośrednio, inicjując oligomeryzację z białkami
przenoszącymi sygnał cytolityczny w komórce terapeutycznej (np. w przypadku domeny
przezbłonowej). Skuteczność takich pochodnych można określać wykonując np. testy in vitro
opisane poniżej.
Określenie „funkcyjna pochodna wiążąca kopertę HIV oznacza funkcyjną pochodną
(określoną powyżej), która jest zdolna do wiązania dowolnego białka kopertowego HIV. Funkcyjne pochodne można identyfikować, wykonując np. testy in vitro opisane poniżej.
Podawanie terapeutyczne
Transformowane komórki według wynalazku można stosować do zwalczania wirusa upośledzenia odporności. Obecne sposoby podawania takich transformowanych komórek obejmują
immunoterapię adoptywną lub terapię z przenoszeniem komórek. Sposoby te umożliwiają zawrócenie transformowanych komórek układu odpornościowego do prądu krwi. Rosenberg,
Scientific American 62 (maj 1990); Rosenberg i inni, The New England Journal of Medicine 323
(9):570 (1990).
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać dowolnemu zwierzęciu,
w przypadku którego uzyskać można korzystne działanie związków według wynalazku. Do ssaków tych należą przede wszystkim ludzie, choć wynalazek nie ogranicza się do takiego rozwiązania.
Opis szczegółowy
Najpierw opisane zostaną rysunki.
Na figurze 1A pokazano sekwencję aminokwasów wokół miejsca fuzji pomiędzy CD4 (reszty
1-369) i różnymi łańcuchami receptorów. Sekwencja podkreślona oznacza pozycję aminokwasów
kodowanąmiejscu BamHI stosowanym w konstrukcji fuzji. Początek domeny przezbłonowej zaznaczono pionowym słupkiem. Sekwencja jest identyczna z sekwencją na końcu aminowym, ale różni się na końcu karboksylowym (Jin i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)). Na fig.
1B przedstawiono wyniki przepływowej analizy cytometrycznej powierzchniowej ekspresji CD4,
CD4:ζ CD4:y i CD4: η w komórkach CV1. Komórki zainfekowano ζ wirusem, w którym zachodzi
ekspresja chimery CD4 lub CD16p, inkubowano przez 9 godzin w 37°C i zabarwiono skoniugowanym z fikoerytryną anty-CD4 MAb Leu3 A.
Na figurze 2 pokazano powierzchniową ekspresję CD16TM po współinfekcji samym
CD16TM(gęste kropki) lub po współinfekcji wirusem, w którym zachodzi ekspresja CD4:y (kreski) lub CD4:ζ (linia ciągła). Rzadkie kropki - komórki zainfekowane samym CD4: ζ zabarwione 3G8 (Fleit i inni, Proc, Natl. Acad. Sei. USA 79:3275-3279 (1982)) (anty-CD16 MAb).
Na figurze 3 pokazano powierzchniową ekspresję CD16TMpo współinfekcji wirusami, w
których zachodzi ekspresja CD 16TMi po chimerachζ: CD4: ζ (grupa linia), CD4:ζ C11G (linia
ciągła); CD4: ζ (linia przerywana); CD4: ζ Cl 1G/D15G (gęste kropki); bez współinfekcji (sam
CD16TM, rzadkie kropki). Komórki inkubowano z anty-CD16 MAb 3G8 i skoniugowanymi z fi-
180 066
13
koerytryną kozimi przeciwciałami Fab'2 względem mysiego IgG. Poziom ekspresji chimery ζ
był zasadniczo identyczny dla różnych analizowanych mutantów, a współinfekcja komórek wirusami, w których zachodzi ekspresja CD 16XMi chimery ζ nie zmienia zasadniczo powierzchniowej ekspresji chimery.
Na figurach 4A-D pokazano zwiększony poziom wewnątrzkomórkowy wolnych jonów
wapniowych po sieciowaniu mutantowej chimery ζ w linii komórek T. Komórki Jurkata E6 (Weiss i inni, J. Immunol. 133:123-128 (1984) zainfekowano zrekombinowanymi wirusami krowianki i zanalizowano metodą cytometrii przepływowej. Wyniki przedstawiono dla wybranej
populacji CD4+, tak że analizowano tylko komórki, w których zachodzi ekspresja odpowiedniego białka chimerycznego. Średni stosunek fioletowej do błękitnej fluorescencji Indo-1 odzwierciedla wewnątrzkomórkowe stężenie wolnego wapnia w populacji jako całości, a procent
odpowiadających komórek odpowiada udziałowi komórek, w których nastąpiło przekroczenie
ustalonego stosunku progowego (należy zaznaczyć, że 10% komórek nie poddanych obróbce
daje wynik dodatni). Na fig. 4A i fig. 4B pokazano komórki Jurkata, w których zachodzi ekspresja CD4: ζ (linia ciągła) lub CD16:ζ (linia przerywana), eksponowane na anty-CD4 Mkb Leu3a
(koniugat fikoerytryny), a następnie sieciowane kozim przeciwciałem względem mysiego IgG.
Linia kropkowana pokazuje reakcję nie infekowanych komórek na anty-CD3 MAb OKT3. Na
fig. 4C i 4D pokazano komórki Jurkata, w których zachodzi ekspresja CD4: ζD 15G (linia ciągła);
CD4:ζ C11G/D15G (kreski); lub CD4: ζ C 11G (kropki), które poddano obróbce i zanalizowano
jak na fig. 4A i 4B.
Na figurach 5A-C pokazano, że receptory CD4: ζ, CD4: η, CD4:y umożliwiającytolitycznym limfocytom T (CTL) zabijanie celów w których zachodzi ekspresja HIV-1 gp 120/41.Fig.
5A: pełne kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4: ζ, inkubowane z komórkami HeLa, w
których zachodzi ekspresja gpl20/41; puste kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja Οϋ4:ζ,
inkubowane z nie zainfekowanymi komórkami HeLa; pełne kwadraty, nie zainfekowane CTL inkubowane z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41; puste kwadraty, nie zainfekowane CTL inkubowane z nie zainfekowanymi komórkami HeLa. fig. 5B: pełne kółka, CTL,
w których zachodzi ekspresja CD4: η, inkubowane z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20/41; puste kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4:y, inkubowane z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20/41; puste kwadraty, CTL, w których zachodzi
ekspresja podwójnego mutanta C 11G/D15G chimery CD4:ζ, inkubowane z komórkami HeLa, w
których zachodzi ekspresja gpl20/41. fig. 5C: Przepływowa analiza cytometryczna ekspresji
CD4 w CTL, pokazanej na fig. 5B. Aby skorygować stosunek celu do efektora, procent komórek,
w których zachodzi ekspresja chimery CD4, oznaczono odejmując skalowaną (nie zainfekowaną) populację przez nakładania histogramów; w celach porównawczych na rysunku nie zainfekowanym komórkom przypisano arbitralnie wielkość progową, która daje w wyniku w
przybliżeniu taką samą frakcję dodatnią jak w przypadku innych populacji komórek przy odejmowaniu histogramów.
Na figurach 6A-B pokazano specyficzność CD4-ukierunkowanej cytolizy. Fig. 6A: pełne
kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4:ζ, inkubowane z komórkami HeLa, w których
zachodzi ekspresja CD 16P1; puste kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4 inkubowanego
z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20; pełne kwadraty, CTL, w których zachodzi ekpresja CD16: ζ inkubowanego z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja
gp 120/41; puste kwadraty, CTL, w których zachodzi ekspresja CD 16PI inkubowanego z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41. Fig. 6B: pełne kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4: ζni kubowanego z komórkami Raji (MHC klasa II+); puste kółka, nie
zainfekowane komórki CTL inkubowane z komórkami RJ 2.2.5 (MHC klasa I I mutanta Raji);
pełne kwadraty, nie zainfekowane CTL inkubowane z komórkami Raji (MHC klasa II+); puste
kwadraty, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4: ζ inkubowane z RJ2.2.5 (MHC klasa ΙΓ). Oś
rzędnych rozszerzono.
Na figurach 7A-B pokazano charakterystykę chimerycznego receptora CD 16: ζ. Fig. 7A
przedstawia schematycznie diagram białka fuzyjnego CD 16: ζ. Pozakomórkową część połączo-
14
180 066
nej z fosfatydyloinozytolem formy monomerycznego CD 16 połączono z dimerycznym ζ tuż
poza przezbłonową domeną. Sekwencję białkową w połączeniu fuzyjnym pokazano na dole. Na
fig. 7B pokazano przepływową analizę cytometrycznąmobilizacji białkowej po sieciowaniu chimery CD 16: ζ w TCR-dodatniej lub TCR-ujemnej linii komórek. Pokazano średni stosunek fluorescencji fioletowej do błękitnej (miara względnego stężenia jonów wapniowych) w populacjach
komórek traktowanych przeciwciałami w czasie 0. Pełne kwadraty, reakcja komórek Jurkata na
anty-CD3 MAb OKT3; pełne trójkąty, reakcja CD 16:ζ na anty-CD 16 MAb 3G8 usieciowane z mutantem REX33A TCR"; puste kwadraty, reakcja na CD 16: ζ usieciowany w linii mutantowej Jurkata
TCR- JRT3 ,T3.5; puste trójkąty, reakcja na CD 16 :ζ usieciowane w komórkach Jurkata; krzyże, reakcja na niechimeryczne CD 16 w komórkach Jurkata; kropki, reakcja na niechimeryczne CD 16 w
linii komórek REX33A TCR'.
Na figurach 8A-B pokazano analizę delecji cytolitycznego potencjału. Na fig. SA pokazano
lokalizacje końcowych punktów delecji ζ W tym przypadku, podobnie jak we wszystkich innych,
mutacje w ζ są przedstawione w konwencji reszta wyjściowa-lokalizacja-reszta mutantowa, tak że
np. D66* oznacza zastąpienie Asp-66 przez kodon terminacji. Na fig. 5B pokazano wyniki testu
cytolizy CD 16: ζ bez delecji oraz skokowych delecji ζ. Komórki hybrydomy, w których zachodzi
ekspresja powierzchniowych przeciwciał do CD 16 obciążono 5'Cr i inkubowano ze zwiększającąsię liczbą ludzkich cytolitycznych limfocytów (CTL) zainfekowanych rekombinantami
krowianki, w których zachodzi ekspresja chimery CD16: ζ Procent uwolnionego 51Cr wykreśla
się w funkcji stosunku komórek efektorowych (CTL) do docelowych (hybrydoma) (e/t). Pełne
kółka, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja CDI6: ζ (mfi 18.7); pełne
kwadraty, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja CD 16: ζ Asp66* (mfi
940.2); puste kwadraty, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja CD16:ζ
Glu60* (mfi 16.0); puste kółka, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja
CD 16:ζTyr51* (mfi 17.4); pełne trójkąty, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja CD16:ζ Phe34* (mfi 17.8); oraz puste trójkąty, cytoliza z udziałem komórek, w których
zachodzi ekspresja niechimerycznego CD 16 (mfi 591). Jakkolwiek w tych eksperymentach ekspresja CD 16: ζ Asp66* nie była dopasowana do ekspresji innych białek fuzyjnych, cytoliza przez
komórki, w których zachodzi ekspresja CD 16: ζ w równoważnych poziomach w tym samym eksperymencie dała wyniki zasadniczo identyczne do uzyskiwanych w przypadku komórek, w których zachodzi ekspresja CD16: ζ Asp66.
Na figurach 9A-D pokazano, że eliminacja potencjału dla oddziaływań przezbłonowych ujawnia krótki segment ζ zdolny do uczestniczenia w cytolizie. Fig. 9A przedstawia schematyczny
diagram monomerycznych chimer dwudzielnych i trójdzielnych. Na górze znajduje się konstrukt
CD 16: ζ ucięty przy reszcie 65, nie zawierający przezbłonowych reszt Cys i Asp. Poniżej znajdują
się konstrukty CD 16: CD5:ζi CD 16: CD7: ζ oraz zbliżone elementy kontrolne. Sekwencje peptydowe wewnątrzkomórkowych domen pokazano poniżej. Na fig. 9B przedstawiono cytolityczną
aktywność delecyjnych mutantów monomerycznej chimery. Cytolityczną aktywność komórek, w
których zachodzi ekspresja CD16: ζ (pełne kółka; mfi 495) porównano z aktywnością komórek, w
których zachodzi ekspresja CD 16:ζ Asp66* (pełne kwadraty; mfi 527) lub mutantów CD 16:ζ Cys11Gly/Asp 15Gly/Asp66* (puste kwadraty; mfi 338) oraz CD16: ζ Cys 11Gly/Asp 15Gly/Glu60*
(pełne trójkąty; mfi 259). Na fig. 9C przedstawiono cytolityczną aktywność z udziałem trójdzielnych białek fuzyjnych. Pełne trójkąty, CD16: ζ Asp66*; puste kwadraty, CD 16:5: ζ (48-65); pełne
kwadraty CD16:7: ζ (48-65); puste trójkąty, CD16:7:ζ (48-59); puste kółka, CD16:5; pełne kółka,
CD16:7. Na fig. 9D przedstawiono mobilizację wapnia przez mutantowe i trójdzielne chimery w
TCR-ujemnej mutantowej linii komórek Jurkata JRT3.T3.5. Puste kółka, reakcja komórek, w których zachodzi ekspresja dimerycznego CD16: ζ Asp66*; pełne kwadraty, reakcja komórek, w których zachodzi ekspresja CD16:ζ Cys 11Gly/Asp 15Gly/Asp66*; puste kwadraty, reakcja komórek, w
których zachodzi ekspresja CD16 ζCys 11Gly/Asp 15Gly/Glu60*; pełne trójkąty, reakcja komórek,
w których zachodzi ekspresja CD 16: 7: ζ (48-65); oraz puste trójkąty, reakcja komórek, w których zachodzi ekspresja CD16: ζ (48-59).
180 066
15
Na figurach 1OA-F pokazano udział poszczególnych aminokwasów w aktywności 18-resztowego motywu przenoszącego sygnał cytolityczny. Na fig. 10A i 10 B pokazano cytolityczną
aktywność, a na fig.10C pokazano mobilizację jonów wapniowych z udziałem chimer przenoszących mutacje punktowe w pobliżu tyrozyny na końcu karboksylowym (Y62). Na fig. 10A i
10B przedstawiono dane zebrane dla komórek, w których zachodzi odpowiednio ekspresja
małych i dużych ilości białek fuzyjnych CD16: ζ Identyczne symbole użyto w przedstawianiu
wyników mobilizacji wapnia i testów cytolizy, przedstawiając je kodem jednoliterowym z prawej strony. Pełne kółka, komórki, w których zachodzi ekspresja CD 16: ζ (mfi in A, 21; B, 376);
pełne kwadraty, komórki, w których zachodzi ekspresja CD16:7:ζ (48-65) (mfi A, 31; B, 82); puste kwadraty CD 16:7: ζ (48-65) Glu60Gln (mfi A, 33; B, 92), krzyże, CD 16:7: ζ (48-65)Asp63Asn
(mfi A, 30; B, 74); pełne trójkąty, CD16:7:ζ (48-65)Tyr62Phe (mfi A, 24; B, 88); puste kółka,
CD16:7: ζ (48-65)Glu61Gln (mfi A, 20; B, 62); oraz puste trójkąty, CD16:7: ζ (48-65)Tyr62Ser
(mfi B, 64). Na fig. 1OD i 10E pokazano cytolityczną aktywność, a na fig. 10F pokazano mobilizację jonów wapniowych przez chimery przenoszących mutacje punktowe w pobliżu tyrozyny
na końcu aminowym (Y51). Identyczne symbole użyto w przedstawianiu wyników mobilizacji
wapnia i testów cytolizy, przedstawiając je z prawej strony. Pełne kółka, komórki, w których zachodzi ekspresja CDI 6 ζζ: (mfi w D, 21.2; w E, 672); pełne kwadraty, komórki, w których zachodzi ekspresja CD 16:7: (48-65) (mfi D, 31.3; E, 179); pełne trójkąty, CD16:7: ζ (48-65)Asn48Ser
(mfi D, 22.4; E, 209); puste kwadraty, CD 16:7:ζ(48-65)Leu50Ser (mfi D, 25.0; E, 142); oraz puste trójkąty, CD16:7: ζ (48-65)Tyr51Phe (mfi D, 32.3; E, 294).
Na figurach 11A-B pokazano ułożenie wewnętrznych powtórek ζ i porównano ich zdolność do podtrzymywania cytolizy. Fig. 11A przedstawia schematyczny diagram chimer utworzonych przez podział wewnątrzkomórkowej domeny ζ na 3 części oraz dołączenie ich do
przezbłonowej domeny chimery CD 16:7. Sekwencje wewnątrzkomórkowych domen pokazano
poniżej, ze wspólnymi resztami w ramkach, a zbliżone reszty zaznaczono gwiazdkami. Na fig.
11B pokazano zdolność cytolityczną 3 subdomenζ Pełne kółka, komórki, w których zachodzi
ekspresja CD16:ζ (mfi 476); pełne kwadraty, CD16:7: ζ (33-65) (mfi 68); puste kwadraty,
CD16: 7: ζ (71-104) (mfi 114); oraz pełne trójkąty, CD16: 7: ζ (104-138) (mfi 104).
Na figurze 12 pokazano schematycznie diagram chimery CD 16: FcRyll.
Na figurach 13A-B pokazano mobilizację wapnia po sieciowaniu chimer CD4:FcRyII i
CD 16: FcRyll. Na fig. 13A pokazano stosunek fluorescencji fioletowej do błękitnej emitowanej
przez komórki obciążone wrażliwym na wapń fluoroforem Indo-1 w funkcji czasu po sieciowaniu pozakomórkowej domeny CD 16 przeciwciałami. Na fig,13B pokazano wyniki podobnej
analizy wzrostu stosunku fluorescencji fioletowej do błękitnej dla komórek przenoszących chimery CD4:FcRyII, po sieciowaniu przeciwciałami.
Na figurach 14A-B pokazano wyniki testu cytolizy chimer CD4:FcRyII i CD 16: FcRyll.
Na fig.14A pokazano procent 5ICr uwolnionego z komórek hybrydomy anty-CD16 (cel), gdy
komórki były eksponowane na zwiększającą się liczbę cytotoksycznych limfocytów T, w których zachodzi ekspresja chimer CD 16: FcRyll (komórki efektorowe). Na fig. 14B pokazano wyniki podobnej analizy cytotoksyczności z udziałem chimer CD4:FcRyII w stosunku do komórek
docelowych, w których zachodzi ekspresja glikoprotein kopertowych HIV.
Na figurach 15A-E przedstawiono identyfikację reszt w ogonie FcRyll A, istotnych dla cytolizy. Fig. 15A przedstawia schematycznie diagram konstruktów delecyjnych. Na fig. 15B i 15C pokazano mobilizację wapnia i cytolizę karboksy-końcowe delecyjne warianty CD16: FcRyll A. Na fig.
15D i 15E pokazano mobilizację wapnia i cytolizę przez trójdzielne chimery przenoszące coraz
mniejszą część końca aminowego wewnątrzkomórkowego ogona CDI 6: FcRyll A.
Na figurze 16 (SEQ ID NO: 24) pokazano sekwencję aminokwasów białka 5 receptora
CD3; sekwencje w ramkach przedstawiają korzystną część przenoszącą sygnał cytolityczny.
Na figurze 17 (SEQ ID NO: 25) pokazano sekwencję aminokwasów białka receptorowego y
T3; sekwencje w ramkach przedstawiają korzystną część przenoszącą sygnał cytolityczny.
Na figurze 18 (SEQ ID NO: 26) pokazano sekwencję aminokwasów białka receptorowego
m bl; sekwencje w ramkach przedstawiają korzystną część przenoszącą sygnał cytolityczny.
16
180 066
Na figurze 19 (SEQ ID NO: 27) pokazano sekwencję aminokwasów białka receptorowego
B28; sekwencje w ramkach przedstawiają korzystną część przenoszącą sygnał cytolityczny.
Na figurach 20A-E pokazano schematyczny diagram chimer CD4. Cząsteczkę „A” stanowi CD4 (D1-D4): Ig:CD7; cząsteczkę „B” stanowi CD4 (D1, D2): Ig:CD7; cząsteczkę „C” stanowi CD4 (D1-D4): Ig:CD7:ζ; cząsteczkę „D” stanowi CD4 (D l, D2): Ig:CD7: ζ ; a cząsteczkę
„E” stanowi CD4:ζ Pozakomórkową domenę ludzkiej cząsteczki CD4 odpowiadającą aminokwasom 1-394 prekursora połączono poprzez miejsce BamHI z zawiasą, domeny CH1 i CH2 ludzkiego IgGl, w sposób opisany uprzednio (Zettlmeissl i inni, DNA Cell Biol. 9:347 (1990)), z
tym że wersję cDNA sekwencji ludzkiego Igs zastosowano, aby umożliwić ekspresję w rekombinantach wirusa krowianki. Dwu-domenową wersję chimery CD4 stworzono przez wstawienie
adaptora BamHI w unikatowe miejsce Nhel (odpowiadające aminokwasowi 200) w cDNA prekursora CD4. Sekwencje łączące się z błoną zawierały 22 reszty z pierwszego egzonu ludzkiego
IgG 1, związanego z błoną, a następnie reszty 146-203 CD7. Aminokwasy 55-163 z ζ, służyły jako
motyw spustowy czterodzielnych konstruktów (C i D). W czterodzielnych konstruktach zawierających łańcuch ζ wewnątrzkomórkową ekspresję ζ udokumentowano, stosując dostępne w
handlu przeciwciała przeciw wewnątrzkomórkowej domenie (Coulter).
Na figurze 21 pokazano cytolizę docelowych komórek, w których zachodzi ekspresja glikoproteiny kopertowej HIV-1 z udziałem cytotoksycznego klonu komórek T, WH3, w których
zachodzi ekspresja różnych chimer pochodzących z CD4 jako cząsteczek efektorowych. W testach cytotoksyczności ludzką ograniczoną linię komórek CD8* CD4' HLA B44, WH3, utrzymywano w IMDM uzupełnionym 10% ludzkiej surowicy, jak to opisano powyżej. Komórki
pobudzano y-napromieniowanymi (3000 rad), B44- przenoszącymi jednojądrowymi komórkami i fitohemaglutyniną(PRA) w stężeniu 1μ
g/ml. Po pobudzaniu przez 1 dzień RPA rozcieńczono do 0,5 μg/ml dodając świeży ośrodek; po 3 dniach ośrodek całkowicie zmieniono. Komórki
hodowano przez co najmniej 10 dni przed zastosowaniem w testach cytotoksyczności. Komórki
zainfekowano odpowiednimi rekombinantami wirusów krowianki w sposób podany w opisie dla
vPE16. Całość pozostawiono na 3-4 godziny w celu zajścia infekcji w pełnym ośrodku, po czym
komórki zebrano przez odwirowanie ponownie zawieszono w stężeniu 1 x 1 07/ml. Próbkę 100 μl
dodano do każdej studzienki płytki mikrotiter z dnem w kształcie litery U zawierającej 100
μl/studzienkę pełnego ośrodka i rozcieńczono kolejno dwukrotnie. Dwie studzienki dla każdej
próbki nie zawierały limfocytów, aby umożliwić pomiar spontanicznego uwalniania chromu i
całkowite wchłanianie chromu. Komórki docelowe, HeLapodlinia S3 (HeLa-S3, ATCC) zainfekowano jak wyżej na 10 cm szalkach w vPE16.106zainfekowanych komórek oddzielono w PBS
i 1 mM EDTA, odwirowano i ponownie zawieszono w 100 μl 5'CR chromianu sodowego (1
mCi/ml w PBS) na 1 godzinę w 37° ζ po czym przemyto 3 razy PBS. 100 μl znaczonych komórek
docelowych dodano do każdej studzienki. Płytkę mikrotiter odwirowano przy 750 x g przez 1 minutę i inkubowano przez 4 godziny w 37°C. Pod koniec okresu inkubacji, komórki w każdej studzience ponownie zawieszono przez łagodne pipetowanie, pobrano próbkę do oznaczenia
całkowitego wprowadzonego zliczenia i płytkę mikrotiter odwirowano przy 750 x g przez 1 minutę. Próbki (100 μl) supematantu pobrano i zliczono w liczniku scyntylacyjnym promieniowania y. Stosunek efektor:cel skorygowano, uwzględniając procent komórek zainfekowanych,
oznaczony metodą cytometrii przepływowej.
Na figurze 22 pokazano replikację HIV-1 w transfekowanych liniach komórek. Linie komórek, w których zachodzi trwała ekspresja dzikiego typu CD4 różne rekombinantowe chimery
założono w podlinii ludzkiej linii komórek embrionalnych nerki 293. Przygotowano bazowy izolat HTV-1 IIIB o mianie ~106 infekcyjnych cząstek/ml oznaczonym metodą rozcieńczania do
punktu końcowego z zastosowaniem ludzkiej linii komórek T C8166 jako wskaźnika. Infekcje
prowadzono w przybliżonym MOI 1 przez 8-12 godzin w 37°C. Następnego dnia komórki przemyto PBS 3 razy, trypsynizowano, wysiano na nowych szalkach pobrano próbki supematantów
hodowli w celu oznaczenia miana p24 (dzień 0). Następnie w odstępach 3-4 dniowych zbierano
supematanty hodowli komórek i przechowywano do oznaczania p24. Hodowle komórek uzupełniono świeżym ośrodkiem zawierającym higromycynę B w stężeniu 100 μg/ml. Analizę su-
180 066
17
pematantów hodowli przeprowadzono, stosując dostępny oparty na teście ELISA zestaw do
oznaczania antygenu HIV-1 p24 (Coulter) zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta. Wyniki odnoszą się do dwóch niezależnych doświadczeń o podobnym czasie trwania.
Na figurze 23 pokazano sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów domen D 1-D4
w CD4 (CD4 Bam).
Na fierurze 24 pokazano sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów domen D1-D2
(CD4 Nhe).
Na figurze 25 pokazano sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów zawiasy, CH2,
domen CH3 ludzkiego IgGl (Igh23 Bam).
Na figurze 26 pokazano sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów domeny
przezbłonowej CD7 (TM7 Bam Mlu).
Na figurze 27 pokazano sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów domeny
wewnątrzkomórkowej ζ (Zeta Mlu Not).
Na figurze 28 pokazano sekwencję DNA i główną sekwencję aminokwasów syntetycznej
helisy a
Przykład I
Konstrukcja chimer ludzki IgGI. receptor
Ludzkie sekwencje ciężkiego łańcucha IgG1 otrzymano przez połączenie sekwencji w domenie CH3 z fragmentem cDNA pochodzącym z końca 3' przezbłonowej formy przeciwciała
mRNA. Fragment końca 3' otrzymano w polimerazowej reakcji łańcuchowej, stosując bibliotekę
cDNA z migdałka jako substrat, oraz oligonukleotyd zawierające sekwencje:
CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (SEQ ID NO: 7) oraz
CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT
CA (SEQ ID NO:8),
odpowiadające odpowiednio końcom 5' i 3' pożądanych fragmentów DNA. 5' oligo jest komplementarny z miejscem w domenie Ch I ludzkiego IgGl, a 3' oligo jest komplementarny miejscem
przy 5' sekwencji kodujących domenę przenikającą błonę. Produkt PCR strawiono BstXI BamHI
zligowano pomiędzy miejsca BstXI i BamHI półsyntetycznego genu przeciwciała IgGl przenoszącego zmienne i stałe regiony. Po insercji fragmentu BstXI do BamHI, zamplifikowane części konstruktu wstawiono w miejsce Smal w C h 3 poprzez restrykcyjną wymianę fragmentów,
tak tylko jedna część pomiędzy miejscem Smal i 3' oligo pochodzi z reakcji PCR.
W celu wytworzenia ludzkiego chimerycznego receptora Ig G l: , gen ciężkiego łańcucha
kończący się w miejscu BamHI połączono z miejscem BamHI chimeryζ opisanej poniżej, tak że
sekwencje przeciwciała utworzyły część pozakomórkową. Cytomeria przepływowa komórek
COS transfekowanych plazmidem kodującym chimerę wykazała wysoki poziom ekspresji determinantów przeciwciała przy współtransfekcji plazmidu ekspresji kodującym cDNA lekkiego
łańcucha, oraz nieznaczną ekspresję determinantów przeciwciała w nieobecności plazmidu ekspresji lekkiego łańcucha.
Podobne chimery zawierający ludzki IgGl połączony zηlub y (patrz poniżej), lub z dowolną przenoszącą sygnał częścią białka receptora komórki T lub receptora Fc można skonstruować zasadniczo w sposób opisany powyżej, wykorzystując standardowe techniki biologii
molekularnej.
W celu utworzenia pojedynczej jednostki transkrypcyjnej, która mogłaby umożliwić ekspresję zarówno ciężkiego jak i lekkiego łańcucha z pojedynczego promotora, stworzono plazmid
kodujący bi-cistronowy mRNA z ζ i kodujących ciężki i lekki łańcuch, oraz 5' nietranslatowaną
częścią mRNA kodującego regulowane przez glukozę białko o 78 kD, określane jako grp78 lub
BiP. Sekwencje grp78 uzyskano metodąPCR ludzkiego genomowego DNA, stosując startery zawierające sekwencje:
CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (SEQ ID NO: 9) oraz
CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEQ ID NO: 10)
odpowiednio na końcach 5' i 3'. Polimerazowe reakcje łańcuchowe z tymi oligomerami przeprowadzono w obecności 10% dimetylosulfotlenku. Fragment uzyskany PCR strawiono Notl i Hin-
18
180 066
cII i wstawiono pomiędzy miejsca NotI i HpaI w dół od sekwencji kodujących ludzki IgG1.
Sekwencje kodujące cDNA lekkiego łańcucha ludzkiego IgGKwstawiono następnie w dół od lidera grp78 wykorzystując miejsce HincII i inne miejsce w wektorze. Plazmid ekspresji uzyskany
w wyniku tych manipulacji zawierał półsyntetyczny gen ciężkiego łańcucha, a następnie kolejno
sekwencje lidera grp78, sekwencje k cDNA lekkiego łańcucha oraz sygnały poliadenylowania
pochodzące z fragmentu DNA SV40. Transfekcja komórek COS plazmidem ekspresji zapewniła
znacznie zwiększoną ekspresję determinantów ciężkiego łańcucha w porównaniu z transfekcją
plazmidu kodującego tylko determinanty ciężkiego łańcucha.
W celu stworzenia genu bicistronowego zawierającego chimerę ciężki łańcuch/receptor
lekki łańcuch, sekwencje w górę ciężkiego łańcucha można zastąpić dowolnym opisanym chimerycznym genem ciężki łańcuch/receptor.
P r z y k ł a d II
Konstrukcja chimer receptora CD4
Ludzki cDNA ζ (Weissman i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9709-9713 (1988b) oraz y
(Küster i inni, J. Biol. Chem. 265:6448-6452 (1990) wydzielono metodą polimerazowej reakcji
łańcuchowej z bibliotek uzyskanych z linii komórek nowotworowych HPB-ALL (Aruffo i inni,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987b)) oraz z ludzkich naturalnych komórek zabijaczy, podczas gdy cDNA (Jin i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990) wydzielono z biblioteki mysich tymocytów. ζ, η i y cDNA połączono z pozakomórkową domeną
skonstruowanej formy CD4 zawierającej miejsce BamHI tuż w górę od domeny przechodzącej
przez błonę (Aruffo i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987b); Zettlmeissl i inni,
DNA Cell Biol. 9-347-353 (1990)), która była połączona z miejscem BamHI występującym naturalnie w ζ iηcDNA w podobnym miejscu kilka reszt w górę od domeny przechodzącej przez
błonę (SEQ IN NOS: 1,3,4 i 6). W celu uzyskania białka fuzyjnego z y miejsce BamHI wstawiono do sekwencji w przybliżeniu w tym samym miejscu (fig. 1; SEQ ID NO: 2 i 5). Fuzje genowe
wprowadzono do plazmidu ekspresji wirusa krowianki przenoszącego gen gpt E. coli jako marker selekcjonujący, oraz wstawiono do genomu szczepu krowianki W R na drodze homologicznej
rekombinacji i selekcji względem wzrostu w kwasie mikofenolowym (Falkner i inni, J. Virol.
62:1849-1854 (1988); Boyle i inni, Gene 65:123-128 (1988)). Przepływowa analiza cytometryczna wykazała, że rekombinanty krowianki kierują obfitym wytwarzaniem białek fuzyjnych
CD4: ζ i nd CD4: y na powierzchni komórki, podczas gdy ekspresja CD4: η jest znacząco słabsza
(fig. IB). To ostatnie odkrycie jest zgodne z najnowszym doniesieniem, że transfekcja plazmidu
ekspresji η cDNA w mysiej linii komórek hybrydomy zapewnia znacznie słabszą ekspresję niż
transfekcja porównywalnego plazmidu ekspresji ζ (Clayton i inni, J. Exp. Med. 172:1243-1253
(1990)). Immunostrącanie komórek zainfekowanych rekombinantami krowianki potwierdziło,
że białka fuzyjne tworzą kowalencyjne dimery w przeciwieństwie do występującego naturalnego
antygenu CD4. Stwierdzono, że masy cząsteczkowe monomerycznych białek fuzyjnych CD4: ζ i
CD4: y oraz natywnego CD4 wynoszą odpowiednio 63, 55 i 53 kD. Większe masy białek fuzyjnych w przybliżeniu odpowiadają większej długości części wewnątrzkomórkowych, przewyższających długość natywnej CD4 o 75 (CD4: Q lub 5 (CD4: y) reszt.
P r z y k ł a d III
Chimery CD4 mogą ulegać asocjacji z innymi łańcuchami receptora
Ekspresję na powierzchni komórek formy makrofag/naturalna komórka zabijacz ludzkiego Fcy RIII (CDI 6tm) na transfektantach ułatwia się poprzez współtransfekcję z mysim (Kurosaki i inni, Nature 342:805-807 (1989)) lub ludzkim (Hibbs i inni, Science 246:1608-1611 (1989))
y, a także z ludzkim ζ (Lanier i inni, Nature 342:803-805 (1989)).
Zgodnie z tymi doniesieniami ekspresja chimer również umożliwia powierzchniową ekspresję CD16t m po doprowadzeniu do komórki docelowej na drodze współtransfekcji lub
współinfekcji zrekombinowanymi wirusami krowianki (fig. 2). Ułatwianie powierzchniowej
ekspresji CD 16TMprzezę było znaczniejsze niż w przypadku y (fig. 2) w badanej linii komórek,
natomiast natywny CD4 nie wzmacniał powierzchniowej ekspresji CD16TM.
180 066
19
P r z y k ł a d IV
Mutanty Asp ζ nie współasocjują z receptorem PC
W celu stworzenia chimer, które mogłyby nie asocjować z istniejącym antygenem lub receptorami Fc, wytworzono mutantowe białka fuzyjneζ, które nie zawierały reszt, wewnątrzbłonowej
Asp i/lub wewnątrzbłonowej Cys. Cytometria przepływowa wykazała, że nie występuje znacząca
różnica w intensywności ekspresji na powierzchni komórek w przypadku różnych chimer mutantowych w porównaniu z nie mutowanym prekursorem, a eksperymenty immunoprecypitacji wykazały, że całkowita ekspresja przez chimery przebiega podobnie. Zgodnie z oczekiwaniem,
chimery mutantowe nie zawierające przezbłonowej reszty cysteiny nie tworzą dimerów z
połączeniem disulfidowym. Dwie mutantowe chimery pozbawione Asp nie były zdolne do podtrzymywania powierzchniowej ekspresji CD16TM, a monomeryczne chimery nie zawierające
Cys, ale zawierające Asp, umożliwiają koekspresję CD16TM, ale z mniejszą wydajnością niż dimer macierzysty (fig. 3).
Przykład V
Mutantowe receptory zachowują zdolność do inicjowania reakcji wapniowej
W celu ustalenia, czy sieciowanie białek fuzyjnych może spowodować nagromadzanie się
wolnego wewnątrzkomórkowego wapnia w podobny sposób jak w przypadku receptora antygenu komórki T, komórki ludzkiej linii komórek białaczki T, Jurkat E6 (ATCC Accessior Number
TIB 152, American Type Culture Collection, Rockville, MD), zainfekowano rekombinantami
krowianki i zmierzono względne cytoplazmatyczne stężenie wapnia po sieciowaniu pozakomórkowej domeny z przeciwciałami. Pomiary metodą cytometrii przepływowej przeprowadzono dla
komórek obciążonych wrażliwym na wapń barwnikiem Indo-1 (Grynkiewicz i inni, J. Biol.
Chem. 260:3340-3450 (1985); Rabinovitch i inni, J. Immunol. 137:952-961 (1986). Na fig.
4A-D pokazano wyniki eksperymentów z przepływem wapnia dla komórek zainfekowanych
CD4: oraz mutantami Asp"
ζ i Cys'. Sieciowanie chimer powtarzanie zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom wapnia. CD4:η i CD4: y również umożliwiają nagromadzanie wewnątrzkomórkowego wapnia w zainfekowanych komórkach. Komórki Jurkata wytwarzają w wyniku ekspresji
mniejsze ilości CD4 na powierzchni, z tym że sieciowanie natywnego CD4 w obecności lub bez
CD I6: ζ nie wpływa na wewnątrzkomórkowy poziom wapnia (fig. 4A-B).
P r z y k ł a d VI
Chimery η oraz y uczestniczą w cytolizie celów, w których zachodzi ekspresja HIV
gp 120/41
W celu stwierdzenia, czy chimeryczne receptory mogą uruchamiać cytolityczne programy
efektorowe, stworzono modelowy układ cehefektor oparty na rozpoznawaniu przez CD4 kompleksu kopertowego HIV gp 120/gp41. Komórki HeLa zainfekowano rekombinantowymi wirusami krowianki, w których zachodzi ekspresja gp 120/gp41 (Chakrabarti i inni, Nature 320:535-537
(1986); Earl i inni, J. Virol. 64:2448-2451 (1990)) oraz wykonano znakowanie 51Cr. Znakowane
komórki inkubowano z komórkami z ludzkiej allospecyficznej (CD8+, CD4") cytotoksycznej linii limfocytów T, którą zainfekowano rekombinantami krowianki, w których zachodzi ekspresja
chimer CD4:ζ CD4:ηlub CD4: y, lub podwójną mutantową chimerą CD4: ζ
11GIy:Aspl5Gly. Na fig. 5A-C pokazano, że komórki HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41 zostały
specyficznie zlizowane przez cytotoksyczne limfocyty T (CTL), w których zachodzi ekspresja
chimery CD4. Niezainfekowane komórki HeLa nie stanowiły celu dla CTL zawierającymi chimery CD4: ζ, a komórki HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20/41 nie były rozpoznawane
przez nie zainfekowane CTL. W celu porównania działania różnych chimer stosunki efektor:cel
skorygowano uwzględniając frakcję CTL, w których zachodzi ekspresja chimer CD4, oraz frakcję komórek HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41, oznaczone metodą cytometrii
przepływowej.
Na figurze 5C pokazano cytometryczną analizę ekspresji CD4 przez CTL stosowane w
eksperymentach cytolizy pokazanych Na fig. 5A i 5B. Jakkolwiek średnia gęstość powierzchniowa CD4: ζ znacznie przewyższa średnią gęstość CD4: η to cytolityczne zdolności komórek,
w których zachodzi ekspresja obydwu form były podobne. Przy korygowaniu uwzględniającym
20
180 066
frakcję celów, w których zachodzi ekspresja gp120, skuteczności cytolizy z udziałem białek
CD4: ζ i CD4: η są porównywalne z najlepszymi podawanymi skutecznościami dla par cel:efektor określonego receptora komórki T (średni stosunek efektora do celu dla 50% uwalniania
przez komórki T, w których zachodzi ekspresja CD4: ζ wynosił 1,9 ± 0,99, n = 10. Fuzja CD4: y
była mniej aktywna, podobnie jak fuzja CD4: ζ nie zawierająca przezbłonowych reszt Asp i Cys.
Jednakże w obydwu przypadkach zaobserwowano znaczącą cytolizę (fig. 5B-C).
Aby sprawdzić ewentualność, że infekcja krowianką może ułatwić artefaktyczne rozpoznawanie przez CTL, przeprowadzono podobne eksperymenty cytolizy z komórkami docelowymi zainfekowanymi rekombinantami krowianki, w których zachodzi ekspresja formy CD 16
połączonej z fosfatydyloinozytolem (CD16PI) i znakowanymi51CR, oraz z CTL zainfekowanymi kontrolnymi rekombinantami, w których zachodzi ekspresja CD16PI lub CD 16: ζ. Na fig. 6A
pokazano, komórki T, w których zachodzi ekspresja chimer nie-CD4, nie rozpoznająnatywnych
komórek HeLa lub komórek HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41, oraz, podobnie, że
komórki T, w których zachodzi ekspresja chimer CD4, nie rozpoznają komórek HeLa, w których
zachodzi ekspresja innych białek powierzchniowych kodowanych przez krowiankę. Na dodatek
CTL, w których zachodzi ekspresja niechimerycznego CD4, nie powodują w znaczącym stopniu
lizy komórek HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20/41 (fig. 6A).
P r z y k ł a d VII
Komórki przenoszące MEC klasy II nie stanowią celu dla chimer
Uważa się, że CD4 oddziaływuje z niepolimorficzną sekwencją wytwarzaną w wyniku
ekspresji przez antygen MHC klasy II (Gay i inni, Nature 328:626-629 (1987); Sleckman i inni,
Nature 328:351-353 (1987)). Jakkolwiek specyficzne oddziaływanie między CD4 i antygenem
klasy II nigdy nie zostało udokumentowane na oczyszczonych białkach, w pewnych warunkach
można było stwierdzić adhezję komórek, w których zachodzi ekspresja CD4, do komórek, w których zachodzi ekspresja cząsteczek klasy II (Doyle i inni, Nature 330:256-259 (1987); Clayton i
inni, J. Exp. Med. 177:1243-1253 (1990); Lamarre i inni,. Science 245:743-746 (1989)). Zbadano następnie, czy można wykryć zabijanie komórek przenoszących klasę II. Na fig. 6B pokazano, że nie obserwuje się specyficznej cytolizy skierowanej przez CD4: ζ przeciw linii komórek
Raji B, w których zachodzi obfita ekspresja antygenu klasy U. Jakkolwiek zaobserwowano słabą
(~ 5%) cytolizę, mutant klasy II-ujemny Raji, RJ2.2.5, (Accolla J. Exp. Med. 157:1053-1058
(1983)) wykazuje podobną podatność jak komórki Raji inkubowane z nie zainfekowanymi komórkami T.
P r z y k ł a d VIII
Wymagania odnośnie sekwencji do indukowania cytolizy przez łańcuch antygen komórki
T/Fc receptor ζ
Jakkolwiek chimery pomiędzy CD4 i ζ mogą uzbrajać cytotoksyczne limfocyty T (CTL), tak
aby zabijały one docelowe komórki, w których zachodzi ekspresja HTV gp I20, poszukiwano alternatywny dla CD4, aby bezwarunkowo porównać właściwości chimer ζ wprowadzonych do ludzkich linii komórek T. Linie takie mogą wytwarzać w wyniku ekspresji CD4, co utrudnia konkretne
ustalenie zależności pomiędzy typem i stopniem mobilizacji białkowej oraz potencjałem cytotoksycznym różnych chimer. Aby obejść ten problem wytworzono chimery pomiędzyζ, i CD 16, w
których pozakomórkowa domena CD 16 j est połączona z przezbłonowymi i wewnątrzkomórkowymi sekwencjami ζ (fig. 7A). Fuzje genowe wprowadzono do plazmidu ekspresji wirusa krowianki
przenoszącego gen gpt E. coli jako marker selekcji, po czym wykonano insercję do genomu szczepu krowianki WR na drodze homologicznej rekombinacji i selekcji względem wzrostu w kwasie
mikofenolowym (Falkner i Moss, J. Virol. 62:1849 (1988); Boyle i Coupar, Gene 65:123(1988)).
Linie komórek T zainfekowano rekombinantami krowianki i zmierzono względne cytoplazmatyczne stężenie wolnych jonów wapniowych po sieciowaniu pozakomórkowych domen
przeciwciałami. Zarówno spektrofluorometryczne (populacja w masie) jak i przepływowe cytometryczne (pojedyncza komórka) pomiary przeprowadzono dla komórek obciążonych barwnikiem Indo-1 (Grynkiewicz i inni, J. Biol. Chem. 260:3440 (1985); Rabinovitch i inni, J.
Immunol. 137:952 (1986)). Na fig. 7B pokazano wyniki lizy danych zebranych z komórek ludz-
180 066
21
kiej linii komórek białaczki T Jurkata, zainfekowanych rekombinantami krowianki, w których
zachodzi ekspresja białka fuzyjnego CD16: ζ .Sieciujące chimery powtarzalnie zwiększają
wewnątrzkomórkowy poziom wapnia, podczas gdy podobna obróbka komórek w których zachodzi ekspresja niechimerycznego CD 16, wywiera co najwyżej minimalny wpływ. Gdy chimera
jest wytwarzana w wyniku ekspresji w mutantowych liniach komórek nie zawierających receptora antygenu, obserwuje się REX33A (Breitmeyer i inni, J. Immunol. 138:726 (1987); Sancho i
inni, J. Biol. Chem. 264:20760 (1989)), lub mutant Jurkata JRT3.T3.5 (Weiss i inni, J. Immunol.
135:123 (1984)); albo silnąreakcję na sieciowanie przeciwciała CD 16. Podobne wyniki zebrano
dla mutantowej linii komórek REX20A (Breitmeyer i inni, supra, 1987; Blumberg i inni, J. Biol.
Chem. 265:14036 (1990)) oraz dla CD3/Ti-ujemnego mutanta linii komórek Jurkata założonej w
tym laboratorium. Infekcja rekombinantami, w których zachodzi ekspresja CD 16: ζ, nie odtwarza reakcji na przeciwciała anty-CD3, co wykazuje, że białko fuzyjne nie oddziaływuje poprzez
uwalnianie łańcuchów wewnątrzkomórkowego kompleksu CD3.
Aby ocenić zdolność chimer do zmiany kierunku odporności z udziałem komórek CTL
zainfekowano rekombinantami krowianki, w których zachodzi ekspresja chimer CDI 6, po czym
zastosowano do przeprowadzenia specyficznej lizy komórek hybrydomy, w których zachodzi
ekspresja związanych z błoną przeciwciał anty-CD16. Test ten stanowi rozszerzenie testu cytotoksyczności hybrydomy opracowanego pierwotnie do analizowania mechanizmów efektorowych
komórek przenoszących receptory Fc (Graziano i Fanger, J. Immunol. 138:945, 1987; Graziano i
Fanger, J. Immunol. 139:35-36,1987; Shen i inni, Mol. Immunol. 26:959,1989; Fanger i inni, Immunol. Today 10:92,1989). Na fig. 8B pokazano, że ekspresja CD16: ζ w cytotoksycznych limfocytach T umożliwia uzbrojenie CTL tak, że zabija on komórki hybrydomy 3G8 (anty-CD16;
Fleit i inni, Proc. Natl. Acad, Sei, USA 79:3275, 1982), podczas gdy CTL, w których zachodzi
ekspresja formy CD 16 połączonej z fosfatydyloinozytolem, jest nieaktywny. CTL uzbrojony w
CD 16: t, również nie zabija komórek hybrydomy, w których zachodzi ekspresja niewłaściwego
przeciwciała.
Aby zidentyfikować minimalne sekwencje ζ niezbędne do zajścia cytolizy, otrzymano szereg mutantów delecyjnych, w których kolejno coraz więcej wewnątrzkomórkowej domeny ζ
usunięto z końca karboksylowego (fig. 8A). Większość wewnątrzkomórkowej domeny ζ można
usunąć z niewielkimi konsekwencjami w odniesieniu do potencjału cytolitycznego: pełnej
długości chimera CD 16: ζ była zasadniczo równa pod względem skuteczności z chimerą, w której wykonano delecję do reszty 65, CD 16: ζ Asp66* (fig. 8B). Zasadniczy spadek cytotoksyczności zaobserwowano w przypadku delecji do reszty ζ 59 (chimera CD16: ζ Glu60ł), a dalsza
delecja do reszty 50 spowodowała nieznaczny spadek aktywności. Jednakże pełnej utraty aktywności nie zaobserwowano nawet wtedy, gdy wewnątrzkomórkową domenę zredukowano do 3
reszt zakotwiczenia przezbłonowego (fig. 8B).
Z uwagi na to, że ζjest dimerem z połączeniem disulfidowym, jedno z wyjaśnień zachowania aktywności cytolitycznej opiera się na tym, że endogenny t, tworzy heterodimery z chimeryczną delecją ζ, co powoduje odtworzenie aktywności. W celu sprawdzenia tego założenia
reszty ζ l i i 15 zmieniono z Asp i Cys odpowiednio na Gly(CysllGly/Aspl5Gly), po czym przeprowadzono immunoprecypitacje w sposób następujący. Około 2 x 106 komórek CV1 zainfekowano przez 1 godzinę w ośrodku DME pozbawionym surowicy, ze zrekombinowaną krowianką
przy krotności infekcji (moi) co najmniej 10. 6-8 godzin po infekcji komórki oddzielono od
płytek za pomocą PB S/1mM EDTA i przeprowadzono znakowanie powierzchniowe 0,2 mCi 1251
na 2 x 106 komórek stosując laktoperoksydazę i H20 2, metodą Clarka i Einfelda (Leukocyte Typing II, str. 155-167, Springer Verlag, NY, 1986). Znakowane komórki zebrano przez odwirowanie i przeprowadzono lizę w 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15M NaCl, 0,05M Tris, pH 8,0, 5mM
MgCl2, 5mM KC1, 0,2M jodoacetamid i 1mM PMSF. Jądra usunięto przez odwirowanie, po
czym wykonano immunoprecypitację białek CD 16 przeciwciałem 3G8 (Fleit i inni, supra, 1982;
Medarex) oraz agarozą z anty-mysim IgG (Cappel, Durham, NC). Próbki poddano elektroforezie
przez 8% żel poliakrylamid/SDS w warunkach nieredukujących lub przez 10% żel w warunkach
22
180 066
redukujących. Takie immunoprecypitacje potwierdziły, że chimera CD16: ζ CysllGly/Aspl5Gły nie tworzy asocjatów w strukturach dimerowych z połączeniem disulfidowym.
Zbadano również cytolityczną aktywność receptorów mutantowych. Zmutowana chimera
z delecją do reszty 65 (CD 16: ζ Cysl lGly/Asp 15Gly/Asp66*) była, zależnie od warunków testu,
2-8 razy mniej aktywna w teście cytolizy niż porównywalna niemutowana chimera (CD 16: ζ
Asp66ł), która zazwyczaj wykazywała aktywność mniej niż dwukrotnie niższą lub nierozróżnialną od aktywności CD 16: ζ (fig. 9B). Spadek aktywności mutantowej chimery jest podobny
do spadku obserwowanego dla chimer CD4 o podobnej budowie (patrz powyżej) i można go najprawdopodobniej przypisać zmniejszonej skuteczności monomerów ζ w porównaniu z dimerami. Natomiast zmutowana chimera Asp', Cys' z delecjądo reszty 59 nie wykazuje aktywności
cytolitycznej (fig. 9B), co potwierdza hipotezę, że asocjacja z innymi łańcuchami z udziałem
przezbłonowych reszt Cys i/lub Asp jest odpowiedzialna za słabą stabilność aktywności cytolitycznej w delecjach wykraczających poza resztę 65 od końca aminowego.
Badania przepływu cytometrycznego wykazały, że mutanty delecyjne nie zawierające
przezbłonowych reszt Asp i Cys mogą w dalszym ciągu powodować wzrost stężenia wewnątrzkomórkowego wolnych jonów wapniowych w reakcji na sieciowanie przeciwciałami w TCR-mutantowej linii komórek Jurkata (fig. 9D). Podobne wyniki uzyskano dla chimer powstających w
wyniku ekspresji w macierzystej linii Jurkata. W przypadku CD16: ζ Cysl lGly/Asp 15Gly/Glu60*
wyniki wskazują, że zdolność w uczestniczeniu w reaktywności wapniowej można mutacyjnie oddzielić od zdolności do podtrzymywania cytolizy.
Aby definitywnie wyeliminować ewentualny wpływ przezbłonowych reszt ζ, przezbłonowe i pierwszych 17 cytoplazmatycznych reszt ζ zastąpiono sekwencjami kodującymi przejście
przez błonę oraz odpowiednio pierwszych 14 lub pierwszych 17 cytoplazmatycznych reszt antygenów CD5 lub CD7 (fig. 9A). Uzyskane trójdzielne białka fuzyjne CD 16: 5: ζ (48-65) i CD 16:
7: ζ (48-65) nie tworzą dimerów z połączeniem disulfidowym, podobnie jak prostsze chimery
CDI 6: ζ, gdyż nie zawierająone cysteiny w przezbłonowej domenie £,. Obydwie trójdzielne chimery były zdolne do mobilizowania wapnia w liniach komórek Jurkata i TCR-ujemnej (fig. 9D)
oraz wywoływały reakcję cytolityczną w CTL (fig. 9C oraz dane nie pokazane). Natomiast skrócenie części ζ do reszty 59 w chimerze CD16: 7: ζ (48-59) znosi zdolność trójdzielnej fuzji do
kierowania reaktywnością wapniową w TCR-dodatnich lub -ujemnych komórkach Jurkata oraz
do cytolizy w dojrzałych CTL (fig. 9C i 9D oraz dane nie pokazane).
W celu zbadania udziałów poszczególnych reszt w motywie o 18 resztach wykonano szereg wariantów mutantowych na drodze mutagenezy ukierunkowanej, oraz oceniono ich zdolność
do uczestniczenia w kierowanym przez receptor zabijaniu w warunkach niskiej (fig. 10A i 1OD)
lub wysokiej (fig. 10B i 10E) ekspresji chimerycznego receptora. Na fig. 10A-F pokazano, że
jakkolwiek szereg zachowawczych podstawień (np. zastępowanie reszt kwasowych ich pokrewnymi amidami lub tyrozyny fenyloalaniną) rozdzielających reszty 59 do 63 powoduje umiarkowany
spadek skuteczności cytolitycznej, to w zasadzie warianty zachowują zdolność do mobilizowania
wapnia. Jednakże reszty te stanowią łącznie ważny podmotyw, gdyż ich delecja eliminuje aktywność cytolityczną. Zmiana Tyr 62 na Phe lub Ser eliminuje zarówno cytotoksyczność jak i reakcje
wapniowe. Przy końcu aminowym segmentu o 18 resztach zastąpienie Tyr 51 przez Phe eliminuje zarówno mobilizację wapnia jak i aktywność cytolityczną, natomiast zastąpienie Leu przez Ser
w pozycji 50 eliminuje reakcję wapniową, ale tylko nieznacznie osłabia cytolizę. Nie wiążąc się
żadną hipotezą wydaje się, że niezdolność mutanta Leu50Ser do mobilizowania wapnia w krótkotrwałym teście przepływu cytometrycznego nie w pełni odzwierciedla jego zdolność do
znaczącego zwiększania wewnątrzkomórkowego stężenia wolnych jonów wapniowych w dłużej
trwającym teście cytolizy. Jednakże o niewrażliwej na wapń aktywności cytolitycznej doniesiono w przypadku pewnych cytolitycznych linii komórek T, tak że nie można wykluczyć, że podobne zjawisko leży u podstaw uzyskanych rezultatów. Zastąpienie Asn48 przez Ser częściowo
zmniejsza cytotoksyczność w pewnych eksperymentach, a w innych wywiera nieznaczny
wpływ.
180 066
23
W celu zbadania potencjalnej roli zbędnych elementów sekwencji wewnątrzkomórkową
domenę£, podzielono na 3 segmenty, obejmujące reszty 33 do 65,71 do 104 oraz 104 do 138. Każdy z tych segmentów przyłączono do chimery CD 16: CD7 przez miejsce Mlul wprowadzone za
podstawowymi sekwencjami wewnątrzkomórkowej domeny CD7 zakotwiczenia w błonie
(patrz poniżej; fig. 11A). Porównanie działania cytolitycznego trzech elementów wykazuje, że są
one zasadniczo jednakowo skuteczne (fig. 1IB). Porównanie sekwencji (fig. 11A) wykazało, że
drugi motyw przenosi 11 reszt pomiędzy tyrozynami, podczas gdy pierwszy i trzeci motyw zawierają po 10 reszt.
Jakkolwiek nie ustalono dokładnie procesu uaktywniania komórki T, wyraźnie widać, że
agregacja receptora antygenu lub chimer receptora przenoszących wewnątrzkomórkowe sekwencje ζ uaktywnia mobilizację wapnia, uwalnianie cytokiny i granulki, oraz ujawnienie się
markerów aktywujących na powierzchni komórki. Aktywne miejsce w ζ, krótka liniowa sekwencja peptydowa, prawdopodobnie zbyt mała, aby wykazywać własną aktywność enzymatyczną, prawdopodobnie oddziaływuje z jednym lub co najwyżej kilkoma białkami uczestnicząc
w uaktywnieniu komórki. Wyraźnie również widać, że sama mobilizacja wolnego wapnia nie
wystarcza do uaktywnienia komórki, gdyż zdolność do uczestniczenia w cytolizie można mutacyjnie oddzielić od zdolności do uczestniczenia w nagromadzaniu wapnia.
Jak to wykazano, dodanie 18 reszt z wewnątrzkomórkowej domeny ζ do przezbłonowej i
wewnątrzkomórkowej domeny dwóch nie spokrewnionych białek powoduje, że uzyskane chimery ukierunkowują cytolityczną aktywność przeciw komórkom docelowym, które wiążą się z
pozakomórkową częścią białek fuzyjnych. Jakkolwiek chimery przenoszące motyw o 18 resztach są w przybliżeniu ośmiokrotnie mniej aktywne niż chimery oparte na pełnej długości ζ,
zmniejszoną aktywność można przypisać utracie oddziaływań przezbłonowych, które normalnie
umożliwiajątworzenie przez ζ dzikiego typu dimerów z połączeniem disulfidowym. Oznacza to,
że konstrukty delecyjne ζ zawierające taki sam koniec karboksylowy jak motyw, oraz nie zawierające przezbłonowych reszt Cys i Asp zazwyczaj wykazują mniejszą aktywność niż chimery
przenoszące tylko motyw o 18 resztach.
Cytolityczny element kompetencyjny, na który zwrócono uwagę, zawiera dwie tyrozyny
oraz nie zawiera seryn ani treonin, co ogranicza ewentualny udział fosforylowania w aktywności.
Mutacja którejkolwiek z tyrozyn niszczy aktywność, z tym że, mimo iż wstępne eksperymenty
nie wykazały znaczącego fosforylowania tyrozyny po usieciowaniu chimerycznych antygenów
powierzchniowych zawierających motyw o 18 resztach, nie można wykluczyć ewentualnego
udziału takiego fosforylowania na niskim poziomie. Oprócz zaobserwowanego wpływu reszt tyrozynowych szereg podstawień na końcu aminowym i karboksylowym motywu osłabia aktywność w warunkach małej gęstości receptora.
Sekwencje podobne do aktywnego motywu ζ znaleźć można w cytoplazmatycznych domenach szeregu innych białek przezbłonowych, w tym w cząsteczkach CD3 5 i y, w związanych z
powierzchniowym IgM białkach mbi i B29, oraz w łańcuchach (3 i y receptora IgE o wysokim
powinowactwie, FceRI (Reth, Naturę 338:383, 1989). Jakkolwiek działanie tych sekwencji nie
jest pewne, to przy wydajnej ekspresji każda może być zdolna do autonomicznego uaktywniania
komórki T; taką właśnie aktywnością można wyjaśnić resztkową reaktywność TCR obserwowaną w ζ -ujemnej mutantowej linii komórek (Sussman i inni, Celi 52:85, 1988).
Sam ζ przenosi 3 takie sekwencje, w przybliżeniu równomiernie rozmieszczone, a zgrubny podział na 3 części wewnątrzkomórkowej domeny wykazuje, że każda z nich jest zdolna do
inicjowania reakcji cytolitycznej. rj, stykowa izoforma ζ (Jin i inni, supra, 1990; Clayton i inni,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5202,1991), nie zawiera karboksylowej połówki trzeciego motywu. W związku z tym, że usunięcie karboksylowej połówki pierwszego motywu eliminuje aktywność, wydaje się prawdopodobne, że większość aktywności biologicznej r) można przypisać
pierwszym dwóm motywom. Choć w różnych pomiarach r] wykazuje taką samą aktywność jak £,
w inicjowaniu uwalniania cytokiny z udziałem antygenu (Bauer i inni, Proc. Natl. Acad. Sci USA
88:3842,1991) lub w ukierunkowywaniu cytolizy (patrz powyżej), r\ nie ulega fosforylowaniu w
odpowiedzi na pobudzanie receptora (Bauer i inni, supra, 1991). W związku z tym albo obecność
24
180 066
wszystkich trzech motywów jest niezbędna do zajścia fosforylowania, albo też trzeci motyw stanowi korzystny substrat dla niezidentyfikowanej kinazy tyrozynowej.
P r z y k ł a d IX
Transdukcja sygnału cytolitycznego przez ludzki receptor Fc
Aby ocenić działanie różnych podtypów ludzkiego receptora Fc stworzono chimeryczne
cząsteczki, w których pozakomórkową domenę ludzkich antygenów CD4, CD 5 lub CD 16
połączono z przezbłonową i wewnątrzkomórkową domenąFcI I yA, podtypy B 1, B2 i C (nomenklatura Ravetcha i Kineta, Ann. Rev. Immunol. 9:457, 1991). W szczególności sekwencje
cDNA odpowiadające domenom przezbłonowym i cytoplazmatycznym uprzednio opisanych
izoform FCRIIA B 1 i B2 zamplifikowano z istniejącego klonu PC23 lub z biblioteki cDNA ludzkiego migdałka (skonstruowanej znanymi sposobami) stosując następujące syntetyczne startery
oligonukleotydowe:
CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (SEQ ID NO: 18; FCRIIA do przodu);
CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEQ ID NO:
19; FCRII A odwrotnie);
GCG GGG GGA TCC CAC TGT CC A AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEQ ID NO:
20; FCRII BI i FCRII B2 do przodu); oraz
GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEQ ID NO: 21; FCRII BU i
FCRII B2 odwrotnie).
Startery te zawierały miejsca rozszczepiania odpowiednio dla enzymów BamHI i Notl, 6
reszt od końca 5'. Miejsce NotI znajdowało się bezpośrednio za kodonem terminacyjnym typu
nonsens, CTA lub TTA. Wszystkie startery zawierały 18 lub więcej reszt komplementarnych z
końcami 5' i 3' pożądanych fragmentów. Fragment cDNA odpowiadający cytoplazmatycznej domenie FcRIIyC, różniącej się od izoformy IIA jedynie jedną resztą aminokwasu (L zamiast P w
reszcie 268) wytworzono metodą ukierunkowanej mutagenezy przez nakładanie PCR, stosując
startery o sekwencjach:
TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (SEQ ID NO: 22) oraz
TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEQ ID NO: 23).
Fragmenty PCR wstawiono do wektorów ekspresji wirusa krowianki, które zawierały odpowiednio pozakomórkowe domeny CD 16 lub CD4, po czym wykonano insercję do dzikiego
typu krowianki na drodze rekombinacji w locus kinazy tymidynowej, przeprowadzając selekcję
względem współintegracji z gpt E. coli, aby ułatwić identyfikację pożądanych rekombinantów.
Identyczność wszystkich izoform (pokazanych Na fig. 12) potwierdzono przez sekwencjonowanie didezoksy.
Wytwarzanie chimerycznych białek receptorowych potwierdzono w badaniach immunoprecypitacji. Około 107 komórek JRT3.T3.5 zainfekowano przez 1 godzinę w pozbawionym
surowicy ośrodku IMDM ze zrekombinowaną krowianką przy krotności infekcji co najmniej 10.
W 12 godzin po infekcji komórki zebrano i przeprowadzono znakowanie powierzchniowe 0,5
mCi 125I na 107komórek stosując metodę z laktoperoksydaząi oksydazą glukozową (Clark i Einfeld, supra). Znakowane komórki zebrano przez odwirowanie i przeprowadzono lizę w 1%
NP-40,0,1 mMMgCl2,5mM KCl, 0,2Mjodoacetamid i ImM PMSF. Jądra usunięto przez odwirowanie, po czym wykonano immunoprecypitację białek CD 16 przeciwciałem 4G8 oraz agarozą
z anty-mysim IgG. Próbki poddano elektroforezie w warunkach redukujących. Wszystkie
cząsteczki immunostrącanego chimerycznego receptora cząsteczki wykazywały oczekiwane
masy cząsteczkowe.
W celu zbadania zdolności chimerycznych receptorów do uczestniczenia w zwiększaniu
cytoplazmatycznego stężenia wolnych jonów wapniowych zastosowano zrekombinowane wirusy do zainfekowania TCR-mutantowej linii komórek Jurkata JRT3.T3.5 (jak to opisano powyżej), cytoplazmatyczne stężenie wolnego wapnia oznaczano w komórkach (w sposób opisany
powyżej) po sieciowaniu pozakomórkowych domen receptora monoklonalnymi przeciwciałami
3GS lub Leu-3A (w sposób opisany powyżej). Eksperymenty te potwierdziły, że wewnątrzkomórkowe domeny FcRyll, A i C były zdolne do uczestniczenia w zwiększaniu cytoplazmatycz-
180 066
25
nego stężenia wolnych jonów wapniowych po sieciowaniu pozakomórkowych domen, podczas
gdy wewnątrzkomórkowe domeny FcRyll, B 1 i B2, były nieaktywne w porównywalnych warunkach (fig. 13A i 13B). Hybrydy CD4, CD5 i CD 16 FcRyll A wykazują zasadniczo równą
zdolność we wzmacnianiu reakcji wapniowej (fig. 13A-B). Inne linie komórek, zarówno z linii
monocytowych jak i limfocytowych, były zdolne do odpowiadania na sygnał zainicjowany przez
sieciowanie domen pozakomórkowych.
W celu wyjaśnienia roli różnych wewnątrzkomórkowych domen FcRy II w cytolizie ludzkie
cytotoksyczne limfocyty T (CTL) zainfekowano rekombinantami krowianki, w których zachodzi
ekspresja chimer CD 16: FcRyll A, B 1, B2 oraz C. Zainfekowane komórki współhodowano następnie z 51Cr-obciążonymi komórkami hybrydomy (np. komórkami 3GS 10-2), które wytwarzają w
wyniku ekspresji powierzchniowe przeciwciała względem CD 16. W teście tym CTL przenoszące
chimerę CD 16 zabijają docelowe komórki hybrydomy (co umożliwia uwolnienie wolnego 5'Cr),
jeśli pozakomórkowa domena CD 16 chimery była połączona z wewnątrzkomórkowym segmentem zdolnym do uaktywnienia limfocytowego programu efektorowego; ten test cytolizy opisano
szczegółowo poniżej. Na fig. 14A pokazano, że CTL uzbrojone w CD16: FcRyllA oraz ζ ale
nie w FcRyll BI lub B2, są zdolne do przeprowadzania lizy docelowych komórek, w których zachodzi ekspresja anty-CD16 przeciwciał powierzchni komórki.
Aby wyeliminować ewentualność, że specyficzna cytoliza może być w pewnym stopniu
przypisana oddziaływaniu z grupą CD 16, przeprowadzono eksperymenty cytolizy, których
wewnątrzkomórkowe domeny FcRII przyłączono do pozakomórkowych domen CD4. W takim
przypadku komórkami docelowym i były komórki HeLa, w których zachodzi ekspresja białek
gp 12/41 koperty HIV (w szczególności komórki HeLa zainfekowane wektorem krowianki
vPEl 6 (dostępnym z National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, MD). Podobnie jak dla układu CD 16, docelowe komórki, w których zachodzi ekspresja
koperty HIV, były podatne na lizę przez komórki T, w których zachodzi ekspresja chimery CD4:
FcRyll A, ale nie FcRyll BI lub B2 (fig. 14B).
Wewnątrzkomórkowe domeny FcRyll A i C nie dzielą zasadniczej homologii sekwencji z
jakimkolwiek innym białkiem, w tym z elementami rozszerzonej rodziny FcRy/TCR. W celu
ustalenia elementów sekwencji odpowiedzialnych za indukcję cytolizy wykonano delecje 5' i 3'
sekwencji kodujących wewnątrzkomórkowe domeny (opisane poniżej i pokazane na fig. 15A)
oraz oceniono ich skuteczność w testach mobilizacji wapnia cytolizy (w sposób opisany powyżej). W tych eksperymentach, w których usunięto amino-końcową część wewnątrzkomórkowej
domeny, przezbłonową domenę FcRyll zastąpiono przezbłonową domeną niespokrewnionego
antygenu CD7, tak aby wyeliminować ewentualny udział oddziaływań z udziałem domeny przenikającej przez błonę.
Na figurze 15B i 15C pokazano, że usunięcie 14 karboksy-końcowych reszt, obejmujących tyrozynę 298 powoduje całkowitą utratę zdolności cytolitycznej oraz zasadnicze
zmniejszenie potencjału mobilizacji wapnia. Dalsza delecja do miejsca tuż przed tyrozyną 282
dała identyczny fenotyp (fig. 15B i 15C). Delecja od końca N wewnątrzkomórkowej domeny do
reszty 268 nie wywierała zasadniczego wpływu ani na profil wapnia ani na zdolność cytolityczną, podczas gdy delecja do reszty 275 znacząco zaburzyła uwalnianie wapnia, ale wywarła
nieznaczny wpływ na cytolizę (fig. 15D i 5E). Dalsza delecja do reszty 282 dała ogon FcRyll,
który nie wykazuje zdolności do mobilizowania wapnia ani do uruchamiania cytolizy (fig. 15D i
15E). „Aktywny element” określony w tych zgrubnych pomiarach jest względnie duży (36 aminokwasów) i zawiera dwie tyrozyny rozdzielone przez 16 reszt.
Przykład X
Ukierunkowana cytoliza przez limfocyty przenoszące chimeryczne receptory CD4, które
nie podtrzymują infekcji
Jak to przedstawiono powyżej, można skonstruować takie cząsteczki efektorowe, które
ukierunkowują aktywność cytolityczną CTL w sposób niezależny do MHC. Tak np. chimera
złożona z pozakomórkowej domeny CD4 połączonej z łańcuchem w ludzkim klonie CTL, WH3,
specyficznie zabija komórki docelowe zawierające powierzchniową glikoproteinę kopertową
26
180 066
HIV-1, gp120. W związku z tym, że pozakomórkowa domena cząsteczki CD4 nadaje podatność
na infekcję HIV, uzbrojone CTL mogą stanowić cele dla wirusa, co osłabi ich skuteczność (Dalgleish i inni, Nature 312:767 (1984); Klatzmann i inni, Nature 312:767 (1984)). Aby zapobiec takim skutkom, zaprojektowano chimeryczne cząsteczki efektorowe oparte na CD4, skutecznym
w specyficznym doprowadzaniu do komórek zainfekowanych przez HIV w celu doprowadzenia
do ich zabicia, ale który nie nadaje podatności na infekcję HIV.
Stworzono trójdzielne białko fuzyjne przez genetyczne złożenie pozakomórkowej domeny CD4 (fig. 23) z zawiasą oraz drugą i trzecią stałą domeną ciężkiego łańcucha ludzkiego I-gGl
(Zettlmeissl i inni DNA Cell Biol, 2:347 (1990)) (fig. 25), które połączono w tym przypadku z
częścią pierwszego przezbłonowego egzonu ludzkiego IgGl związanego z błoną, po której następowała część ludzkiego antygenu CD7 obejmująca sekwencje pomiędzy samą Ig-podobną
domeną oraz sekwencję przenoszącą terminacją, a następnie domenę przezbłonową (Aruffo i
Seed, EMBO J. 6:3313 (1987)) (fig. 26). Główna sekwencja aminokwasów grupy pozakomórkowej segmentu CD7 zawiera obszar bogaty w prolinę przypominający łodygo-podobną strukturę, która przenika Ig-podobną domenę z dala od powierzchni komórki (Aruffo i Seed, EMBO J.
6:3313 (1987)) (fig. 26). Otrzymano zrekombinowane wirusy krowianki, które wytwarzają w
wyniku ekspresji te i inne chimery, w sposób podany w opisie.
W szczególności zrekombinowane wirusy krowianki wygenerowano na drodze homologicznej rekombinacji w komórkach CV-1. Przeprowadzono co najmniej dwie rundy wizualizacji
łysinek z OKT4 lub Leu3, po czym przeprowadzono oczyszczanie łysinek dla każdego asortymentu przed otrzymaniem asortymentów o wysokim mianie w komórkach CV-1.
Trójdzielna chimera (CD4 (D1-D4):Ig:CD7) (fig. 20, cząsteczka „A”) wykazywała wydajną ekspresję na powierzchni komórki i została zbadana pod względem aktywności w
działaniu jako receptor HIV w teście tworzenia zespólni opartym nakrowiance (Lifson i inni, Nature 323:725 (1986)); Ashom i inni, J. Virol. 64:2149 (1990)). Komórki HeLa zainfekowane zrekombinowanym wirusem krowianki (vPE 16) kodującym glikoproteinę kopertową HIV -1 (Earl i
inni, J. Virol. 64:2448 (1990)) współhodowano z komórkami HeLa zainfekowanymi CD4, CD4:
ζ lub CD4 (Dl-D4):Ig:CD7. 6-cm szalki z komórkami HeLa (ATCC, Rockville, MD) przy 50%
zlania zainfekowano wolnym od surowicy ośrodku przez 1 godzinę przy przybliżonej krotności
infekcji (MOI) 10. Komórki inkubowano przez dodatkowe 5-6 godzin w pełnym ośrodku, po
czym oddzielono je w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) zawierającym 1 mM
EDTA. Komórki, w których zachodzi ekspresja koperty i chimery CD4 wymieszano w stosunku
1:1 ponownie wysiano na 6-cm szalkach z pełnym ośrodkiem. Zespólnie zliczano w 6-8 godzin
po współhodowaniu, po czym fotografowano je.
Współhodowla CD4 i vPE16 doprowadziła do powstania łatwo wykrywalnych wielojądrowych komórek olbrzymich. Również chimera zawierająca pozakomórkową domenę CD4
zlaną z łańcuchem ζ z TCR (fig. 27) (CD4: Q była zdolna do uczestniczenia w tworzeniu zespólni, podczas gdy komórki, w których zachodzi ekspresja CD4 (Dl-D4):Ig:CD7, nie wykazały oznak fuzji komórek. Zbadano także konstrukt, w których zachodzi ekspresja tylko pierwszej i
drugiej domen CD4 (fig. 24), CD4(D1,D2): Ig:CD7 (fig. 20, cząsteczka „B”), Gdyż w innym
kontekście wykazano, że dwie domeny z końca aminowego CD4 są niezbędne do zainfekowania
przez HIV (Landau i inni, Nature 334:159 (1988)). Okazało się, że cząsteczka ta również nie jest
podatna na wywołane przez HTV tworzenie zespólni. Badania wiązania z rozpuszczalnym, 125I-znaczonym gp 120 wykazały, że zarówno CD4 (D1-D4):Ig:CD7 jak i CD4 (D1,D2):Ig:CD7 wykazują
nie upośledzone powinowactwo względem gp120.
Zbadano następnie, czy cząsteczki chimeryczne, które są odporne na tworzenie zespólni,
mogą być zdolne do ukierunkowywania zabijania komórek, jeśli zostaną zaopatrzone w grupę
wyzwalającą, w sposób podany w opisie. Przeprowadzono fuzję wewnątrzkomórkowej domeny ζ
(fig. 27) z końcem 3' CD4 (D1-D4):Ig:CD7 i CD4 (D1,D2):Ig:CD7 oraz otrzymano odpowiednie
zrekombinowane wirusy krowianki. Konstrukty te, CD4 (D1-D4) :Ig:CD7: ζ i CD4 (D1,D2) :Ig:CD7:
ζ (fig. 20, cząsteczki „C” i „D”), doprowadzono do ekspresji w ludzkim klonie CTL WH3 i zbadano
ich zdolność do znajdywania i zabijania komórek HeLa, w których zachodzi ekspresja powierzchnio-
180 066
27
wej glikoproteiny kopertowej HIV (stosując sposoby przedstawione w opisie). Na fig. 21 pokazano, że wewnątrzkomórkowa domena ζ złączona z CD4 (D1-D4):Ig:CD7 lub CD4
(Dl,D2):Ig:CD7 nadawać zdolność zabijania; konstrukty nie zawierające łańcucha £, nie były
zdolne do uczestniczenia w tej aktywności. CD4: a dodatni element kontrolny, nadawał nieznacznie zwiększoną cytotoksyczność, a CD4 (D1,D2):Ig:CD7: ζ, był nieco mniej skuteczny pod
względem cytotoksyczności niż CD4 (D1-D4):Ig:CD7: ζ (fig. 21). Jednakże wyraźnie widać, że
zarówno chimera CD4 (D1-D4):Ig:CD7: ζ jak i CD4 (D1,D2):Ig:CD7: ζ wykazują zdolność do
uczestniczenia w specyficznym zabijaniu komórek, w których zachodzi ekspresja białek kopertowych HIV na ich powierzchni. Czterodzielne chimery były również niezdolne do uczestniczenia w powstawaniu zespólni w teście opartym na krowiance. Wykazano także, że pojedynczy
motyw Ctypu przedstawionego Na fig. 11A wystarcza do nadania cytolitycznej aktywności chimerze CD4 (D1-D4).
Radioimmunoprecypitacje eksperymenty potwierdziły, że cząsteczki fuzyjne stanowią
przede wszystkim, a być może wyłącznie dimery. W eksperymentach tych perełki agarozy z
białkiem A zastosowano do immunowytrącenia rozpuszczonego ekstraktu metabolicznie znaczonych komórek HeLa zainfekowanych zrekombinowanąkrowianką, w których zachodzi ekspresja chimer CD4 (D 1-D4):Ig:CD7: ζ i CD4 (D1,D2):Ig:CD7: ζ Immunowytrącony materiał
rozfrakcjonowano metodą elektroforezy na żelu agarozowym w warunkach redukujących i nie
redukujących. W szczególności około 5 x 106komórek HeLa-S3 zainfekowano w sposób opisany powyżej w odniesieniu do vPE 16 odpowiednim wariantem wirusa krowianki. Komórki metabolicznie znakowano 200 gCi/ml Tran35S-Label (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) przez 6-8
godzin ośrodku zubożonym w cysteinę metioninę, po czym oddzielono w PBS zawierającym
ImM EDTA. Komórki następnie oddzielono i przeprowadzono ich lizę w 150 mM NaCl, 50 mM
Tris pH 7.5, 5mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,1% SDS, 5mM EDTA, ImM PMSF. Po usunięciu jąder
przez odwirowanie 1/5 każdego ekstraktu komórkowego zaadsorbowano na przemytych perełkach
agarozowych skoniugowanych z białkiem A przez 2 godziny w 4°C. Perełki przemyto następnie
PBS zawierającym 1% NP-40 i eluowano buforem próbki zawierającym SDS w obecności lub bez
merkaptoetanolu. Wyniki tych eksperymentów wykazują, że większość immunostrąconych chimer CD4 (D1-D4):Ig:CD7: ζ i CD4 (D1,D2):Ig:CD7: ζ migruje w postaci dimerów o oczekiwanych masach cząsteczkowych w nieredukcyjnych warunkach.
Aby bezpośrednio ocenić zdolność komórek, w których zachodzi ekspresja fuzyjnych
cząsteczek CD4, do podtrzymywania infekcji HIV, przeprowadzono długotrwałe badania infekcyjności na transfektantach, w których zachodzi ekspresja CD4 (D1-D4):Ig:CD7:ζ i CD4
(D1,D2):Ig:CD7. Trwałe transfektanty CD4 (D1-D4):Ig:CD7 i CD4 (D 1,D2):Ig:CD7 oraz CD4
otrzymano w podlinii komórek 293, ulegającej łatwo transfekcji linii komórek pochodzących z
ludzkiej embrionalnej nerki. Chimeryczne cząsteczki subkłonowano w dwukierunkowych wektorach, w których gen higromycyny B był kierowany przez promotor kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej. Zlane w 60-70% komórki na 10-cm szalkach transfekowano 10 pg tego
plazmidowego DNA przez współstrącanie fosforanu wapnia. Przed transfekcjąplazmidy zlinearyzowano w unikatowym miejscu Sfil, i końce wyrównano polimerazą T4 DNA. W 24 godziny
po transfekcji komórki podzielono na 4 części a w 48 godzin po transfekcji komórki poddano selekcji higromycynąB (Sigma, St. Louis, Mo) w ilości 400 (μg/ml. Co 3-4 dni komórki dożywiano
świeżym ośrodkiem zawierającym higromycynę.
Odporne kolonie wybrano, rozszerzono i ich ekspresję oceniono metodą niebezpośredniej
immunofluorescencji stosując skoniugowany z fluoresceinąanty-ludzki IgG Fc (Organon Teknika, West Chester, PA) lub Q4120, przeciwciało reagujące z ludzkim CD4 (Sigma), a następnie
metodą cytometrii przepływowej (Coulter, Hialeah, FL). Dwa niezależne klony każdego konstruktu z poziomami CD4 na powierzchni komórek porównywanymi z występującymi w innych
klonach wybrano do lizy Na fig. 22 pokazano, że po ekspozycji na HIV, p24 wykryto w hodowlach trwałych transfektantów CD4 już w 3 dni po infekcji. W hodowlach tych zaobserwowano
obecność wielojądrowych komórek olbrzymich oraz charakterystyczne pęcherzenie już w 5 dni
po infekcji. Natomiast znaczących poziomów p24 lub obecności wielojądrowych komórek ol-
28
180 066
brzymich nie wykryto w nietransfekowanej macierzystej linii komórek lub w dowolnym z dwóch
niezależnie uzyskanych izolatów transfektantów CD4 (D 1-D4):Ig:CD7 i CD4 (D1,D2):Ig:CD7
po 32 dniach w hodowli (fig. 22).
Po zakończeniu badań infekcyjnych komórki zbadano pod względem ekspresji CD4 na powierzchni. Gęstość powierzchniowych epitopów CD4 znacząco zmniejszyła się w zainfekowanych hodowlach, w których zachodzi ekspresja CD4, co jest zgodne z wirusową modulacją do
dołu, ale nie uległa zmianie w hodowlach, w których zachodzi ekspresja CD4 (Dl-D4):Ig:CD7 i
CD4 (D1,D2):Ig:CD7. Eksperymenty te potwierdziły, że można uzyskać chimeryczne cząsteczki przenoszące dwie wierzchołkowe domeny CD4, które po wykonaniu fuzji z łańcuchem receptora komórki T wykazują zdolność do dochodzenia do komórek zainfekowanych przez HIV i
zabijania ich, ale nie podtrzymują infekcji HIV z udziałem CD4.
Dodatkowe eksperymenty sugerują, że występuje pewna fizyczna odległość między pozakomórkową domeną cząsteczki CD4 i podwójną warstwą lipidową, która nadaje odporność na
infekcję HIV. W pierwszym eksperymencie skonstruowano chimeryczną cząsteczkę z delecją
rdzenia CD4 i domeny przezbłonowej; delecja ta usuwa bogaty w prolinę region części
przezbłonowej CD7. Gdy wykona się fuzję tej domeny z pozakomórkową domeną CD4, zachowa ona zdolność skutecznego kotwiczenia pozakomórkowej domeny CD4, o czym świadczy
zmierzona ekspresja cząsteczki D4 na powierzchni komórki (przedstawiona w opisie). Znika natomiast zdolność do przeciwstawiania się tworzeniu zespólni wywoływanemu przez glikoproteinę kopertową HIV. Tak więc delecja regionu bogatego w prolinę w cząsteczce CD7, który
prawdopodobnie tworzy strukturę zwoju α-helisowego, na tyle zmniejsza odległość między pozakomórkową domeną CD4 i podwójną warstwą lipidową, że zanika zdolność chimery do przeciwstawianiu się tworzeniu zespólni wywołanemu przez HIV.
W drugim eksperymencie wykazano, że zdolność przeciwstawiania się wywołanemu
przez HIV tworzeniu zespólni może być nadana chimerze CD4/CD5, która, jak to wcześniej wykazano, służy jako przezbłonowe zakotwiczenie pozakomórkowej domeny CD4, ale która nie
jest zdolna do przeciwstawiania się wywołanemu przez HTV tworzeniu zespólni. W eksperymencie tym domeny zawiasy, CH3 i CH3 ciężkiego łańcucha ludzkiego IgGl wstawiono do cząsteczki CD4/CD5; uzyskana chimera jest odporna na tworzenie zespólni, co ponownie sugeruje, że
odległość zapewniana przez domeny immunoglobulinowe wystarcza do nadania odporności na
wywoływane przez HIV tworzenie zespólni.
W trzecim eksperymencie domenę CD4 wydłużono zmieniając odległości od błony komórkowej za pomocą syntetycznych α-helis o różnej długości. W szczególności zaprojektowano
syntetyczne oligonukleotydy reprezentujące powtarzające się α-helisowe motywy reszt glicyny i
kwasu glutaminowego flankowane dwoma resztami alanylowymi (patrz fig. 28, gdzie przedstawiono główne sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów). We wcześniejszych badaniach stwierdzono, że taki układ aminokwasów występuje z dużą częstotliwością w α-helisach,
co sugeruje, że powtarzalne motywy powinny przyjmować konformację α-helisową, oraz że
umieszczenie takich α-helis między domenąprzezbłonowąi domenami pozakomórkowymi CD4 powinno odsunąć CD4 od błony komórkowej. Zmieniając długość segmentu α-helisowego wykonano
obliczenia wystającej odległości niezbędnej do przeciwstawienia się wejściu HIV, w oparciu o znane
wielkości dla podnoszenia się i powrotu α-helisy. Wyniki podano w tabeli.
180 066
29
Ta b e l a
Tworzenie zespólni
Ekspresja Thy-1
A. CD4+H+CH2+CH3+CD7tm+stk
-
-
B. CD(D1,D2)+H+CH2+CH3+CD7tm+stk
-
-
+/-(a)
+
D. CD4+CD7tm (długa wersja)
+
+
E. CD4+CD7tm (krótka wersja)
+
+
F. CD4+CD5m
+
+
G. CD4+CH2+CH3+CD5tm
-
-
H. CD4+CH3+CD5tm
-
NO
1. CD4+CD34tm
+
+
J. CD4 + syntetyczna helisa białkowa (24A) + CD34tm
NO
+
K. CD4 + syntetyczna helisa białkowa (48 A) + CD34tm
NO
+/-(b)
L. CD4 + syntetyczna helisa białkowa (24 A) + CD34tm
NO
-
C. CD4+CD7tm+stk
a Zasadnicze zmniejszenie w liczbie zespólni lub komórek, w których zachodzi ekspresja thy-1.
NO - nie oznaczano
W tabeli tej „CD4” oznacza CD4 (D1-D4), o ile nie zaznaczono tego inaczej; „H”, „CH2” i
„CH3” oznaczają odpowiednio zawiasę i regiony CH2 i CH3 ludzkiego ciężkiego łańcucha I-gG l;
„CD7tm i stk” oznaczają region przezbłonowy łodygowy CD7; „CD7tm (długa wersja)” i „CD7tm
(krótka wersja)” oznaczają odpowiednio region przezbłonowy CD7 i region przezbłonowy CD7 z
delecją domeny bogatej w prolinę ( jak to przedstawiono powyżej); „CD5tm” oznacza region
przezbłonowy CD5; a „CD34tm” oznacza region przezbłonowy CD34. W wierszach J-L długość
regionu helisowego podano w angstremach; wielkości te są oparte na tym, że na jeden obrót α-helisy przypada 3,6 reszt, co odpowiada 5,4 A (czyli 1,5 A/resztę). W związku z tym 16 reszt α-helisy
będzie odsuwać pozakomórkową domenę CD4 na około 24 A. α-helisy o 48 72 A skonstruowano
przez kolejne kaskadowe fragmentu BstY1 do fragmentów unikatowego miejsca BamH1 (patrz
fig. 28), a następnie selekcję klonów o odpowiedniej orientacji.
Powstawanie zespójni zliczano w testach współhodowania z komórkami HeLa,, w których
zachodzi ekspresja glikoproteiny kopertowej HIV-1 konstruktu vPE-16 wirusa krowianki, (patrz
wyżej).
Ekspresję Thy-1 mierzono w sposób następujący. Skonstruowano żyjący wektor retrowirusa
w oparciu o klon hxb.2 HIV-1. W wektorze tym niepodstawowy gen nef zastąpiono sekwencjąkodującą thy-1 szczura, wydajnie powstającą w wyniku ekspresji cząsteczkę na powierzchni komórki, która zakotwicza się na błonie poprzez połączenie fosfatydylo-inozytolowe. Wirus pochodzący
z tego klonu cząsteczkowego, oznaczony jako hxb/thy-l, jest infekcyjny, o czym świadcząjego
działania cytopatologiczne oraz wytwarzanie p24 w supematantach hodowli zainfekowanych
komórek C8166 (ludzka linia komórek białaczkowych T CD4+). Na dodatek przy ekspozycji na
hxb/thy-1 komórki HeLa przejściowo transfekowane CD4 wykazują oznaki ekspresji thy-1już w
18 godzin po infekcji, czego można było oczekiwać w przypadku informacji regulowanej w nef-podobny sposób. Informacje kodowane przez gen nef zazwyczaj należą do klasy wirusowych
białek regulujących, które ulegająwielokrotnemu rozszczepieniu i nie zawierają elementu odpowiedzi odwrotnej. Informacje te mogą trwale nagromadzać się w cytoplazmie jako wczesne wirusowe produkty genowe. Oczekiwano, że informacje thy-1 będą regulowane podobnie, to
znaczy wystąpią wcześnie w cyklu życia wirusa. W skrócie układ taki ułatwia ocenę wej ścia HIV,
przy czym ekspresję thy-1 wykorzystuje się jako namiastkę wejścia wirusa. Różne chimery oparte na CD4 przejściowo transfekowano w komórkach HeLa stosując standardowe sposoby z
DEAE-dekstranem. Transfekowane komórki eksponowano na wirus hxb/thy-l w 48 godzin po
30
180 066
transfekcji, a zliczanie ekspresji thy-1 wykonywano w 24-48 godzin po infekcji. W przypadku
wyników podanych w tabeli 1 ekspresję thy-1 oznaczano w 24 godziny po infekcji stosując dostępne w handlu monoklonalne przeciwciało Thy-1 (Accurate).
Z danych przedstawionych w tabeli 1 wywnioskowano, że pozakomórkowe domeny CD4
optymalnie powinny wystawać z błony komórki na co najmniej 48 Ä, a korzystnie na co najmniej
72 A, aby zapewnić odporność na infekcję HIV.
Wykorzystując strategię zbliżoną do ogólnej strategii przedstawionej w opisie skonstruować można chimery oparte na anty-HIV przeciwciałach kopertowych, które kierują się do komórek zainfekowanych przez HIV. Przykłady takich przeciwciał podali Gomy i inni, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86:1624 (1989) oraz Marasco i inni, J. Clin. Invest. 90:1467 (1992).
P r z y k ł a d XI
Dodatkowe białka wyzwalające receptor komórki T i receptor komórki B
Inne wewnątrzkomórkowe i przezbłonowe domeny przenoszące sygnał według wynalazku mogą pochodzić z białek receptora komórki T, CD3 8 i T3 y, oraz z białek receptora komórki B,
mbl i B29. Sekwencje aminokwasów w tych białkach pokazano na fig. 16 (CD3 8; SEQ ID NO:
24), fig. 17 (T3 y; SEQIDNO: 25), fig. 18 (mdl; SEQ ID NO: 26) oraz fig. 19 (B29; SEQ ID NO:
27). Części sekwencji wystarczające do przenoszenia sygnału cytolitycznego (i w związku z tym
korzystnie wchodzące do chimerycznego receptora według wynalazku) zaznaczono w nawiasach. Chimeryczne receptory, które zawierają takie domeny białkowe, konstruuje się i stosuje w
sposobach leczenia według wynalazku, opisanych powyżej.
P r z y k ł a d XII. Metody eksperymentalne
Infekcja krowianką i radioimmunoprecypitacja
Około 5 x 106 komórek CV1 zainfekowano na 1 godzinę pozbawionym surowicy ośrodku
DME ze zrekombinowaną krowianką przy krotności infekcji (moi) co najmniej 10 (miano oznaczane na komórkach CV1). Komórki po infekcji umieszczono w świeżym ośrodku i przeprowadzono metaboliczne znakowanie stosując 200μCi/ml 35S-metioniny + cysteiny (Tran35S-label,
ICN; Costo Mesa, CA) w DMEM wolnym od metioniny i cysteiny (Gibco; Grand Island, NY) na
6 godzin. Znakowane komórki oddzielono w PBS zawierającym ImM EDTA, zebrano przez odwirowanie, poddano lizie w 1% NP-40,0,1 % SDS, 0,15 M NaCl, 0,05M Tris pH 8,0,5mM EDTA
i ImM PMSF. Jądra usunięto przez odwirowanie, a białka CD4 immunostrącono przeciwciałami
OKT4 agarozą z anty-mysim IgG (Cappel, Durham, NC). Próbki poddawano elektroforezie
przez 8% żele poliakrylamid /SDS w warunkach nieredukujących (KR) i redukujących (R). Żele
zawierające 35S-znaczone próbki impregnowano En3Hance (New England Nuclear, Boston,
MA) przed autoradiografią. Ułatwioną ekspresję przezbłonowej form CD 16, CD16TM, oznaczano porównując jego ekspresję w komórkach CV1 zainfekowanych tylko CD16TMz ekspresją w
komórkach współzainfekowanych wirusami kodującymi CD16TMi chimeryζ, lub y . Po infekcji i
inkubacji trwającej 6 godzin lub dłużej komórki oddzielano z płytek w PBS, 1 mM EDTA i ekspresję CD 16t m lub chimer oznaczano metodą niebezpośredniej immunofluorescencji cytometrii
przepływowej.
Test przepływu wapnia
Komórki Jurkata podlinii E6 (Weiss i inni, J. Immunol.: 123-128 (1984)), zainfekowano
zrekombinowanymi wirusami krowianki przez 1 godzinę pozbawionym surowicy IMDM przy
moi 10 i inkubowano przez 3-9 godzin w IMDM, 10% FBS. Komórki zebrano przez odwirowanie i ponownie zawieszono w stężeniu 3 X 106 komórek/ml w pełnym ośrodku zawierającym
ImM acetometoksyestru Indo-1 (Grynkiewicz i inni, J. Biol. Chem. 260:3340-3450 (1985))
(Molecular Probes) inkubowano w 37°C przez 45 minut. Komórki obciążone Indo-1 odwirowano i ponownie zawieszono w stężeniu 1 x 106/ml pozbawionym surowicy IMDM, po czym przechowywano w temperaturze pokojowej w ciemności. Komórki analizowano na obecność
wolnych jonów wapniowych mierząc równocześnie emisję fluorescencji fioletowej i błękitnej
metodą cytometrii przepływowej (Rabinovitch i inni, J. Immunol. 137:952-961 (1986)). W celu
zainicjowania przepływu wapnia do zawiesiny komórek dodawano Leu-3A skoniugowane z fikoerytryną (PE) (anty-CD4) (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) w stężeniu 1 (ig/ml, po czym
180 066
31
dodawano 10 (μg/ml nieskoniugowanego koziego, anty-mysiego IgG w czasie 0 lub nieskoniugowane 3G8 (anty-CD16) monoklonalne przeciwciała w stężeniu 1 Mg/ml, a następnie 10 pg/ml
PE-skoniugowanego koziego Fab2' antymysiego IgG w czasie 0. Histogramy stosunku emisji
fioletowej/niebieskiej zbierano dla PE-dodatnich (zainfekowanych) populacji komórek, które
zazwyczaj stanowiły 40-80% wszystkich komórek. Reakcję receptora antygenu komórki T w nie
zainfekowanych komórkach wyzwalano przeciwciałem OKT3, bez sieciowania.
W eksperymentach obejmujących chimeryczne receptory CD 16 próbki, w których następowało przemieszczanie linii podstawowej w kierunku niższego wewnątrzkomórkowego stężenia
wapnia (bez przeciwciał) wykluczano z lizy Histogramy analizowano następnie przekształcając
dane binarne na ASCII z zastosowaniem oprogramowania Write Hand Man (Cooper City, FL), po
czym wykonano analizę za pomocą zbioru programów FORTRAN. Stosunek fiolet/błękit przed
dodaniem drugiego przeciwciała jako reagentu wykorzystywano do ustalania znormalizowanego stosunku wyjściowego, któremu przypisywano wartość 1, oraz ustalania progu spoczynkowego, który nastawiano tak, aby 10% populacji spoczynkowej przekraczała wielkość progową.
Test cytolizy
Linię WH3 ludzkich komórek T, ograniczoną linię cytolitycznąCD8+CD4 HLA B44, utrzymywano w IMDM, 10% ludzkiej surowicy, ze 100 U/ml IL-2 i okresowo pobudzano niespecyficznie napromieniowanymi (3000 rad) HLA-niresparowanymi limfocytami krwi obwodowej oraz 1
(μg/ml fitohemaglutyniny, albo specyficznie, napromieniowanymi jednojądrowymi komórkami
przenoszącymi B44. Po 1 dniu niespecyficznego pobudzania PHA rozcieńczono do 0,5 fig/ml dodając świeży ośrodek, a po 3 dniach ośrodek zmieniano. Komórki hodowano przez co najmniej 10
dni po pobudzaniu przed użyciem w teście cytotoksyczności. Komórki infekowano zrekombinowaną krowianką przy krotności infekcji co najmniej 10 przez 1 godzinę w wolnym od surowicy
ośrodku, po czym inkubowano w pełnym ośrodku przez 3 godziny. Komórki zbierano przez odwirowanie i ponownie zawieszono w stężeniu 1 x 107komórek/ml. 100 pi hodowli dodawano do
każdej studzienki płytki mikrotiter z dnem w kształcie litery U zawierającej 100 μl/studzienkę
pełnego ośrodka. Komórki rozcieńczono kolejno dwukrotnie. Dwie studzienki dla każdej próbki
nie zawierały limfocytów, aby umożliwić pomiar spontanicznego uwalniania chromu i całkowite
wchłanianie chromu. Komórki docelowe, HeLa podlinia S3 infekowano jak wyżej na 6,0 lub
10,0-cm płytkach przy moi około 10 przez 1 godzinę w wolnym od surowicy ośrodku, po czym
inkubowano w pełnym ośrodku przez 3 godziny. Komórki oddzielano z szalek w PBS, ImM
EDTA i zliczano. Porcję 106docelowych komórek (komórki HeLa, Raji lub RJ2.2.5 w przypadku
eksperymentów z chimerycznym receptorem CD4 oraz komórek 3G8 10-2; Shen i inni, Mol. Immunol. 26:959 (1989) w przypadku eksperymentów z chimerycznym receptorem CD 16) odwirowano i. ponownie zawieszono w 50μ l sterylnego 51Cr-chromianu sodu (1 mCi/ml, Dupont
Wilmington, DE) na 1 godzinę w 37°C z okresowym mieszaniem, po czym przemywano 3 razy
PBS. 100μ l znakowanych komórek ponownie zawieszonych w ośrodku w ilości 105komórek/ml
dodawano do każdej studzienki. Docelowe komórki Raji i RJ2.2.5 znakowano w taki sam sposób
jak komórki HeLa. Płytki mikrotiter odwirowano przy 750 x g przez 1 minutę i inkubowano przez
4 godziny w 37°C. Pod koniec okresu inkubacji komórki z każdej studzienki ponownie zawieszono przez łagodne pipetowanie, pobrano próbkę do oznaczenia całkowitego wprowadzonego zliczenia i płytkę mikrotiter odwirowano przy 750 x g przez 1 minutę. Próbki 100μ l supematantu
pobrano i zliczono w liczniku scyntylacyjnym promieniowania y. Procent zabicia korygowano
uwzględniając udział zainfekowanych komórek docelowych (zazwyczaj 50-90%) oznaczony
metodą cytometrii przepływowej. W przypadku zainfekowanych komórek efektorowych stosunek efektor:cel korygowano uwzględniając udział zainfekowanych komórek (zwykle 20-50% w
eksperymentach z chimerycznym receptorem CD4 i >70% w eksperymentach z chimerycznym
receptorem CD 16).
In vitro mutageneza sekwencji ζ
W celu wykonania mutacji punktowych w resztach aminokwasów 11 i/lub 15 sekwencje ζ,
syntetyczne oligonukleotydowe startery rozciągające się do miejsca BamHI w górę od przezbłonowej domeny ζ, oraz przekształcenia w ζ natywnej reszty 11 z Cys w Gly (C11G) lub reszty 15 z
32
ISO 066
Asp w Gly (D15G) albo wykonania obydwu zmian (C11G/D15G), otrzymano i zastosowano w
reakcjach PCR w celu uzyskania zmutowanych fragmentów, które ponownie wstawiano do konstruktów CD4: dzikiego typu.
W celu stworzenia delecji ζ, sekwencje cDNA ζ amplifikowano metodą PCR stosując syntetyczne oligonukleotydowe startery zaprojektowane tak, aby utworzyć kodon terminacji (UAG)
po reszcie 50,59 lub 65. Startery miejsce rozszczepienia dla enzymu Notl wstawione 5 lub 6 reszt
od końca 5', zwykle w sekwencji w postaci CGC GGG CGG CCG CTA (SEQ ID NO: 11), w której ostatnie 3 reszty odpowiadają antykodonowi terminacji. Po sekwencjach Notl i antykodonu
terminacji następowało 18 lub więcej reszt komplementarnych z pożądanym końcem 3' fragmentu. Uzyskaną chimerę oznaczano odpowiednio jako CD16:ζ Y51*, CD16:ζE60* i CD16: ζD66*.
Miejsce BamHI w górę domeny przezbłonowej oraz miejsce Notl stosowano do wytwarzania
fragmentów, które wstawiano do dzikiego typu konstruktu CD 16: ζ Monomeryczne chimery ζ
uzyskiwano uwalniając przezbłonowe błonowe sekwencje ζ w sąsiedztwie sekwencji wewnątrzkomórkowej przez trawienie BamHI i SacI konstruktu Asp' i Cys' CD4: ζ opisanego powyżej i wstawiając fragment odpowiednio do konstruktu CD16:ζ E60* i CD16:ζ D66*.
Konstrukcja trójdzielnej chimery CD 16: 7:1,(48-65) i CD16: 7 (1,(48-59)
W celu wytworzenia konstruktu C
:ζ D66* sekwencję cDNAζ odpowiadającą przezbłonowej domenie oraz 17 kolejnym resztom cytoplazmatycznej domeny zastępowano odpowiednią
przezbłonowącytoplazmatyczną domeną uzyskaną CD5 i CD7 cDNA. Fragmenty CD5 i CD7 wytwarzano w reakcji PCR stosując oligonukleotydy przodujące zawierające miejsce rozszczepiania
restrykcyjnego BamH1 oraz odpowiednie dla regionu tuż w górę od domeny przezbłonowej odpowiednio CD5 i CD7 oraz następujące oligonukleotydy zwrotne zachodzące odpowiednio na sekwencje CD5 i CD7, a także sekwencję ζ zawierającąmiejsce rozszczepiania restrykcyjnego SacI.
CD5: ζ: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTGGCG CTG CTT CTT CTG (SEQ
ID NO: 12)
CD7: ζ: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC
CCG (SEQ ID NO: 13).
Produkty PCR, CD5 i CD7, trawiono BamHI i SacI, po czym Iigowano ze strawionym za
pomocą BamHI i SacI CD 16: ζE60* zastępując sekwencję ζ od BamHI do SacI fragmentem
CD7. W celu wykonania konstruktów CD16: CD5 i CD16: CD7, fragmenty CD5 i CD7 otrzymano z PCR stosując oligonukleotyd zawierający miejsce rozszczepiania restrykcyjnego Notl i
kodujący kodon terminacji (UAA) po reszcie Gln416 i Ala 193 odpowiednio w CD 5 i CD7. Fragmenty CD5 i CD7 z PCR trawiono BamHI i Notl, a następnie wstawiano do konstruktu CD 16:
ζ Asp66*.
In vitro mutageneza N-końcowych reszt w cytolitycznym motywie ζ przenoszącym sygnał
Syntetyczne oligonukleotydowe startery rozciągające się od miejsca SacI wewnątrz motywu ζ i zmieniające natywną resztę 48 z Asn na Ser (N48S), resztę 50 z Leu na Ser (L50S) oraz resztę 51 z Tyr na Phe (Y51F) zsyntetyzowano i zastosowano w reakcji PCR w celu wygenerowania
fragmentów, które wstawiono do dzikiego typu konstruktu CD16: 7: ζ (48-65).
In vitro mutageneza C-końcowych reszt w cytolitycznym motywie ζ przenoszącym sygnał
Syntetyczne oligonukleotydowe startery rozciągające się od miejsca Notl 3' do kodonu terminacji oraz zmieniające natywną resztę 60 z GIu na Gln (E60Q), resztę 61 z Glu na Gln (E61Q),
resztę 62 z Tyr na Phe lub Ser (Y62F na Y62S) oraz resztę 63 z Asp na Asn (D63N) zsyntetyzowano i zastosowano w reakcji PCR w celu wygenerowania fragmentów, które w konstruktach dzikiego typu CD 16: ζ D66* od miejsca BamHI do miejsca Notl.
Konstrukcje chimer CD 16: 7: ζ (33-65), CD16: 7: ζ (71-104) i CD I6: 7: ζ (104-137)
Przezbłonowy fragment CD7 przenoszący miejsca Mlul i Notl w połączeniu pomiędzy domenami, przezbłonową wewnątrzkomórkową, otrzymano w PCR stosując oligonukleotyd o następującej sekwencji: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID
NO: 14). Uzyskany fragment PCR strawiono BamHI i Notl, po czym wstawiono do konstruktu
CD16: 7: ζ(48-65).Fragmenty ζ kodujące reszty 33do65,71 do 104oraz 104do 137uzyskanow
reakcji PCR stosując pary starterów zawierających miejsca Mlul na końcu 5' starterów przo-
180 066
33
dujących i kodony terminacji po miejscach Notl przy końcu 5' starterów zwrotnych. W każdym
przypadku miejsca restrykcyjne wstawiano 6 reszt od końca 5' startera, aby zapewnić rozszczepienie enzymem restrykcyjnym.
ζ 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID NO: 15);
ζ 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (SEQ ID NO: 16);
oraz
C 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ ID NO: 17).
Konstrukcja mutantów delecyjnych FcRyllA
Mutanty delecyjne FcRyllA na końcu karboksylowym konstruowano w PCR w taki sam
sposób jak w przypadku konstruktów o pełnej długości, zmieniając sekwencje kodujące tyrozynę
w pozycjach 282 i 298 na kodony terminacji (TAA). N-końcowe delecje generowano przez amplifikację fragmentów kodujących kolejno coraz mniejszą wewnątrzkomórkową domenę metodą
PCR, stosując oligonukleotydy, które umożliwiają wstawienie uzyskanych fragmentów pomiędzy miejsca restrykcyjne Mlul i Notl w uprzednio skonstruowanym plazmidzie ekspresji kodującym pozakomórkową domenę CD16 złączoną z przezbłonową domeną CD7, przy czym ta
ostatnia kończy się miejscem Mlul i połączeniu między przezbłonową i wewnątrzkomórkową
domeną.
Inne rozwiązania
Opisane wyżej przykłady wykazują, że agregacja chimer ζ,η lub y wystarcza do zainicjowania cytolitycznej reakcji komórki efektorowej w komórkach T. Znany zakres ekspresji ζηi y,
obejmujący limfocyty T, naturalne komórki zabijacze, granulocyty zasadochłonne, makrofagi i
komórki tuczne, sugeruje, że motywy zachowanych sekwencji mogą oddziaływać z aparatem
czuciowym wspólnym dla komórek pochodzenia hematopoetycznego, oraz że istotny składnik
ochrony gospodarza w układzie odpornościowym może oddziaływać poprzez zjawiska agregacji
receptorów.
Siła reakcji cytolitycznej oraz brak odpowiedzi na komórki docelowe przenoszące receptory MHC klasy II wykazują, że chimery oparte n aζ ,ηi y tworzą podstawę do interwencji genetycznych w AIDS na drodze immunoterapii adoptywnej. Szeroki rozkład endogennych ζ i y oraz
potwierdzenie, że receptory Fc związane z y uczestniczą z cytotoksyczności w różnych typach
komórek (Fanger i inni, lmmunol. Today 10:92-99 (1989)), umożliwia rozważenie wykorzystania w tym celu różnych komórek. Tak np. obojętnochłonne granulocyty o bardzo krótkim okresie
życia (~4 godzin) w krążeniu, które są silnie cytolityczne, stanowią atrakcyjne komórki docelowe dla ekspresji chimer. Jest mało prawdopodobne, aby infekcja obojętnochłonnych granulocytów przez HTV spowodowała uwolnienie wirusa, a obfitość tych komórek (przeważają wśród
leukocytów) powinna ułatwić obronę organizmu. Inną atrakcyjną możliwość do wykorzystania
jako komórki gospodarze stanowią dojrzałe komórki T, populacja, w przypadku której możliwe
są obecnie manipulacje retrowirusowe (Rosenberg S.A. Sci. Am. 262:62-69 (1990)). Przy pomocy zrekombinowanych komórek IL-2 populacje komórek T można stosunkowo łatwo rozszerzyć
w hodowli, a rozszerzone populacje wykazują zazwyczaj ograniczoną żywotność po ponownej
infuzji (Rosenberg i inni, N. Engl. J. Med. 323:570-578 (1990)).
W odpowiednich warunkach rozpoznawanie HIV przez komórki, w których zachodzi ekspresja chimery CD4, powinno dostarczyć mitogenicznych bodźców, co stwarza możliwość, że
uzbrojona populacja komórek będzie odpowiadać dynamicznie na inwazję wirusową. Jakkolwiek w opisie skupiono się na zachowaniu białek fuzyjnych w cytolitycznych limfocytach T, to
ekspresja chimer w limfocytach pomocnikach może dostarczyć HIV - mobilizowanego źródła
cytokin, które mogą przeciwdziałać zanikowi pozdbioru komórek pomocników w AIDS. Ostatnie opisy szeregu schematów konstrukcji odporności na infekcję na etapach innych niż penetracja wirusów (Friedman i inni, Nature 335:452-454 (1988); Green i inni, Celi 58:215-223 (1989);
Malim i inni, Celi 58:205-214 (1989); Tronoi inni, Celi 59:113-120 (1989); Buonocore i inni, Nature 345:625-628 (1990)) sugerują, że komórki przenoszące chimery CD4 można zaprojektować
tak, aby udaremniały produkcję wirusów poprzez ekspresję odpowiednich środków działających
wewnątrz komórki.
34
180 066
Zdolność do przekazywania sygnałów do limfocytów T przez autonomiczne chimery
stwarza również możliwość regulowania retrowirusowo skonstruowanych limfocytów in vivo;
Sieciujące bodźce, np. z udziałem specyficznych przeciwciał IgM skonstruowanych tak, aby
usunąć domeny wiążące dopełniacz, mogą zapewnić zwiększenie liczby limfocytów in situ, podczas gdy zastosowanie podobnych specyficznych przeciwciał IgG (np. rozpoznających warianty
aminokwasów wprowadzone do chimerycznego) może selektywnie zubożyć skonstruowaną populację. Dodatkowo przeciwciała anty-CD4 IgM nie wymagają dodatkowego sieciowania, aby
mobilizowały wapń w komórkach Jurkata, w których zachodzi ekspresja chimery CD4: Zdolność do regulowania populacji komórek bez powrotu do powtarzanej pozaustrojowej amplifikacji może zasadniczo rozszerzyć zakres i skuteczność obecnych zastosowań zaproponowanych
dla genetycznie zmodyfikowanych komórek T.
Jakkolwiek wynalazek opisano w odniesieniu do konkretnych rozwiązań, zrozumiałe jest,
że możliwe są dalsze modyfikacje, tak że zgłoszenie niniejsze obejmuje warianty, zastosowania
lub adaptacje wynalazku, a także obejmuje takie odstępstwa od niniejszego ujawnienia, w dziedzinie, do której wynalazek należy, i które jako takie wynikająz zakresu załączonych zastrzeżeń.
180066
Zestawienie sekwencji
(1)
Informacje ogólne:
(i) Zgłaszający:
Brian Seed i inni
(ii) Tytuł wynalazku: Ukierunkowana cytoliza komórek
zainfekowanych przez HIV, przez komórki
noszące chimeryczny receptor CD4
(iii)
Liczba sekwencji: 27
(iv) Adres do korespondencji:
(A) Adresat: Fish & Richardson
(B) Ulica: 225 Franklin Street
(C) Miasto: Boston
(D) Stan: MA
(E) Państwo: USA
(F) Kod: 02110-2804
(v)
Postać odczytywana komputerowo:
(A) Nośnik: Dyskietka 3,5 cala, 1,44 MB
(B) Komputer: IBM PS/2 Model 50Z lub 55SX
(C) System operacyjny: IBP P.C. DOS (Version 3.30)
(D) Oprogramowanie: Wordperfect (Version 5.0)
(vi) Dane
(A)
(B)
(C)
dotyczące zgłoszenia:
Numer zgłoszenia:
Data zgłoszenia:
Klasyfikacja:
(vii)
(A)
(B)
(C)
Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia:
Numer zgłoszenia: 07/847 566
Data zgłoszenia: 6 marca 1992
Klasyfikacja:
(A)
(B)
(C)
Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia:
Numer zgłoszenia: 07/665 961
Data zgłoszenia: 7 marca 1991
Klasyfikacja:
(vii)
(viii)
(A)
(B)
(C)
(ix)
Informacja dotycząca pełnomocnika/rzecznika:
Nazwisko: Clark, Paul T.
Numer rejestracyjny: 30,162
Numer rzecznika: 00786/212001
Informacja telekomunikacyjna:
(A) Telefon: (617) 542-5070
(B) Faks: (617) 542-8906
(C) Teleks: 200154
180066
Informacja dotycząca SEQ ID N O : 1 :
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 1728 par zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Niciowość: podwójna
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki:
cDNA (genomowy)
(xi) Opis sekwencji:: SEQ ID N O : 1:
ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTCGTCC TCCAACTGCC
50
CCTCCTCCCA GCACCCACTC AGCGAAACAA AGTGCTGCTG GGCAAAAAAC
100
TTCCACTCCA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGCAA ATCAGCGCTC
200
GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAC
300
GGGATACAG? GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA
CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTCAA TGATCCCGCT CACTCAAGAA
ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTCCAGGACC AGAAGGAGGA
I5O
250
350
GCTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTCC CAACTCTGAC ACCCACCTGC
400
CCCTCAGTGC AATGTACGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGCAA
500
TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTCACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC
450
CACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGACCTCCA CGATAGTCGC ACCTGGACAT
550
CTCCTAGCTT TCCACAAGCC CTCCAGCATA CTCTATAAGA AAGAGGGCGA
650
GCAGTCGCCA CCIGTCGTGC CAGGCGGAGA GCCCTTCCTC CTCCAACTCT
750
CCAGGACCCT AASCTCCACA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC
850
CCACTGTCTT GCACAACCAG AACAAGCTGG AGTTCAAAAT AGACATCCTC
ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CBCTCGCCTT TACACTTGAA BACCTCACCC
TGGATCACCT TTGACCTCAA GAACAAGGAA CTGTCTGTAA AACGGCTTAC
TCCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTCGAAACCT CACCCTGGCC
CTTCAAGCGA AAACAGCAAA GTTCCATCAG GAAGTGAACC TCGTGGTGAT
600
700
800
900
950
GAGAGCCACT CAGCTCCACA AAAATTTCAC CTCTCAGCTG TGGCCACCCA
1000
GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTC AGCCCGCCAT
1100
CCTCCCCTAA GCTGATGCTC ACCTTGAAAC TGGAGAACAA GCAGGCAAAC
GTGGCAGTGT CTGCTGACTC ACTCCGCACA CGTCCTGCTG CAATCCAACA
1050
1150
TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC
1200
CCTOTACCTG AGAGCAAAAT TCAGCAGGAG TGCAGAGACT GCTCCCAACC
1300
TGCTACTTGC TAGATGGAAT CCTCTTCATC TACGGAGTCA TCATCACAGC
TGCAGGACCC CAACCAGCTC TACAATGAGC TCAATCTAGG GCGAAGACAG
GAATATGACG TCTTGGAGAA GAAGCGGGCT CGCGATCCAG AGATGGGAGG
CAAACAGCAG AGGAGGAGGA ACCCCCAGGA AGGCGTATAC AATGCACTGC
AGAAACACAA GATGCCAGAA GCCTACAGTG AGATCGGCAC AAAAGGCGAC
AGGCGGAGAG GCAAGGGGCA CGATGGCCTT TACCAGGACA GCCACTTCCA
AGCAGTCCAG TTCGGGAACA GAAGAGAGAG AGAACGTTCA GAACTCACAA
GGACCCTTGG GTTAAGAGCC CGCCCCAAAG GTGAAAGCAC CCAGCAGAGT
AGCCAATCCT GTGCCAGCGT CTTCAGCATC CCCACTCTGT GGAGTCCATG
GCCACCCAGT ACCAGCTCCC ACCTCTAA
1250
1350
1400
1450
1500
1550
1600
1650
1700
1728
180066
Informacja dotycząca SEQ ID NO:2:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 1389 par zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Niciowość: podwójna
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki:
cDNA (genomowy)
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:2:
ATGAACOGGG GACTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTCC TGCAACTGCC
50
GCTCCTCCCA GCAGCCACIC AGCGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAC
100
GGCATACAC? CGAACTGACC TCTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA
150
TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC
200
CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAACCTGAA TCATCCCGCT GACTCAACAA
250
CAACCCTTTG GGACGAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG
300
ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTCTCAA GTCGAGGACC AGAAGGAGCA
350
GGTGCAATTC CTAGTCTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC
400
TTCAGCGGCA GACCCTGACC CTCACCTTGG AGACCCCCCC TGGTASTACC
450
CCCTCAGTGC AATGTAGCAG TCCAAGGGCT AAAAACATAC AGGGGGGGAA
500
GACCCTCTCC CTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGCACAT
550
GCACTGTCTT GCACAACCAS AAGAAGCTSG ACTTCAAAAT ACACATCGTG
600
CTCCTACCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGCGGCA
650
ACAGCTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACCC
700
GCAGTCGCGA GCTCTGGTGG CAGGCCCAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT
750
TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC
800
CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGCCCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC
850
TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGCCI CTGGAAACCT CACCCTGGCC
900
CTTGAAGCOA AAACAGCAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTCAT
950
GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGCGGACCCA
1000
CCTCCCCTAA GCTCATCCTG AGCTTCAAAC TGCAGAACAA GGAGGCAAAG
1050
GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GCTGTGGCTG CTGAACCCTC AGGCCCCCAT
1100
CTGCCACTGT CTGCTGAGTG ACTCCGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA
1150
TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGC TGCACGCGGA TCCGCAGCTC
1200
TCCTATATCC TGCATttCCAT CCTGTTTTTG TATGGTATTG TCCTTACCCT
1250
CCTCTACTGT CGACTCAAGA TCCAGCTCCG AAAGGCAGAC ATAGCCAGCC
1300
GTGAGAAATC AGATGCTGTC TACACGGGCC TGAACACCCG GAACCAGCAC
1350
ACATATGAGA CTCTGAAACA TGAGAAACCA CCCCAATAG
1389
180 066
Informacja dotycząca SEQ ID N O : 3:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A)
(B)
(C)
(D)
Długość: 1599 par zasad
Typ: kwas nukleinowy
Niciowość: podwójna
Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: cDNA (genomowy)
(xi) Opis sekwencji: SEO ID N O : 3:
ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTCC TGCAACTGGC
50
GCTCCTCCCA CCAGCCACTC AGCGAAACAA AGTGCTCCTG GGCAAAAAAG
100
GGGATACAGT GGAACTGACC TCTACAGCTT CCCACAAGAA GAGCATACAA
150
TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC
200
CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAACCTGAA TGATCGCGCT GACTCAACAA
250
CAAGCCTTTC GCACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG
300
ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA
350
GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC
400
TTCAGGGGCA GAGCCTCACC CTGACCTTCG AGAGCCCCCC TCCTAGTAGC
450
CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA
500
GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT
550
CCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG
600
cTccTAccrr TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA
650
ACACGTCGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACACTTGAA AAGCTGACGG
700
GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT
750
TGCATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AAOGGGTTAC
800
CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC
850
TGCCCCAGCC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC
900
CTTGAACCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTCAT
950
GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA
1000
CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG
1050
GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT
1100
GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA
1150
TCAAGCTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC
1200
TGCTACCTGC TGGATGCAAT CCTCTTCATC TATGGTCTCA TTCTCACTGC
1250
CTTGTTCCTG AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG CGCAGAGCCC CCCGCGTACC
1300
AGCAGGGCCA GAACCAGCTC TATAACGAGC TCAATCTAGG ACGAAGAGAG
1350
GAGTACGATG TTTTGGACAA GAGACGTGCC CGGGACCCTG ACATGGCCGG
1400
AAAGCCGAGA AGGAAGAACC CTCAGGAAGG CCTGTACAAT GAACTGCAGA
1450
AAGATAAGAT GGCGGAGGCC TAGAGTGAGA TTGGGATGAA AGGCGAGCGC
1500
CGGAGGGGCA AGGGGCACGA TGGCCTTTAC CAGGGTCTCA GTACAGCCAC
1550
CAAGGACACC TACGACGCCC TTCACATGCA GCCCCTGCCC CCTCGCTAA
1599
180 066
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID N O : 4:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A)
(B)
(D)
Długość: 575 aminokwasów
Typ: aminokwas
Topologia:
liniowa
(ii) Typ cząsteczki: białko
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:4:
Thr Gly Lye Leu His
305
Gln Leu Gln Lya Aan
325
Lys Leu Met Lau Ser
340
Lys Arg Glu Lys Pro
355
Gln Cyo Leu Leu Ser
370
Lye Val Leu Pro Thr
385
Cys Tyr Lau Leu Asp
405
Ala Leu Tyr Leu Arg
420
Aon Leu Gln Asp Pro
435
Arg Glu Glu Tyr Asp
450
Met Gly Gly Lys Gln
465
Asn Ala Leu Cln Lya
485
Thr Lys Gly Glu Arg
500
Aep Ser HIS Pho Gln
515
Gly Sar Clu La u Thr
530
Glu Sar Thr Gln Gln
555
Pro Thr Leu Trp Ser
565
Pro Phe Arg Bis Leu
10
Ala Thr Gln Cly Aon
25
Glu Leu Thr Cye Thr
40
Lya Aan Ser Aon Gln
55
Ser
Thr Lys Gly
70
Leu Trp Aop Gln Gly
90
Clu Asp Ser Asp Thr
105
Val Gln Leu Leu Val
120
Leu Gln Gly Gln Ser
135
Ser Pro Ser Vł 1 Gln
150
Gly Lys Thr Leu Ser
170
Trp Thr Cyo Thr VAl
185
Asp Ile Val Val Leu
200
Lys Glu Gly Glu Gln
215
Glu Lye Leu Thr Gly
230
Ser ser Ser Lye Ser
250
Ser Val Lye Arg Val
265
Leu Pro Leu Kia Leu
260
Ser Gly Aan Leu Thr
295
0
Au
Met Asn Arg Gly Val
1
5
Ala Leu Lau Pro Ala
20
Lys Gly Asp Thr Val
35
Ile Gln Pho His Trp
50
Gln Gly Sar Phe Leu
65
Asp Ser Arg Arg Ser
85
Lye Aan Leu Lyo Ile
100
Asp Gln Lys Glu Clu
115
Ser Asp Thr Hio Leu
130
Ser Pro Pro Gly Ser
145
Lye Asn Ile Gln Gly
165
Gln Asp Ser Gly Thr
180
Val Clu Phe Lyo Ile
195
Ser Ile Val Tyr Lys
210
Leu Ala Phe Thr Val
225
Gln Ala Glu Arg Ala
245
Lya Aan Lyo Glu Val
260
Gln Met Gly Lyo Lys
27S
Pro Gln Tyr Ala Gly
290
Gln Glu Val Asn Leu
310
Leu Thr Cye Glu Val
330
Leu Lya Leu Glu Aon
345
Val Trp Val Lau Asn
360
Asp Ser Gly Gln Val
375
Trp Ser Thr Pro Val
390
Gly Ile Leu Phe Ile
410
Ala Lys Phe Ser Arg
425
Aan Cln Leu Tyr Aan
440
Val Leu Glu Lya Lys
455
Gln Arg Arg Arg Aan
470
Asp Lyo Ket Pro Glu
490
Arg Arg Cly Lye Gly
505
Ala Val Gln Pho Gly
520
Arg Thr Leu Gly Leu
535
Sar Ser Gln Ser Cys
550
Pro Trp Pro Pro Sar
570
Leu Leu Val Leu Cln
15
Lys Val Val Leu Gly
30
Ala Ser Gln Lys Lye
45
Ile Lyo Ile Lau Cly
60
Lyo Lau Aon Aep Arg
75
Aan Phe Pro Leu Ile
95
Tyr Ila Cys Glu val
110
Phe Gly Lau Thr Ala
125
Leu Thr Leu Thr Leu
140
Cye Arg Ser Pro Arg
155
Val Ser Gln Leu Glu
175
Leu Gln Asn Gln Lys
190
Ala Phe Gln Lys Ala
205
Val Glu Phe Ser Phe
220
Ser Gly Glu Leu Trp
235
Trp Ile Thr Phe Asp
255
Thr Gln Aep Pro Lys
270
Thr Leu Pro Gln Ala
285
Leu Ala Leu Glu Ala
300
Val Val Mat Arg Ala
315
Trp Gly Pro Thr Sor
335
Lys Glu Ala Lys Val
350
Pro Glu Ala Gly Moc
365
Leu Leu Clu Ser Asn
380
Bis Ala Aep Pro Lye
395
Tyr Cly Val Ile Ile
415
ser Ala Clu Thr Ala
430
Glu Lau Asn Lau Gly
445
Arg Ala Arg Asp Pro
460
Pro Gln Glu Gly Val
475
Ala Tyr Ser Glu Ile
495
Bis Asp Cly Leu Tyr
510
Asn Arg Arg Clu Arg
525
Arg Ala Arg Pro Lys
540
Ala Ser Val Pho Sor
565
Ser Sar Ser Cln Leu
575
Leu
Lya
Ser
Asn
Ala
80
Ile
Glu
Asn
Glu
Gly
160
Leu
Lya
Ser
Pro
Trp
240
Leu
Leu
Leu
Lys
Thr
320
Pro
Sar
Trp
Ile
Lau
400
Thr
Ala
Arg
Glu
Tyr
480
Gly
Cln
Clu
Gly
Ilo
560
180066
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID N O : 5:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 462 aminokwasy
(B) Typ: aminokwas
(D)
Topologia:
liniowa
(ii) Typ cząsteczki: białko
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:5:
Met Aen Arg Gly Val
1
5
Ala Leu Lau Pro Ala
20
Lya Gly Asp Thr val
35
Ile Gln Phe His Trp
50
Gln Gly Ser Phe Leu
65
Asp Ser Arg Arg Ser
85
Lye Aen Leu Lys Ile
100
Asp Gln Lya Glu Glu
115
Ser Asp Thr Hia Leu
130
Ser Pro Pro Gly Ser
145
Pro Phe Arg His Lau
10
Ala Thr Gln Gly Asn
25
Glu Lau Thr Cys Thr
40
Lya Asn Ser Asn Gln
55
Thr Lye Gly Pro Ser
70
Leu Trp Asp Gln Gly
90
Glu Asp Ser Asp Thr
105
Val Gln Leu Leu Val
120
Leu Gln Gly Gln Ser
135
Ser Pro Ser Val Gln
150
Lyo Asn Ile Gln Gly
165
Gln Asp Ser Gly Thr
180
Val Clu Phe Lye Ile
195
Ser Ile Val Tyr Lys
210
Leu Ala Phe Thr Val
225
Gln Ala Glu Arg Ala
245
Lyo Asn Lys Glu Val
260
Gln Met Gly Lyn Lyo
275
Pro Gln Tyr Ala Gly
290
Thr Gly Lya Lau His
305
Gln Leu Gln Lyo Asn
325
Lys Leu Kat Lau Sar
340
Lys Arg Glu Lye Pro
355
Gln Cye Lau Leu Sar
370
Lys Val Leu Pro Thr
385
cyo Tyr Ilo Lau Asp
405
Leu Leu Tyr Cye Arg
420
Ser Arg Glu Lys Ser
435
Gln Glu Thr Tyr Glu
450
Gly Lye Thr Lau Sar
170
Trp Thr Cys Thr Val
185
Asp Ile Val Val Lau
200
Lya Glu Gly Glu Gln
215
Glu Lys Leu Thr Gly
230
Ser Sar Ser Lya Ser
250
Ser Val Lyo Arg val
265
Leu Pro Lau His Lau
280
Ser Gly Asn Leu Thr
295
Gln Clu Val Asn Lau
310
Lau Thr Cye Glu Val
330
Lau Lye Lau Glu Asn
345
Val Trp Val Lau Asn
360
Asp Sar Gly Gln Va.l
375
Trp Ser Thr Pro Val
390
Ale Ile Lau Phe Lau
410
Leu Lys Ile Gln Val
425
Asp Ala Val Tyr Thr
440
Thr Leu Lya His Glu
455
Leu Lau Val Lau Cln Leu
15
Gly Lys
Lya Val Val Lau
30
Ala Ser Gln Lye
45
Ilo Lyo Ile Leu
60
Lys Leu Aon Asp
75
Aan Phe Pro Leu
Tyr
Phe
Leu
Cye
155
Lyo Ser
Gly Asn
Arg Ala
80
Ile Ile
95
Ile Cyo Glu Val Glu
110
Gly Leu Thr Ala Asn
125
Thr Leu Thr Leu Glu
140
Arg Ser Pro Arg Gly
160
Val Ser Gln Leu Glu
175
Leu Gln Asn Gln Lys
190
Ala Phe Gln Lyo Ala
205
Val Glu Phe Sar Phe
220
ser Gly Glu Leu Trp
235
Trp Ilo Thr Pho Aep
255
Thr Gln Asp Pro Lys
270
Thr Leu Pro Cln Ala
285
Leu Ala Leu Glu Ala
300
Val Val Met Arg Ala
315
Trp Gly Pro Thr Ser
335
Lys Glu Ala Lys Val
350
Pro Glu Ale Cly Ket
365
Lau Lau Glu Sar Aan
380
His Ala Asp Pro Gln
395
Tyr Gly Ile Val Lau
415
Arg Lys Ala Asp Ile
430
Gly Leu Asn Thr Arg
445
Lys Pro Pro Gln
460
462
Leu
Lys
Sar
Pro
Trp
240
Lau
Leu
Leu
Lys
Thr
320
Pro
Ser
Trp
Ile
Lau
400
Thr
Ala
Aan
180066
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID N O : 6:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 532 aminokwasy
(B) Typ: aminokwas
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: białko
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:6:
Met Ann Arg Gly Val
1
5
Ala Leu Leu Pro Ala
20
Lys Gly Asp Thr Val
35
Ile Gln Phe His Trp
50
Cln Gly Ser Phe Leu
6S
Asp Ser Arg Arg Ser
85
Lys Aan Leu Lys Ile
100
Asp Gln Lys Glu Glu
115
Pro Phe Arg His Lau
10
Ala Thr Gln Gly Asn
25
Glu Leu Thr Cys Thr
40
Lys Asn Ser Asn Gln
55
Thr Lys Gly Pro Ser
70
Leu Trp Asp Gln Cly
90
Glu Asp Ser Asp Thr
105
Val Cln Leu Leu Val
120
Lau Lau Val Leu Gln
15
Lys Val Val Lau Gly
30
Ala Ser Gln Lys Lyo
45
Ile Lys Ile Leu Gly
60
Lys Leu Asn Asp Arg
75
Asn Phe Pro Leu Ile
95
Tyr Ile Cys Glu Val
110
Phe Gly Leu Thr Ala
125
Sar Asp Thr His Leu Leu Gln
130
135
Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro
145
150
Lys Aon Ila Gln Cly Gly Lyo
165
Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr
180
Val Glu Phe Lyo Ile Asp Ilo
195
Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu
210
215
Leu Ala Phe Thr Val Clu Lya
225
230
Gln Ala Glu Arg Ala Sar Ser
245
Lys Asn Lyo Glu Val Sar Val
260
Gln Met Gly Lyo Lyo Lau Pro
275
Pro Gln Tyr Ala Gly Sar Gly
290
295
Thr Gly Lys Lau His Gln Glu
305
310
G ln Leu Gln Lyo Asn Lau Thr
325
Lys Lau Kat Leu Sar Lau Lys
340
Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp
Gly Gln Sar Leu Thr
140
Ser Val Gln Cys Arg
155
Thr Lau Sar Val Ser
170
Cys Thr Val Lau Gln
185
Val Val Lau Ala Phe
200
Gly Glu Gln Val Clu
220
Leu Thr Gly Ser Gly
235
Ser Lys s e r Trp Ile
250
Lys Arg Val Thr Gln
265
Leu His Lau Thr Lau
280
Asn Leu Thr Leu Ala
300
Val Aon Leu Val Val
315
Cyo Glu Val Trp Gly
330
Lau Glu Asn Lys Glu
345
Val Lau Asn Pro Glu
Gln Cys Lau Lau Sar Asp Ser
370
375
Lys Val Lau Pro Thr Trp Sar
385
390
Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile
405
Ala Leu Phe Lau Arg Val Lyo
420
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
435
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Lau
450
455
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
465
470
Glu Lau Gln Lys Asp Lys Met
485
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
500
Leu Sar Thr Ala Thr Lys Aop
515
Leu Pro Pro Arg
530
Oly Gln Val Lau
355
360
Leu
Lyo
Ser
Asn
Ala
80
Ile
Glu
Asn
Leu Thr Leu Glu
Sar Pro Arg Gly
160
Gln Leu Glu Lau
175
Asn Gln Lys Lys
190
Gln Lyo Ala Sar
205
Phe Ser Phe Pro
Glu Lau Trp Trp
240
Thr Pha Asp Leu
255
Asp Pro Lyo Lau
270
Pro Gln Ala Leu
285
Lau Glu Ala Lyo
Mat Arg Ala Thr
320
Pro Thr Sor Pro
335
Ala Lya Val Sar
350
Ala Gly Kat Trp
365
Lau Glu Sar Asn Ile
380
Ala Asp Pro Lys Lau
400
Cly Val Ilo Lau Thr
415
Ala Glu Pro Pro Ala
430
Lau Asn Lau Gly Arg
Thr Pro Val Bis
395
Lau Phe Ile Tyr
410
Pha Sar Arg Ser
425
Leu Tyr Asn Glu
440
Asp Lys Arg Arg Cly
460
Lys Asn Pro Gln Glu
475
Ala Glu Ala Tyr Sar
490
Lyo Gly His Asp Gly
505
Thr Tyr Aop Ala Leu
520
445
Arg Aop Pro Glu
Gly Leu Tyr Asn
480
Glu Ile Gly Mat
495
Leu Tyr Gln Gly
510
His Met Gln Ala
525
180066
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID N O : 7:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 33 pary zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C ) Niciowość: pojedyncza
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:7:
CGCGGGCTGA CCCTCCCCTC CACCAGCTTC CCC
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:8:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A)
Długość: 50 par zasad
B) Typ: kwas nukleinowy
( C ) Niciowość: pojedyncza
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:8:
CGCGGGGATC CGTCGTCCAC ACCCCGTCCA CCTCCCCGTC CTGCGCCTCA
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:9:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 33 pary zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Niciowość: pojedyncza
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:9:
CGCCGCCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC
(2)
Informacja dotyczącą SEQ ID NO:10:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A)
(B)
(C)
(D)
Długość: 33 pary zasad
Typ: kwas nukleinowy
Niciowość: pojedyncza
Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:10:
CGCGTTGACG ACCAGCCAGT TCGGCAGCAC CAG
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:11:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 15 par zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Niciowość: pojedyncza
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:11:
CGCGGGCGGC CCCTA
180066
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:12:
(i)
(ii)
(xi)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 42 pary zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Niciowość:
pojedyncza
(D)
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
Opis sekwencji: SEQ ID NO:12:
CCCGGGCTCG TTATAGACCT GCTTCTGCCG CTGCTTCTTC TG
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:13:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 48 par zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Niciowość: pojedyncza
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:13:
CGCGGGGACC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TTATCCGG
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:14:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A)
(B)
(C)
(D)
Długość: 33 pary zasad
Typ: kwas nukleinowy
Niciowość: pojedyncza
Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:14:
CCCGGGCCGG CCACGCCTCC TCGCCAGCAC ACA
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:15:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 36 par zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Niciowość: pojedyncza
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:15:
CGCGGGACGC CTTTCAGCCG TCCTCGCCAG CACACA
180066
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:16:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 33 pary zasad
(B)
(C)
(D)
Typ: kwas nukleinowy
N i c i owość: pojedyncza
Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:16:
CGCGGCACGC GTGACCCTGA GATGGGCGGA AAO
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:17:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 33 pary zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
C
() Niciowość: pojedyncza
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:17:
CCCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAOCCCAS CCC
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:18:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 26 par zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Niciowość: pojedyncza
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:18:
CCCGGATCCC AGCATGGCCA CCTCTT
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:19:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 42 pary zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Niciowość: pojedyncza
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:19:
CGCGGCCCGG CCGCTTTAOT TATTACTGTT GACATGGTCG TT
180 066
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:20:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 30 par zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Niciowość: pojedyncza
(D ) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:20:
GCGGGCGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAC
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:21:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 32 pary zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Niciowość: pojedyncza
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:21:
GCGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:22:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 31 par zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Niciowość: pojedyncza
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:22:
TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:23:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 31 pary zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(C) Niciowość: pojedyncza
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:23:
TTGTTGCTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A
180066
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:24:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A)
(B)
(D)
Długość: 171 aminokwasow
Typ: aminokwas
Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: aminokwas
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:24:
Mat Glu Ele Sar Thr
5
Sar Gln Val Sar Pro
20
val Phe Val Aon Cys
35
Gly Thr Leu Leu Ser
50
Leu Asp Pro Arg Gly
65
Aop Lye Glu Ser Thr
85
Val Glu Leu Aop Pro
100
Ala Ile Thr Lau Leu
115
Glu Thr Gly Arg Leu
130
Aon Asp Gln Val Tyr
145
Sar Bis Lau Gly Gly
165
(2)
Phe Lau Sar Gly Leu
10
Pha Lye Ile Pro Ile
25
Asn Thr Ser Ilo Thr
40
Asp Ile Thr Arg Lau
55
Ile Tyr Arg Cya Aon
70
Val Gln val Bis Tyr
90
Ala Thr Val Ala Gly
105
Leu Ala Leu Gly Val
120
Sar Gly Ala Ala Aop
135
Gln Pro Lau Arg Alp
150
Aon Trp Ala Arg Asn
170
Val Leu Ala Thr Leu
15
Glu Glu Leu Glu Asp
30
Trp Val Glu Gly Thr
45
Asp Leu
Lys Arg
60
Gly Thr Asp Ilo Tyr
75
Arg Met Cyo Gln Ser
95
Ile Ile Val Thr A»p
110
Pha Cya Phe Ala Gly
125
Thr Gln Ala Leu Leu
140
Arg Asp Asp Ala Gln
155
Lya
Leu
Arg
Val
Ile
Lya
80
Cys
Val
His
Arg
Tyr
160
Informacja dotyczącą SEQ ID NO:25:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 182 aminokwasy
(B) Typ: aminokwas
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: aminokwas
(xi) Opis sekwencji : SEQ ID NO:25
:
Ile Ile Leu
15
Aan Bis Leu Val Lys
30
Leu Thr Cys Asp Ala
45
Lys Met Ile Gly Phe
60
Ser Asn Ala Lyo Asp
80
Asn Lys Ser Lys Pro
95
Ile Glu Leu Asn Ala
110
Val Sar Ile Phe Val
125
Asp Gly Val Arg Gln
140
Ile Leu
Met Glu Cln Gly Lyo
5
Lau Cln Gly Thr Lau
20
Val Tyr Asp Tyr Cln
35
Glu Ala Lys Asn Ile
50
Leu Thr Glu Asp Lys
65
Pro Arg Gly Met Tyr
85
Leu Gln Val Tyr Tyr
100
Ala Thr Ile Ser Gly
115
Leu Ala Val Gly Val
130
Gly Leu Ala Val Lau
10
Ala Gln Ser Ile Lye
25
Glu Asp Gly Ser Val
40
Thr Trp Phe Lys Asp
55
Lys Lys Trp Asn Leu
70
Gln Cys Lys Gly Ser
90
Arg Met Cys Gln Asn
105
Phe Leu Phe Ala Glu
120
Tyr Phe Ile Ala Gly
135
Sar Arg Ala Sar Asp
145
Gln Pro Leu Lya Arg
165
Asn Gla Leu Arg Arg
180
Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Lau Tyr
155
160
150
Arg Glu Asp Asp Cln Tyr Ser His Leu Gln Gly
170
175
Asn
Gly
Leu
Gly
Gly
75
Gln
Cys
Ile
Cln
180066
(2)
Informacja dotycząca SEQ ID NO:26:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 220 aminokwasów
(B) Typ: aminokwas
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: aminokwas
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:26:
Met Pro Gly Gly Leu
5
Leu Ser Tyr Ala Cya
20
Gly Gly Pro Pro Sar
35
Thr Cym Glu Asn Asn
50
Lau Gln Ser Asn Ile
65
Gly Thr Thr Gly Gln
85
Ala Cyn Thr Gly Cys
100
Cys Gly Thr Tyr Leu
115
Asp Met Gly Glu Gly
130
Ile Leu Leu Phe Cys
145
Lys Arg Trp Gln Asn
165
Glu Asp Glu Asn Leu
180
Tyr Glu Asp Ile Ser
195
Asn Leu His Ile Gly
210
(2)
Glu Ala Leu Arg Ala
10
Leu Gly Pro Gly Cys
25
Lau Thr Val Asn Lau
40
Gly Arg Asn Pro Asn
55
Thr Trp Pro Pro Val
70
Lau Pho Pho Pro Glu
90
Gln val Ile Glu Asn
105
Arg Val Arg Asn Pro
120
Thr Lys Asn Arg Ile
135
Ala Val Val Pro Gly
150
Glu Lya Pho Gly Val
170
Tyr Glu Gly Lau Asn
185
Arg Gly Leu Gln Cly
200
Asp Ala Gln Leu Glu
215
Leu Pro Leu Leu Leu
15
Gln Ala Lau Arg Val
30
Cly Glu Glu Ala Arg
45
Ile Thr Trp Trp Pho
60
Pro Leu Gly Pro Gly
75
Val Asa Lyo Asn Thr
95
Asn Ile Leu Lyo Arg
110
Val Pro Arg Pro Pho
125
Ile Thr Ala Glu Gly
140
Thr Leu Leu Leu Phe
155
Asp Met Pro Asp Asp
175
Leu Asp Asp Cys Ser
190
Thr Tyr Gln Asp Val
205
Lya Pro
220
Pha
Glu
Lau
Sar
Gln
80
Gly
Ser
Leu
Ile
Arg
160
Tyr
Ket
Gly
Informacja dotycząca SEQ ID NO:27:
(i)
Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 228 aminokwasów
(B) Typ: aminokwas
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: aminokwas
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:27
Met Ala Thr Leu Val Leu Ser Ser Het Pro Cys His Trp Leu Leu Phe
15
10
5
Leu Leu Leu Leu Phe Ser Gly Glu Pro Val Pro Ala Met Thr Ser Ser
30
25
20
A0p Leu Pro
35
His Pro Arg
50
Cys Tyr Thr
65
Ser Gln Gln
Thr Gln Asn
a
Asp Asn
115
His Asn Val
130
Ser Thr Leu
145
Ile Leu Ile
Phe Leu Leu
His Thr Tyr
195
Ile val Thr
210
Pro Gly Gln
225
Leu Asn Phe Gln Gly
40
Phe Ala Ala Lys Lys
55
Asn His Ser Gly Ala
70
Pro Gln Glu Leu Val
85
Gly Ser Val Tyr Thr
100
Gly Ile Tyr Phe Cys
120
Thr Asp Ser Cys Gly
135
Asp Gln Lau Lya Arg
150
Gln Thr Leu Leu Ile
165
Leu Asp Lys Asp Asp
180
Glu Gly Leu Asn Ile
200
Leu Arg Thr Gly Glu
215
Glu
Ser Pro Cys Ser Gln
45
Arg Ser Ser Mec Val
60
Leu Thr Trp Phe Arg
75
Ser Glu Glu Gly Arg
90
Leu Thr Ile Gln Asn
105
Lys Gln Lys Cys Asp
125
Thr Glu Leu Leu Val
140
Arg Asn Thr Lau Lyo
155
Ile Leu Phe Ile Ile
170
Gly Lys Ala Gly Ket
185
Asp Gln Thr Ala Thr
205
Val Lys Trp Ser val
220
Ile Trp Gln
Lys Pha His
Lys Arg Gly
80
Ile Val Gln
95
Ila Gln Tyr
110
Sar Ala Asn
Leu Gly Phe
Asp Gly Ile
160
Val Pro Ile
175
Glu Glu Asp
190
Tyr Glu Asp
Gly Glu Hia
180066
FIG. 1a
FIG. 1b
Intensywność fluorescencji
180066
FIG. 2
FIG. 3
180066
FIG. 4a
FIG. 4b
180066
FIG. 4c
FIG. 4d
FIG. 5a
FIG. 5b
180066
F IG .
5
c
180066
FIG. 6a
FIG.6b
180066
FIG. 7a
FIG. 7b
180066
FIG. 8a
FIG. 8b
180066
FIG. 9a
FIG. 9b
180066
FIG. 9c
FIG. 9d
180066
FIG. 10a
FIG. 10b
180066
FIG. 10c
FIG. 10d
180066
FIG. 10e
RG. 10f
FIG. 11a
FIG. 11b
FIG. 12
180066
FIG. 13a
FIG. 13b
180066
FIG 14a
FIG. 14b
180066
FIG. 15a
FIG. 15b
FIG. 15c
180066
FIG. 15d
FIG. 15e
180066
FIG.16
(Seq. ID Ho:
24)
1
MEHSTFLSGL
VLATLLSQVS
PFKIPIEELE
51
DRVFVNCNTS
LLSDITKLDL
GKRILDPRGI
YRCNGTDIYK
ITWVEGTVGT
DKESTVQVHY
101
PATVAGIIVT
DVIATLLLAL
RKCQSCVELD
GVFCFAGHET
GfeLSGAADTQ
151
PLRDRDDAQY
ALLRNDQVYQ
SHLGGNWARN
K*
FIG. 17
(Seq ID NO:
25)
1
MEQGKGLAVL
ILAIILLQGT
LAQSIKGNHL
VKVYDYQEDG
SVLLTCDAEA
51
KNITWFKDGK
MIGFLTEDKK
KWNLGSNAKD
PRGMYQCKGS
QNKSKPLQVY
101 YRMCQNCIEL
NAATISGFLF
AEIVSIFVLA
VGVYFIAGQD
(GVRQSRASDK
151 QTLLPNDQLY
QPLKDREDDQ
YSHLQGNQLR
RN*
FIG. 18
(Seq ID No:
26)
1
MPGGLEALRA
LPLLLFLSYA
CLGPGCQALR
VEGGPPS LTV
NLGEEARLTC
51
ENNGRNPNIT
WWFSLQSNIT
WPPVPLGPGQ
GTTGQLFFPE
VNKNTGACTG
101 CQVIENNILK
RSCGTYLRVR
NPVPRPFLDM
GEGTXNRIIT
AEGIILLFCA
151 W P G T L L L F R
KRWQNEKFGV
DHPDDYEDEN
LYEGLNLDDC
SHYEDISRGL
201 QGTYQDVGNL
HIGDAQLEKP
FIG. 19
3
(Seq ID No: 27)
1
MATLVLSSMP
CHWLLFLLLL
FSGEPVPAMT
SSDLPLNFQG
SPCSQIWQHP
51
RFAAKKRSSM
VKFHCYTNHS
GALTWFRKRG
SQQPQELVSE
EGRIVQTQNG
101 SVYTLTIQNI
QYEDNGIYFC
KQKCDSANHN
VTDSCGTELL
VIiGFSTLDQL
151 KRRNTLKDGI
ILIQTLLIIL
FIIVPIFLLL DKlDDGKAGME
DQTATYEDIV
TLRTGEVKWS
VGEHPGQE*!
20 1
EDHTYEGLNI
Fig.
20e
Fig.
20d
Fig. 28
Fig. 20c
Fig.
20b
Fig.
20a
180066
FIG. 21
FIG. 22
180066
FIG. 23
180066
FIG. 24
FIG. 25
180066
FIG. 26
FIG. 27
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 6,00 zł.
Download