R Z EC Z PO SPO LITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: 315908 12.01.1995, PCT/US95/00454 (54) ( 30) (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 17.08.1995, W095/21528, PCT Gazette nr 35/95 C07K C07K C12N C12N C12N 14/73 14/735 15/07 15/13 15/63 U p raw n io n y z patentu: Pierwszeństwo: The General Hospital Corporation, Boston, US Zgłoszenie ogłoszono: (72) Twórcy wynalazku: Brian Seed, Boston, US Babak Banapour, El Sobrante, US Charles Romeo, Belmont, US Waldemar Kolanus, München, DE 09.12.1996 BUP 25/96 ( 45) (51) IntCl7: Białkowy chimeryczny receptor błonowy, zmodyfikowana komórka, DNA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy i wektor zawierający taki DNA 14.02.1994,US,08/195395 02.08.1994,US,08/284391 © (13)B1 12.01.1995 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (11) 180066 O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.12.2000 WUP 12/00 (74) Pełnom ocnik: Ostrowska Elżbieta, POLSERYICE PL 180066 B1 (5 7 ) 1. Białkowy chim eryczny receptor błonowy, zawierający (a) pozakomórkową część zaw ierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragm ent CD4 je st oddzielony od wewnątrzkomórkowej części dom eną zaw ierającą sekwencję am inokw asow ą w ybraną z grupy obejmującej: fragment CD7 posiadającą SEQ ID NO: 35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonow ą CD7, część przezbłonow ą CD5, część przezbłonową CD3 4, białkową - α -ehlisę. 4. Zm odyfikowana kom órka pochodząca z grupy obejmującej (a) limfocyty T; (b) cytotoksyczne limfocyty T; (c) naturalne komórki zabijacze; (d) neutrofile; (e) granulocyty; (f) makrofagi; (g) komórki tuczne; (h) komórki HeLa; oraz (i) embrionalne komórki macierzyste, w ytwarzająca w wyniku ekspresji związany z błoną, białkowy chimeryczny receptor, zawierający (a) pozakom órkow ą część zaw ierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część w ewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części dom eną przezbłonową, zaw ierającą sekwencję am inokw asow ą w ybraną z grupy obejmującej. CD7 posiadającą SEQ ID N O:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonowąCD 7, część przezbłonow ą CD5, część przezbłonow ą CD34, je d n ą lub więcej białkowych α-helis. 9. W ektor zawierający D NA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakom órkow ą część zaw ierającą fragm ent CD4 obejm ujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części dom eną przezbłonową, zaw ierającą sekwencję aminokw asow ą w y b ra n ą z grupy obejm ującej: CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonow ą CD34, je d n ą lub więcej białkowych α -helis. Białkowy chimeryczny receptor błonowy, zmodyfikowana komórka, DNA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy i wektor, zawierający taki DNA Zastrzeżenia patentowe 1. Białkowy chimeryczny receptor błonowy, zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: fragment CD7 posiadającą SEQ ID NO: 35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonowąCD7, część przezbłonowąCD5, część przezbłonową CD34, białkową a-helisę. 2. Chimeryczny receptor według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera fragment CD4 posiadający SEQ ID NO: 31. 3. Chimeryczny receptor według zastrz. 1, znamienny tym, że białko receptora komórki T stanowi ζ. 4. Zmodyfikowana komórka pochodząca z grupy obejmującej (a) limfocyty T; (b) cytotoksyczne limfocyty T; (c) naturalne komórki zabijacze; (d) neutrofile; (e) granulocyty; (f) makrofagi; (g) komórki tuczne; (h) komórki HeLa; oraz (i) embrionalne komórki macierzyste, wytwarzająca w wyniku ekspresji związany z błoną, białkowy chimeryczny receptor, zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną przezbłonową, zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub więcej białkowych α-helis. 5. Komórka według zastrz. 4, znamienna tym, że fragment CD4 jest oddzielony od błony komórki o co najmniej 48 A lub o co najmniej 72 A. 6. Komórka według zastrz. 4, znamienna tym, że białko receptora komórki T stanowi 7. DNA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200. oraz (b) część wewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną przezbłonową, zawierającą sekwencję aminokwasowąwybranąz grupy obejmującej: CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub więcej białkowych -α -helis. 8. DNA według zastrz. 7, znamienny tym, że zawiera SEQ ID N0:30. 9. Wektor zawierający DNA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną przezbłonową, zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część 180 066 3 przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub więcej białkowychα-helis. 10. Wektor według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera SEQ ID N0:30. * * * Przedmiotem wynalazku są funkcyjne chimery pomiędzy fragmentami CD4 i receptorami komórki odporności, które są zdolne do kierowania komórek odporności, w celu przeprowadzenia lizy komórek zainfekowanych przez HIV, ale nie nadaje komórkom odporności podatności na infekcję HIV. W związku z tym wynalazek dostarcza nowego i skutecznego sposobu terapii HIV. Stan techniki wynalazku Rozpoznawanie przez komórki T antygenu za pomocą receptora komórki T stanowi podstawę szeregu zjawisk immunologicznych. Komórki T kierują tak zwaną odpornością z udziałem komórek. Obejmuje ona niszczenie przez komórki układu odpornościowego obcych tkanek lub zainfekowanych komórek. Znanych jest szereg komórek T, obejmujących komórki „wspomagające” i „supresyjne”, które modulują reakcję odpornościową, oraz komórki cytotoksyczne (lub „zabijacze”), które mogą bezpośrednio zabijać nieprawidłowe komórki. Komórka T, która rozpoznaje i wiąże się z unikatowym antygenem występującym na powierzchni innej komórki, uaktywnia się; może się następnie mnożyć, a w przypadku, gdy jest to komórka cytotoksyczna, może ona zabijać związaną komórkę. H IV i immunopatogeneza W 1984 roku wykazano, że HIV jest czynnikiem etiologicznym AIDS. Od tego czasu definicję AIDS korygowano szereg razy w odniesieniu do kryteriów, które powinny zostać uwzględnione w diagnozie. Jednak pomimo płynności parametrów diagnostycznych prostym wspólnym mianownikiem AIDS jest infekcja HIV, a następnie rozwój trwałych uogólniających objawów oraz chorób związanych z AIDS, takich jak wtórne infekcje, nowotwory i choroba neurologiczna. Harrison’s Principles of Internal Medicine, 12th Ed., McGraw Hill (1991). HIV jest ludzkim retrowirusem należącym do grupy wirusów wolno działających. 4 rozpoznane ludzkie retrowirusy należą do dwóch różnych grup: ludzkie wirusy T-limfotropowe (białaczki), HTLV-1 i HTLV-2, oraz ludzkie wirusy upośledzenia odporności, HIV-1 i HIV-2. Pierwsze należą do wirusów przekształcających, drugie do wirusów cytopatycznych. HIV-1 zidentyfikowano jako najczęstszą przyczynę AIDS w całym świecie. Homologia sekwencji między HIV-1 i HIV-2 wynosi około 40%, przy czym HIV-2 jest ściślej spokrewniony z pewnymi składnikami grupy małpich wirusów upośledzenia odporności (SIV). Patrz Curran J. i inni, Science, 329:1357-1359 (1985); Weiss R. i inni, Nature, 324:572-575 (1986). HIV zawiera zwykłe geny retrowirusowe (env, gag oraz pol), a także 6 dodatkowych genów uczestniczących w replikacji i innych czynnościach biologicznych wirusa. Jak to zaznaczono powyżej, wspólnym mianownikiem AIDS jest znaczące upośledzenie odporności, przede wszystkim odporności z udziałem komórek. Takie upośledzenie odporności prowadzi do różnych chorób oportunistycznych, zwłaszcza pewnych infekcji i nowotworów. Jako główną przyczynę niedoboru odporności w AIDS zidentyfikowano ilościowe i jakościowe zubożenie w podzbioru limfocytów pochodzących z grasicy (T), populacji T4. Ten podzbiór komórek jest określany fenotypowo przez obecność powierzchniowej cząsteczki CD4, która, jak to wykazano, jest komórkowym receptorem dla HIV. Dalgleish i inni, Nature 312:763 (1984). Jakkolwiek komórki T4 stanowią główny typ komórek infekowanych przez HIV, to zasadniczo dowolna ludzka komórka, która w wyniku ekspresji zawiera na swojej powierzchni cząsteczkę CD4, może wiązać HIV i być przezeń zainfekowana. Tradycyjnie komórkom CD4+ przypisuje się rolę pomocnika/induktora, co wskazuje na ich rolę w dostarczaniu sygnału uaktywniającego do komórek B, albo indukowaniu limfocytów T przenoszących zwrotny marker CD8, tak że stają się komórkami cytotoksycznymi/supresyjnymi. Reinherz i Schlossman, Celi 19:821-827 (1980); Goldstein i inni, Immunol. Rev. 68:5-42 (1982). 4 180 066 HIV wiąże się specyficznie z wysokim powinowactwem poprzez ciąg aminokwasów w kopercie wirusowej (gp 120) z częścią regionu VI cząsteczki CD4 zlokalizowaną w pobliżu jej N-końca. Po związaniu, wirus zlewa się z błoną docelowej komórki i intemalizuje ją. Po internalizacji wykorzystuje on enzym odwrotną transkryptazę do transkrybowania swojego genomowego RNA w DNA, który integruje się z komórkowym DNA, gdzie istnieje przez cały okres życia komórki jako „prowirus”. Prowirus może pozostać uśpiony lub uaktywnić się i transkrybować mRNA i genomowy RNA, co prowadzi do syntezy białka, złożenia, powstania nowego wiriona oraz odszczepienia się wirusa od powierzchni komórki. Jakkolwiek dokładny mechanizm, według którego wirus wywołuje śmierć komórki, nie został ustalony, uważa się, że podstawowy mechanizm obejmuje masowe odszczepianie się wirusów z powierzchni komórki, co prowadzi do zniszczenia błony plazmowej i powoduje utratę równowagi osmotycznej. W czasie infekcji organizm gospodarza wytwarza przeciwciała przeciw białkom wirusa, obejmującym podstawowe glikoproteiny kopertowe gp 120 i gp41. Pomimo tej humoralnej odporności choroba rozwija się, co prowadzi do śmiertelnego upośledzenia odporności charakteryzującego się licznymi oportunistycznymi infekcjami, obecnością pasożytów we krwi, otępieniem i śmiercią. Niemożność przeciwwirusowych przeciwciał gospodarza do zatrzymania postępu choroby stanowi jeden z najbardziej dotkliwych i alarmujących aspektów infekcji i źle wróży próbom zastosowania szczepionek, opartych na konwencjonalnych rozwiązaniach. Dwa czynniki mogą odgrywać rolę w skuteczności reakcji humoralnej na wirusy upośledzenia odporności. Po pierwsze, podobnie jak inne wirusy RNA (a zwłaszcza podobne retrowirusy), wirusy upośledzenia odporności wykazują wysoką szybkość mutacji w odpowiedzi na nadzór odpornościowy gospodarza. Po drugie, same glikoproteiny kopertowe stanowią silnie glikozylowane cząsteczki zawierające niewiele epitopów przydatnych w wiązaniu przeciwciała z wysokim powinowactwem. Słaby cel antygenowy, który stanowi koperta wirusowa, stwarza gospodarzowi niewiele szans na ograniczenie infekcji wirusowej poprzez wytwarzanie określonych przeciwciał. Komórki zainfekowane wirusem HIV wytwarzają w wyniku ekspresji glikoproteinę gpl20 na powierzchni Gp 120 uczestniczy w zjawiskach fuzji między komórkami CD4+poprzez reakcje zbliżone do tych, dzięki którym wirus wnika do niezainfekowanych komórek, co prowadzi do powstania krótko żyjących wielojądrowych komórek olbrzymich. Powstawanie zespólni jest uzależnione od bezpośredniego oddziaływania glikoproteiny kopertowej gpl20 z białkiem CD4. Dalgleish i inni, supra; Klatzman D. i inni, Nature 312:763 (1984); MCDougal J.S. i inni, Science 231:382 (1986); Sodroski J. i inni, Nature 322:470 (1986); Lifson J.D. i inni, Nature 323:725 (1986); Sodroski, J. i inni, Nature 321:412 (1986). Do dowodów na to, że wiązanie CD4-gp 120 jest odpowiedzialne za infekcję wirusową komórek przenoszących antygen CD4 należy odkrycie, że tworzy się specyficzny kompleks między gpl20 i CD4. MCDougal i inni, supra. Inni badacze wykazali, że linie komórek, które nie są infekowane przez HIV, przekształcają się w dające się zainfekować linie komórek po transfekcji i ekspresji CDNA ludzkiego genu CD4. Maddon i inni, Celi 46:333-348 (1986). Zaproponowano programy terapeutyczne oparte na rozpuszczalnym CD4 jako pasywnym czynniku zakłócającym adsorpcję wirusa i transmisję komórkową z udziałem zespólni, a liczne grupy wykazały przydatność takiego podejścia in vitro (Deen i inni, Nature 331:82-84 (1988); Fisher i inni, Nature 331:76-78 (1988); Hussey i inni, Nature 331:78-81 (1988); Smith i inni, Science 238:1704-1707 (1987); Traunecker i inni, Nature 331:84-86 (1998)); następnie opracowano immunoglobulinowe białka fuzyjne CD4 o wydłużonych okresach półtrwania i nieznacznej aktywności biologicznej (Capon i inni, Nature 337:525-531 (1989); Traunecker i inni, Nature 339, 68-70 (1989); Bym i inni, Nature 344:667-670 (1990); Zettlmeissl i inni, DNA Cell Biol, 9:347-353 (1990)). Jakkolwiek koniugaty immunotoksynowe CD4 lub białka fuzyjne wykazują silną cytotoksyczność względem zainfekowanych komórek in vitro (Chaudhary i inni, Nature 335:369-372 (1988); Till i inni, Science 242:1166-1168 (1988)), uśpienie zespołu upośledzenia odporności powoduje, że mało prawdopodobne jest, aby jakakolwiek jednorazowa terapia była skuteczna w 180 066 5 wyeliminowaniu obciążenia wirusowego, a antygenowość obcych białek fuzyjnych ograniczy prawdopodobnie ich przydatność w leczeniu wymagającym powtarzanego dawkowania. Próby na małpach zainfekowanych SIV wykazały, że rozpuszczalne CD4 podawane zwierzętom bez znaczącej cytopenii CD4 może zmniejszyć miano SIV i poprawić miary in vitro potencjału rdzeniowego (Watanabe i inni, Nature 337:267-270 (1989)). Jednakże, po przerwaniu leczenia zaobserwowano szybki ponowny rozwój wirusów, co sugeruje, że długotrwałe podawanie może być konieczne, aby zapobiec stopniowemu osłabieniu układu odporności. Komórka T i receptory Fc Ekspresja na powierzchni komórki najbardziej rozpowszechnionej formy receptora antygenu komórki T (TCR) wymaga współekspresji co najmniej 6 różnych łańcuchów polipeptydowych (Weiss i inni, J. Exp. Med. 160:1284-1299 (1984); Orloühashi i inni, Nature 316:606-609 (1985); Berkhout i inni, J. Biol. Chem. 263:8528-8536 (1988); Sussman i inni, Celi 52:85-95 (1988)), łańcuchów wiążących antygen α/ß, 3 polipeptydów kompleksu CD3 iζ. Gdy któryś z tych łańcuchów nie występuje, trwała ekspresja pozostałych elementów kompleksu nie zachodzi. ζ jest ograniczającym polipeptydem powierzchniowej ekspresji pełnego kompleksu (Sussman i inni, Cell 52:85-95 (1988)), a ponadto uważa się, że uczestniczy ono w co najmniej części komórkowych programów uaktywniania uruchamianych przez rozpoznawanie ligandu przez receptor (Weissman i inni, EMBO J. 8:3641-3656 (1989); Frank i inni, Science 249:174-177 (1990)). Integralny homodimer błonowy typu I o 32kDa, ζ (zeta) zawiera domenę pozakomórkow ą o 9 resztach bez miejsc do N-połączonej addycji glikanu, oraz domenę wewnątrzkomórkową o 112 resztach (mysią) lub 113 resztach (ludzką) (Weissman i inni, Science 238:1018-1020 (1988); Weissman i inni, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:9709-9713 (1988)). Izoforma ζ określana jako (eta) (Baniyash i inni, J. Biol. Chem. 263:9874-9878 (1988); Orloff i inni, J. Biol. Chem. 264:14812-14817 (1989)), powstająca przy wariantowej drodze rozszczepiania mRNA (Jin i inni, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:3319-3233 (1990)), występuje w zmniejszonych ilościach w komórkach, w których zachodzi ekspresja receptora antygenu. Uważa się, że heterodimery uczestniczą w tworzeniu się fosforanów inozytolu, a także w zainicjowanej przez receptor programowanej śmierci komórki, określanej jako apoptoza (Merćep i inni, Science 242:571-574 (1988); Merćep i inni, Science 246:1162-1165 (1989)). Podobnie jakηζ iη, zasocjowany z receptorem Fc łańcuch y jest wytwarzany w wyniku ekspresji w występujących na powierzchni komórki kompleksach z dodatkowymi polipeptydami, z których część uczestniczy w rozpoznawaniu ligandu, a rola innych nie jest określona, y (gamma) wykazuje homodimeryczną strukturę i ogólną organizację podobną do ζ , stanowiąc składnik zarówno receptora IgE z wysokim powinowactwem względem komórki tucznej/zasadochłonnej, FceRI, który zawiera co najmniej 3 różne łańcuchy polipeptydowe (Blank i inni, Nature 337:187-189 (1989); Ra i inni, Nature 241:752-754 (1989)), oraz jednego z receptorów z niskim powinowactwem względem IgG, reprezentowanych u myszy przez Fcγ RIIα (Ra i inni, J. Biol. Chem. 264:15323-15327 (1989)), a także u ludzi przez ekspresję podtypu CD 16 w makrofagach i naturalnych komórek zabijaczy, CD16TM (przezbłonowy CD16) (Lanier i inni, Nature 342:803-805 (1989); Anderson i inni, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2274-2278 (1990)) oraz z polipeptydem o nieokreślonym znaczeniu (Anderson i inni, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 87:2274-2278 (1990)). Ostatnio doniesiono, że y powstaje w wyniku ekspresji w mysiej linii komórek T. CTL, w których tworzy on homodimery oraz heterodimery y-ζ, i y-η (Orloff i inni, Nature 347:189-191 (1990)). Receptory Fc uczestniczą w fagocytozie kompleksów immunologicznych, transcytozie oraz cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) (Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Unkeless i inni, Annu. Rev. Immunol 6:251-281 (1988); oraz Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1:16-25 (1988)). Ostatnio wykazano, że jedna z mysich izoform receptora Fc z niskim powinowactwem, FcRylllB1, uczestniczy w internalizacji celów powleczonych Ig w powleczonych klatryną studzienkach, a inny receptor z niskim powinowactwem, FcrylllA uczestniczy w ADCC poprzez zasocjowanie z jednym lub więcej elementami z małej grupy „cząsteczek wyzwalających” (Miettinen i inni, Celi 58:317-327 (1989); oraz Hunziker i Mellman, J. Celi Biol. 109:3291-3302 (1989)). Te cząsteczki wyzwalające, receptor komórki T 6 180 066 (TCR) łańcuchζ, tłuszczowyηTCR oraz łańcuch y receptora Fc oddziałują z domenami rozpoznawania ligandu różnych receptorów układu odpornościowego oraz mogą autonomicznie inicjować komórkowe programy efektorowe, w tym cytolizę, po agregacji (Samelson i inni, Celi 43:223-231 (1985); Weissman i inni, Science 239:1018-1020 (1988); Jini inni, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:3319-3323 (1990); Blank i inni, Nature 337:187-189 (1989); Lanier i inni, Nature 342:803-805 (1989); Kurosaki i Ravetch, Nature 342:805-807 (1989); Hibbs i inni, Science 246:1608-1611 (1989); Anderson i inni, Proc. Natl. Sci. USA 87:2274-2278 (1990); oraz Irving i Weiss, Celi 64:891-901 (1991)). Przy porównywaniu mysiej i ludzkiej rodziny receptora FC z niskim powinowactwem okazało się jednak, że ludzkie izoformy FcRyllA i C nie mają mysich odpowiedników. Częściowo z tego względu ich rola nie została dotychczas określona. W związku z tym, że same czynniki humoralne oparte na CD4 mogą mieć ograniczoną przydatność in vivo, we wcześniejszych pracach rozwijano możliwość zwiększenia odporności komórek na HIV. Zidentyfikowano preparaty chimer białkowych, w których pozakomórkowa domena CDS jest złączona z przezbłonową i/lub wewnątrzkomórkową domeną receptora komórki T, receptora IgG F lub elementów przenoszących sygnał receptora komórki B (zgłoszenia patentowe USA nr 07/847 566 i 07/665 961, które wprowadza się jako źródła literaturowe). Cytolityczne komórki T, w których zachodzi ekspresja chimery obejmujące pozakomórkową domenę CD4 powodują silną, niezależną od MHC destrukcję celów komórkowych, w których zachodzi ekspresja białek kopertowych HIV. Wyjątkowo ważnym i nowym elementem takiego podejścia było zidentyfikowanie pojedynczego receptora komórki T, receptora Fc, oraz łańcuchów receptora komórki B, których agregacja wystarcza do zainicjowania odpowiedzi komórkowej. Jednym ze szczególnie użytecznych zastosowań takiego rozwiązania było wynalezienie chimer pomiędzy CD4 oraz ζ, ηlub y, które kierują cytolityczne limfocyty T, tak, że rozpoznają one i zabijają komórki, w których zachodzi ekspresja gp120 HTV (zgłoszenia patentowe USA nr 07/847 566 i 07/665 961, które wprowadza się jako źródła literaturowe). Istota wynalazku Przedmiotem wynalazku jest białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakomórkowączęść zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: fragment CD7 posiadającą SEQ ID NO: 35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, białkowąa-helisę. Korzystnie chimeryczny receptor według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera fragment CD4 posiadający SEQ ID NO: 31 oraz równie korzystnie tym, że białko receptora komórki T stanowi ζ. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowana komórka pochodząca z grupy obejmującej (a) limfocyty T; (b) cytotoksyczne limfocyty T; (c) naturalne komórki zabijacze; (d) neutrofile; (e) granulocyty; (f) makrofagi; (g) komórki tuczne; (h) komórki HeLa; oraz (i) embrionalne komórki macierzyste, wytwarzająca w wyniku ekspresji związany z błoną, białkowy chimeryczny receptor zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną przezbłonową, zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonowąCD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub więcej białkowych α-helis. Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że fragment CD4 jest oddzielony od błony komórki o co najmniej 48 A lub o co najmniej 72 A. Również korzystnie białko 180 066 7 receptora komórki T stanowi ζ . Kolejnym przedmiotem wynalazku jest DNA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz(b) część wewnątrzkomórkową którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną przezbłonową, zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub więcej białkowych α-helis. Korzystnie DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że SEQ ID N0:30. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor zawierający DNA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną przezbłonową, zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub więcej białkowychα-helis. Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera SEQ ID N0:30. Wynalazek ujawnia sposób kierowania komórkowej reakcji odpornościowej przeciw zainfekowanym przez HIV komórkom ssaka. Sposób obejmuje podawanie ssakowi skutecznej ilości terapeutycznych komórek, przy czym w tych terapeutycznych komórkach zachodzi ekspresja związanego z błoną, białkowego chimerycznego receptora obejmującego (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 zdolny do specyficznego rozpoznawania komórki zainfekowanej przez HIV i wiązania się z nią, ale nie uczestniczy w infekcji HIV, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, która jest zdolna do sygnalizowania komórce terapeutycznej zniszczenie związanej z receptorem komórki zainfekowanej przez HIV. Zgodnie ze zbliżonym rozwiązaniem, przedmiotem ujawnienia jest zastosowanie terapeutycznych komórek, w których zachodzi ekspresja związanego z błoną, białkowego chimerycznego receptora obejmującego (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4, zdolny do specyficznego rozpoznawania komórki zainfekowanej przez HIV i wiązania się z nią, ale nie uczestniczy w infekcji HIV, oraz (b) część wewnątrzkomórkową która jest zdolna do sygnalizowania komórce terapeutycznej zniszczenie związanej z receptorem komórki zainfekowanej przez HIV, do wytwarzania leku, stosowanego w leczeniu chorób związanych z HIV. W drugim aspekcie ujawnienie dotyczy komórki, w której zachodzi ekspresja związanego z błoną białkowego chimerycznego receptora obejmującego (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4, zdolny do specyficznego rozpoznawania komórki zainfekowanej przez HIV i wiązania się z nią, ale nie uczestniczy w infekcji HIV, oraz (b) część wewnątrzkomórkową, która jest zdolna do sygnalizowania komórce terapeutycznej zniszczenie, związanej z receptorem komórki zainfekowanej przez HIV. W korzystnym wykonaniu obydwu aspektów fragment CD4 stanowią aminokwasy 1-394 z CD4 lub aminokwasy 1-200 z CD4; fragment CD4 oddzielony jest od części wewnątrzkomórkowej przezbłonową domeną pokazaną na fig. 26 lub przez zawiasę, domeny CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG 1 pokazaną na fig. 25;receptor obejmuje część przezbłonową CD7;receptor obejmuje część przezbłonową CD5; receptor obejmuje część przezbłonową CD34; fragment CD4 oddzielony jest od błony komórki terapeutycznej jedną lub więcej białkowymi α-helisami; fragment CD4 oddzielony jest od błony komórki terapeutycznej o co najmniej 48A lub o co najmniej 72A; wewnątrzkomórkowa część przenoszącej sygnał części białka receptora komórki T (npζ, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc; a komórka terapeutyczna wybrana jest z grupy obejmującej: (a) limfocyty T; (b) cytotoksyczne limfocyty T; (c) naturalne komórki zabi- 8 180 066 jacze; (d) neutrofile; (e) granulocyty; (f) makrofagi; (g) komórki tuczne; (h) komórki HeLa; oraz (i) embrionalne komórki macierzyste układu krwionośnego. W innych wykonaniach wynalazek ujawnia DNA kodujące chimeryczny receptor według wynalazku; oraz wektora zawierającego ten DNA chimerycznego receptora. Jakkolwiek konkretne rozwiązanie według wynalazku stanowi chimera pomiędzy CD4 i ζ , to w ujawnionych celach wykorzystać można dowolny łańcuch receptora o działaniu podobnym do tych cząsteczek, np. w granulocytach lub limfocytach. Do wyróżniających cech pożądanej wyzwalającej cząsteczki komórki odpornościowej należy zdolność do autonomicznej ekspresji (jako pojedynczego łańcucha), zdolność do fuzji z pozakomórkową domeną CD4, tak że powstała chimera występuje na powierzchni komórki terapeutycznej, oraz zdolność do inicjowania komórkowych programów efektorowych w wyniku agregacji po napotkaniu docelowego ligandu. Obecnie najdogodniejszym sposobem dostarczania chimer do komórek układu odporności jest pewnego rodzaju terapia genowa. Jednakże w wyniku odtworzenia komórek układu odpornościowego z chimerycznymi receptorami poprzez zmieszanie komórek z odpowiednio rozpuszczonym, oczyszczonym białkiem chimerycznym, może również doprowadzić do powstania skonstruowanej populacji komórek, zdolnych do rozpoznawania celów zainfekowanych przez HIV. Podobne podejścia wykorzystano np. do wprowadzania cząsteczki CD4 do erytrocytów w celach terapeutycznych. W takim przypadku skonstruowana populacja komórek nie powinna być zdolna do samoodnawiania się. Ujawnienie dotyczy funkcyjnych i uproszczonych chimer pomiędzy fragmentami CD4 i receptorem komórki T, receptorem komórki B i podjednostkami receptora FC, które są zdolne do ukierunkowania komórek odpornościowych, tak, aby rozpoznawały one i dokonywały lizy komórek zainfekowanych przez HTV. Sposób kierowania reakcją komórkową u ssaków obejmuje podawanie ssakowi skutecznej ilości terapeutycznych komórek (np. cytotoksycznych limfocytów T), które to komórki są zdolne do rozpoznawania i niszczenia komórki zainfekowanej przez HIV. Przedmiotem ujawnienia są ponadto chimeryczne białka receptorowe, które kierują cytotoksyczne limfocyty T, tak, że rozpoznają one i dokonują lizy komórek zainfekowanych przez HIV, komórki gospodarza transformowane wektorem zawierającym chimeryczne receptory, oraz przeciwciała skierowane przeciw chimerycznym receptorom. Te i inne warianty nie ograniczające zakresu wynalazku staną się oczywiste dla specjalistów po zapoznaniu się z poniższym szczegółowym opisem wynalazku. W poniższym szczegółowym opisie wprowadzone będą odnośniki do różnych metodyk znanych specjalistom biologii molekularnej i immunologii. Publikacje i inne materiały, w których przedstawiono takie znane metodyki, do których podano odnośniki, wprowadza się w całości jako źródła literaturowe. Do standardowych prac podających ogólne zasady technologii zrekombinowanego DNA, należą: Watson i inni, Molecular Eiology of the Gene, Vol.I i II, Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., wydawca, Menlo Park, CA (1987); Darnell i inni, Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Wydawca, New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, wydawcy, New York, N.Y. (1985); Old i inni, Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2 wydanie, University of California Press, Wydawca, Berkeley, CA (1981); Maniatis i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, wydawca, Cold Spring Harbor, NY (1989); oraz Ausubel i inni, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989). Definicje „Klonowanie” oznacza zastosowanie in vitro technik rekombinacji do wstawiania określonego genu lub innej sekwencji DNA do cząsteczki wektora. „cDNA” oznacza komplementarny DNA lub kopia DNA, wytworzony z matrycy RNA w wyniku działania zależnej od RNA polimerazy DNA (odwrotnej transkryptazy). I tak „klon CDNA” oznacza dwuniciową sekwencję DNA komplementarną z odpowiednią cząsteczką RNA, przenoszony w wektorze klonowania. 180 066 9 „Biblioteka cDNA” oznacza zbiór zrekombinowanych cząsteczek DNA zawierających inserty cDNA, które zawierają kopie DNA z mRNA powstającego w wyniku ekspresji w komórce przy wytwarzaniu biblioteki cDNA. Taką bibliotekę cDNA wytworzyć można sposobami znanymi specjalistom, opisanymi np. przez Ausubela i innych, supra, oraz Maniatisa i innych, supra. Ogólnie, najpierw wydziela się RNA z komórek organizmu, którego genom jest pożądany do klonowania określonego genu. Według wynalazku korzystnie wykorzystuje się w tym celu linie komórek limfocytowych ssaków, zwłaszcza ludzi. Obecnie korzystnym wektorem jest szczep wirusa krowianki WR. „Wektor” oznacza cząsteczkę DNA pochodzącą np. z plazmidu, bakteriofaga albo wirusa ssaka lub owada, w którym wykonać można insercję lub klonowanie fragmentów DNA. Wektor będzie zawierać jedno lub więcej unikatowych miejsc restrykcyjnych oraz może być zdolny do autonomicznej replikacji w określonym gospodarzu lub organizmie nośnym, tak że klonowana sekwencja może być reprodukowana. „Wektor ekspresji DNA” oznacza dowolny autonomiczny element zdolny do kierowania syntezą zrekombinowanego peptydu. Takie wektory ekspresji DNA obejmują bakteryjne plazmidy i fagi, a także plazmidy i wirusy ssaków i owadów. „Zasadniczo czysty” odnosi się do związku, np. białka, polipeptydu lub przeciwciała, zasadniczo wolnego od składników, które z natury towarzyszą mu. Ogólnie związek jest zasadniczo czysty, gdy co najmniej 60%, jeszcze korzystniej co najmniej 75%, a najkorzystniej co najmniej 90% całości materiału w próbce stanowi właściwy związek. Czystość można oznaczyć odpowiednim sposobem, np. na drodze chromatografii kolumnowej, elektroforezy na żelu poliakrylamidowym albo analizy HPLC. W odniesieniu do kwasów nukleinowych „zasadniczo czysty” oznacza sekwencję, segment lub fragment kwasu nukleinowego, który bezpośrednio nie sąsiaduje (np. nie jest kowalencyjnie połączony) z obydwoma sekwencjami kodującymi, z którymi bezpośrednio sąsiaduje (np. z jedną na końcu 5', a z drugą na końcu 3 w występującym w naturze genomie organizmu, z którego pochodzi właściwy DNA według wynalazku. Określenie „fragment” cząsteczki, taki jak dowolna z sekwencji cDNA według wynalazku, odnosi się do dowolnego z sąsiadujących podzbiorów nukleotydowych cząsteczki. „Analog” cząsteczki oznacza nienaturalną cząsteczkę zasadniczo podobną do całej cząsteczki lub jej fragmentu. Cząsteczka jest „zasadniczo podobna” do innej cząsteczki, gdy sekwencje aminokwasów w obydwu cząsteczkach są zasadniczo takie same. Zasadniczo podobne cząsteczki aminokwasów będą wykazywać podobne działanie biologiczne. W użytym znaczeniu cząsteczka stanowi „chemiczną pochodną” innej cząsteczki, gdy zawiera grupy chemiczne, nie stanowiące zazwyczaj części cząsteczki. Takie grupy mogą zwiększać rozpuszczalność, absorpcję, okres półtrwania biologicznego cząsteczki itp. Grupy te mogą także obniżać toksyczność cząsteczki, eliminować lub osłabiać jakiekolwiek niepożądane działanie uboczne cząsteczki itp. Grupy zdolne do wywierania takiego wpływu ujawniono np. w publikacji Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 wyd., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980). Określenie „funkcyjna pochodna” genu chimery receptorowej według wynalazku obejmuje „fragmenty” lub „analogi” genu, „zasadniczo podobne” pod względem sekwencji niikleotydowej i kodujące cząsteczkę o podobnej aktywności jak chimera receptora z komórki T, komórki B lub Fc. Najkorzystniej pochodna wykazuje 90%, szczególnie korzystnie 70%, a korzystnie 40% aktywności chimery receptora typu dzikiego. Aktywność pochodnej funkcyjnego receptora chimerycznego obejmuje specyficzne wiązanie (z pozakomórkowączęścią CD4) z komórką zainfekowaną przez HIV oraz wynikające stąd niszczenie komórki; dodatkowo chimeryczny receptor nie nadaje komórce przenoszącej receptor podatności na infekcję HIV. Aktywność chimerycznego receptora można zbadać, wykonując np. dowolny z testów opisanych poniżej. Przeprowadzić można rekombinację sekwencji DNA kodującej chimerę receptora CD4 według wynalazku, albo jej funkcyjnych pochodnych, z DNA wektora, z wykorzystaniem znanych technik, z wykorzystaniem tępo zakończonych lub lepko zakończonych końców do ligowania, trawienia enzymem restrykcyjnym w celu uzyskania odpowiednich końców, wypełniania w odpowiedni sposób lepkich końców, obróbki fosfatazą alkaliczną, tak aby zapobiec niepożąda- 10 180 066 nemu połączeniu, oraz ligowania z odpowiednimi ligazami. Techniki takich manipulacji ujawniono w pracy Maniatisa i innych, supra. Są one dobrze znane specjalistom. Cząsteczka kwasu nukleinowego, np. DNA, je s t,.zdolna do ekspresji” polipeptydu, jeśli zawiera sekwencje nukleotydowe, które zawierają informację regulującą transkrypcję i translację, a sekwencje takie są „operacyjnie połączone” z sekwencjami nukleotydowymi, które kodują polipeptyd. Operacyjne połączenie stanowi połączenie, w którym regulujące sekwencje DNA oraz sekwencja DNA, która ma brać udział w ekspresji, połączone są w taki sposób, aby umożliwić ekspresję genu. Dokładny charakter regionów regulujących niezbędnych do zapewnienia ekspresji genu może być odmienny dla różnych organizmów, z tym że zazwyczaj obejmuje on region promotora, który w prokariotach zawiera zarówno promotor (który kieruje inicjowaniem transkrypcji RNA) jak i sekwencje DNA które, po transkrypcji w RNA, będą sygnalizować inicjowanie syntezy białka. Regiony takie zazwyczaj obejmują te 5'-nie kodujące sekwencje uczestniczące w inicjowaniu transkrypcji i translacji, takie jak sekwencja TATA, sekwencja czapeczkowa, sekwencja CAAT itp. W razie potrzeby nie kodujący region 3' względem sekwencji kodującej gen białka otrzymać można sposobami opisanymi powyżej. Region ten można zachować z uwagi na jego sekwencje regulujące terminację transkrypcji, np. terminację i poliadenylowanie. I tak, zachowując region 3' sąsiadujący w naturze z sekwencją DNA kodującą białko uzyskać można sygnały terminacji transkrypcji. Gdy sygnały terminacji transkrypcji nie działają zadowalająco w komórce gospodarza, w której zachodzi ekspresja, to można go zamienić na region funkcyjny 3' w komórce gospodarza. Dwie sekwencje DNA (np. sekwencja regionu promotora i sekwencja kodująca chimerę receptora CD4) są operacyjnie połączone, jeśli charakter połączenia między dwiema sekwencjami (1) nie spowoduje wprowadzenia mutacji przesuwającej ramkę, (2) nie zakłóca zdolności sekwencji regionu promotora do kierowania transkrypcją sekwencji genu chimery receptora albo (3) nie zakłóca możliwości transkrypcji sekwencji genu chimery receptora przez sekwencję regionu promotora. Region promotora powinien być operacyjnie połączony z sekwencją DNA, jeśli promotor ma być zdolny do skutecznej transkrypcji sekwencji DNA. Dlatego też, aby nastąpiła ekspresja białka, niezbędne sątranskrypcyjne i translacyjne sygnały rozpoznawane przez odpowiedniego gospodarza. Wynalazek obejmuje ekspresję białka chimery receptora CD4 (lub jego funkcyjnej pochodnej) w komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych, z tym że ekspresja w eukariotach (a zwłaszcza w ludzkich limfocytach) jest korzystna. Przeciwciała według wynalazku wytwarzać można dowolnym z szeregu sposobów. Tak np. komórki, w których zachodzi ekspresja białka chimery receptora CD4 lub jego fimkcyjnej pochodnej, można wprowadzić do zwierzęcia, w celu wywołania u niego wytwarzania surowic zawierających poliklonalne przeciwciała zdolne do wiązania się z chimerą. Zgodnie z korzystnym sposobem, przeciwciała według wynalazku stanowią przeciwciała monoklonalne. Takie monoklonalne przeciwciała wytwarzać można techniką z hybrydomą (Kohler i inni, Nature 256:495 (1975); Kohler i inni, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler i inni, Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling i inni, w: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., str. 563-684 (1981)). Ogólnie procedury takie obejmują immunizację zwierzęcia antygenem chimery receptora CD4. Wydziela się limfocyty śledzionowe zwierzęcia i przeprowadza się ich fuzję z odpowiednią linią komórek szpiczaka. Według wynalazku zastosować można dowolną odpowiednią linię komórek szpiczaka. Po fuzji uzyskane komórki hybrydomy selektywnie utrzymuje się w ośrodku HAT, po czym klonuje się je metodą ograniczonego rozcieńczania, którą opisali Wand i inni (Gastroenterology 80:225-232 (1981). Komórki hybrydomy uzyskane w wyniku takiej selekcji bada się następnie w celu zidentyfikowania klonów, które wydzielają przeciwciała zdolne do wiązania chimery. Przeciwciała według wynalazku mogą również stanowić przeciwciała poliklonalne albo, korzystnie, poliklonalne przeciwciała specyficzne względem regionu. 180 066 11 Przeciwciała przeciw chimerze receptora CD4 według wynalazku można zastosować do monitorowania ilości chimery receptora (lub komórek przenoszących chimerę receptora) u pacjenta. Takie przeciwciała nadają się do stosowania w standardowym teście immunodiagnostycznym, znanym specjalistom, takim jak test immunometryczny lub „sandwiczowy”, taki jak test sandwiczowy współbieżny, sandwiczowy przeciwbieżny lub sandwiczowy równoczesny. Przeciwciała stosować można w wielu różnych kombinacjach, co mogą łatwo ustalić specjaliści bez niepotrzebnego eksperymentowania, tak aby przeprowadzić testy immunologiczne o dopuszczalnej specyficzności, czułości i dokładności. Do standardowych prac podających ogólne zasady immunologii należą: Roitt, Essential Immunology, 6 wyd., Blackwell Scientific Publications, wydawca, Oxford (1988); Kimball, Introduction to Immunology, 2 wyd., Macmillan Publishing Co., wydawca, New York (1986); Roitt i inni, Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., wydawca, London, (1985); Campbell, „Monoclonal Antibody Technology”, w Burdon i inni, redakcja Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Volume 13, Elsevier, wydawca, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, wydawca, New York (1982); oraz Kennett i inni, redakcja, Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, wydawca, New York (1980). Określenie „detekcja” obejmuje oznaczanie obecności lub braku substancji, albo ilościowe oznaczanie substancji. Określenie to odnosi się do zastosowania materiałów, kompozycji i sposobów według wynalazku, w oznaczeniach jakościowych i ilościowych. Przeciwciała i zasadniczo oczyszczony antygen według wynalazku idealnie nadają się do wytwarzania zestawu. Taki zestaw może zawierać opakowanie podzielone na przedziały, w których umocowane są pojemniki, takie jak fiolki, probówki itp., z których każdy zawiera odrębne składniki do wykonywania testu. Istnieje wiele rodzajów testów, które można wykonywać z wykorzystaniem zestawów, takie jak np. testy konkurencyjne i nie konkurencyjne. Do typowych przykładowych testów, które można przeprowadzać z wykorzystaniem przeciwciał według wynalazku, należą testy radioimmunologiczne (RIA), immunotesty enzymatyczne (EIA), enzymatyczne testy immunoadsorpcyjne (ELISA) oraz testy immunometryczne lub sandwiczowe. Określenie „test immunometryczny” lub „immunologiczny test sandwiczowy” obejmują test sandwiczowy współbieżny, sandwiczowy przeciwbieżny lub sandwiczowy równoczesny. Określenia te są dobrze znane specjalistom. Dla specjalistów zrozumiałe jest również, że przeciwciała według wynalazku mogą być przydatne również w innych odmianach i formach testów, znanych obecnie lub opracowanych w przyszłości. Testy takie uważa się za objęte zakresem wynalazku. Określenie „specyficznie rozpoznaje i wiąże” oznacza, że przeciwciało rozpoznaje i wiąże polipeptyd chimery receptora, ale zasadniczo nie rozpoznaje i nie wiąże innych niespokrewnionych cząsteczek w próbce, np. w próbce biologicznej. „Komórka terapeutyczna” oznacza komórkę, która została transformowana chimerą receptora CD4 według wynalazku, tak że jest zdolna do rozpoznawania i niszczenia komórki zainfekowanej przez HTV; korzystnie takie komórki terapeutyczne stanowiąkomórki układu krwiotwórczego. Określenie „pozakomórkowy” oznacza, że co najmniej część cząsteczki wystaje z powierzchni komórki. Określenie ’’wewnątrzkomórkowy” oznacza, że co najmniej część cząsteczki wystaje do cytoplazmy komórki terapeutycznej. Określenie „przezbłonowy” oznacza, że co najmniej część cząsteczki przechodzi przez błonę komórkową. W użytym znaczeniu określenia „część pozakomórkowa”, „część wewnątrzkomórkowa” i „część przezbłonowa” mogą obejmować flankujące sekwencje aminokwasów, które wystają do sąsiednich przedziałów komórki. „Oligomeryzowanie” oznacza tworzenie kompleksu z innymi białkami z utworzeniem dimerów, trimerów, tetramerów i innych oligomerów wyższego rzędu. Takie oligomery mogą być homooligomerami lub heterooligomerami. „Część oligomeryzująca” stanowi ten region cząsteczki, który kieruje tworzeniem kompleksu (czyli oligomeru). 12 180 066 Określenie „cytolityczny” oznacza zdolny do niszczenia komórki (np. komórki zainfekowanej przez HIV) lub zdolny do niszczenia czynnika infekcyjnego (np. wirusa HIV). „Wirus upośledzenia odporności” oznacza retrowirusa, który w formie dzikiej jest zdolny do infekowania komórek T4 gospodarza spośród naczelnych i wykazuje wirusową morfogenezę i morfologię charakterystyczną dla podrodziny wirusów wolno działających. Określenie to obejmuje bez żadnych ograniczeń wszystkie warianty HIV i SIV, w tym HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SlVman, SIVmand i SIVcpz. „Niezależny od MHC” oznacza, że cytolityczna reakcja komórkowa nie wymaga obecności antygenu MHC klasy II na powierzchni docelowej komórki. Określenie „funkcyjna pochodna przenosząca sygnał cytolityczny” oznacza funkcyjnąpochodną (określoną powyżej), która jest zdolna do ukierunkowania co najmniej 40%, jeszcze korzystniej co najmniej 70%, a najkorzystniej co najmniej 90% aktywności biologicznej cząsteczki typu dzikiego. W użytym znaczeniu „funkcyjna pochodna przenosząca sygnał cytolityczny” może działać przez bezpośrednie sygnalizowanie komórce terapeutycznej, aby zniszczyła ona związany z receptorem czynnik lub komórkę (np. w przypadku wewnątrzkomórkowej części chimerycznego receptora), albo też może działać bezpośrednio, inicjując oligomeryzację z białkami przenoszącymi sygnał cytolityczny w komórce terapeutycznej (np. w przypadku domeny przezbłonowej). Skuteczność takich pochodnych można określać wykonując np. testy in vitro opisane poniżej. Określenie „funkcyjna pochodna wiążąca kopertę HIV oznacza funkcyjną pochodną (określoną powyżej), która jest zdolna do wiązania dowolnego białka kopertowego HIV. Funkcyjne pochodne można identyfikować, wykonując np. testy in vitro opisane poniżej. Podawanie terapeutyczne Transformowane komórki według wynalazku można stosować do zwalczania wirusa upośledzenia odporności. Obecne sposoby podawania takich transformowanych komórek obejmują immunoterapię adoptywną lub terapię z przenoszeniem komórek. Sposoby te umożliwiają zawrócenie transformowanych komórek układu odpornościowego do prądu krwi. Rosenberg, Scientific American 62 (maj 1990); Rosenberg i inni, The New England Journal of Medicine 323 (9):570 (1990). Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać dowolnemu zwierzęciu, w przypadku którego uzyskać można korzystne działanie związków według wynalazku. Do ssaków tych należą przede wszystkim ludzie, choć wynalazek nie ogranicza się do takiego rozwiązania. Opis szczegółowy Najpierw opisane zostaną rysunki. Na figurze 1A pokazano sekwencję aminokwasów wokół miejsca fuzji pomiędzy CD4 (reszty 1-369) i różnymi łańcuchami receptorów. Sekwencja podkreślona oznacza pozycję aminokwasów kodowanąmiejscu BamHI stosowanym w konstrukcji fuzji. Początek domeny przezbłonowej zaznaczono pionowym słupkiem. Sekwencja jest identyczna z sekwencją na końcu aminowym, ale różni się na końcu karboksylowym (Jin i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)). Na fig. 1B przedstawiono wyniki przepływowej analizy cytometrycznej powierzchniowej ekspresji CD4, CD4:ζ CD4:y i CD4: η w komórkach CV1. Komórki zainfekowano ζ wirusem, w którym zachodzi ekspresja chimery CD4 lub CD16p, inkubowano przez 9 godzin w 37°C i zabarwiono skoniugowanym z fikoerytryną anty-CD4 MAb Leu3 A. Na figurze 2 pokazano powierzchniową ekspresję CD16TM po współinfekcji samym CD16TM(gęste kropki) lub po współinfekcji wirusem, w którym zachodzi ekspresja CD4:y (kreski) lub CD4:ζ (linia ciągła). Rzadkie kropki - komórki zainfekowane samym CD4: ζ zabarwione 3G8 (Fleit i inni, Proc, Natl. Acad. Sei. USA 79:3275-3279 (1982)) (anty-CD16 MAb). Na figurze 3 pokazano powierzchniową ekspresję CD16TMpo współinfekcji wirusami, w których zachodzi ekspresja CD 16TMi po chimerachζ: CD4: ζ (grupa linia), CD4:ζ C11G (linia ciągła); CD4: ζ (linia przerywana); CD4: ζ Cl 1G/D15G (gęste kropki); bez współinfekcji (sam CD16TM, rzadkie kropki). Komórki inkubowano z anty-CD16 MAb 3G8 i skoniugowanymi z fi- 180 066 13 koerytryną kozimi przeciwciałami Fab'2 względem mysiego IgG. Poziom ekspresji chimery ζ był zasadniczo identyczny dla różnych analizowanych mutantów, a współinfekcja komórek wirusami, w których zachodzi ekspresja CD 16XMi chimery ζ nie zmienia zasadniczo powierzchniowej ekspresji chimery. Na figurach 4A-D pokazano zwiększony poziom wewnątrzkomórkowy wolnych jonów wapniowych po sieciowaniu mutantowej chimery ζ w linii komórek T. Komórki Jurkata E6 (Weiss i inni, J. Immunol. 133:123-128 (1984) zainfekowano zrekombinowanymi wirusami krowianki i zanalizowano metodą cytometrii przepływowej. Wyniki przedstawiono dla wybranej populacji CD4+, tak że analizowano tylko komórki, w których zachodzi ekspresja odpowiedniego białka chimerycznego. Średni stosunek fioletowej do błękitnej fluorescencji Indo-1 odzwierciedla wewnątrzkomórkowe stężenie wolnego wapnia w populacji jako całości, a procent odpowiadających komórek odpowiada udziałowi komórek, w których nastąpiło przekroczenie ustalonego stosunku progowego (należy zaznaczyć, że 10% komórek nie poddanych obróbce daje wynik dodatni). Na fig. 4A i fig. 4B pokazano komórki Jurkata, w których zachodzi ekspresja CD4: ζ (linia ciągła) lub CD16:ζ (linia przerywana), eksponowane na anty-CD4 Mkb Leu3a (koniugat fikoerytryny), a następnie sieciowane kozim przeciwciałem względem mysiego IgG. Linia kropkowana pokazuje reakcję nie infekowanych komórek na anty-CD3 MAb OKT3. Na fig. 4C i 4D pokazano komórki Jurkata, w których zachodzi ekspresja CD4: ζD 15G (linia ciągła); CD4:ζ C11G/D15G (kreski); lub CD4: ζ C 11G (kropki), które poddano obróbce i zanalizowano jak na fig. 4A i 4B. Na figurach 5A-C pokazano, że receptory CD4: ζ, CD4: η, CD4:y umożliwiającytolitycznym limfocytom T (CTL) zabijanie celów w których zachodzi ekspresja HIV-1 gp 120/41.Fig. 5A: pełne kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4: ζ, inkubowane z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20/41; puste kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja Οϋ4:ζ, inkubowane z nie zainfekowanymi komórkami HeLa; pełne kwadraty, nie zainfekowane CTL inkubowane z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41; puste kwadraty, nie zainfekowane CTL inkubowane z nie zainfekowanymi komórkami HeLa. fig. 5B: pełne kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4: η, inkubowane z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20/41; puste kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4:y, inkubowane z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20/41; puste kwadraty, CTL, w których zachodzi ekspresja podwójnego mutanta C 11G/D15G chimery CD4:ζ, inkubowane z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20/41. fig. 5C: Przepływowa analiza cytometryczna ekspresji CD4 w CTL, pokazanej na fig. 5B. Aby skorygować stosunek celu do efektora, procent komórek, w których zachodzi ekspresja chimery CD4, oznaczono odejmując skalowaną (nie zainfekowaną) populację przez nakładania histogramów; w celach porównawczych na rysunku nie zainfekowanym komórkom przypisano arbitralnie wielkość progową, która daje w wyniku w przybliżeniu taką samą frakcję dodatnią jak w przypadku innych populacji komórek przy odejmowaniu histogramów. Na figurach 6A-B pokazano specyficzność CD4-ukierunkowanej cytolizy. Fig. 6A: pełne kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4:ζ, inkubowane z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja CD 16P1; puste kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4 inkubowanego z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20; pełne kwadraty, CTL, w których zachodzi ekpresja CD16: ζ inkubowanego z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41; puste kwadraty, CTL, w których zachodzi ekspresja CD 16PI inkubowanego z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41. Fig. 6B: pełne kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4: ζni kubowanego z komórkami Raji (MHC klasa II+); puste kółka, nie zainfekowane komórki CTL inkubowane z komórkami RJ 2.2.5 (MHC klasa I I mutanta Raji); pełne kwadraty, nie zainfekowane CTL inkubowane z komórkami Raji (MHC klasa II+); puste kwadraty, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4: ζ inkubowane z RJ2.2.5 (MHC klasa ΙΓ). Oś rzędnych rozszerzono. Na figurach 7A-B pokazano charakterystykę chimerycznego receptora CD 16: ζ. Fig. 7A przedstawia schematycznie diagram białka fuzyjnego CD 16: ζ. Pozakomórkową część połączo- 14 180 066 nej z fosfatydyloinozytolem formy monomerycznego CD 16 połączono z dimerycznym ζ tuż poza przezbłonową domeną. Sekwencję białkową w połączeniu fuzyjnym pokazano na dole. Na fig. 7B pokazano przepływową analizę cytometrycznąmobilizacji białkowej po sieciowaniu chimery CD 16: ζ w TCR-dodatniej lub TCR-ujemnej linii komórek. Pokazano średni stosunek fluorescencji fioletowej do błękitnej (miara względnego stężenia jonów wapniowych) w populacjach komórek traktowanych przeciwciałami w czasie 0. Pełne kwadraty, reakcja komórek Jurkata na anty-CD3 MAb OKT3; pełne trójkąty, reakcja CD 16:ζ na anty-CD 16 MAb 3G8 usieciowane z mutantem REX33A TCR"; puste kwadraty, reakcja na CD 16: ζ usieciowany w linii mutantowej Jurkata TCR- JRT3 ,T3.5; puste trójkąty, reakcja na CD 16 :ζ usieciowane w komórkach Jurkata; krzyże, reakcja na niechimeryczne CD 16 w komórkach Jurkata; kropki, reakcja na niechimeryczne CD 16 w linii komórek REX33A TCR'. Na figurach 8A-B pokazano analizę delecji cytolitycznego potencjału. Na fig. SA pokazano lokalizacje końcowych punktów delecji ζ W tym przypadku, podobnie jak we wszystkich innych, mutacje w ζ są przedstawione w konwencji reszta wyjściowa-lokalizacja-reszta mutantowa, tak że np. D66* oznacza zastąpienie Asp-66 przez kodon terminacji. Na fig. 5B pokazano wyniki testu cytolizy CD 16: ζ bez delecji oraz skokowych delecji ζ. Komórki hybrydomy, w których zachodzi ekspresja powierzchniowych przeciwciał do CD 16 obciążono 5'Cr i inkubowano ze zwiększającąsię liczbą ludzkich cytolitycznych limfocytów (CTL) zainfekowanych rekombinantami krowianki, w których zachodzi ekspresja chimery CD16: ζ Procent uwolnionego 51Cr wykreśla się w funkcji stosunku komórek efektorowych (CTL) do docelowych (hybrydoma) (e/t). Pełne kółka, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja CDI6: ζ (mfi 18.7); pełne kwadraty, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja CD 16: ζ Asp66* (mfi 940.2); puste kwadraty, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja CD16:ζ Glu60* (mfi 16.0); puste kółka, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja CD 16:ζTyr51* (mfi 17.4); pełne trójkąty, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja CD16:ζ Phe34* (mfi 17.8); oraz puste trójkąty, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja niechimerycznego CD 16 (mfi 591). Jakkolwiek w tych eksperymentach ekspresja CD 16: ζ Asp66* nie była dopasowana do ekspresji innych białek fuzyjnych, cytoliza przez komórki, w których zachodzi ekspresja CD 16: ζ w równoważnych poziomach w tym samym eksperymencie dała wyniki zasadniczo identyczne do uzyskiwanych w przypadku komórek, w których zachodzi ekspresja CD16: ζ Asp66. Na figurach 9A-D pokazano, że eliminacja potencjału dla oddziaływań przezbłonowych ujawnia krótki segment ζ zdolny do uczestniczenia w cytolizie. Fig. 9A przedstawia schematyczny diagram monomerycznych chimer dwudzielnych i trójdzielnych. Na górze znajduje się konstrukt CD 16: ζ ucięty przy reszcie 65, nie zawierający przezbłonowych reszt Cys i Asp. Poniżej znajdują się konstrukty CD 16: CD5:ζi CD 16: CD7: ζ oraz zbliżone elementy kontrolne. Sekwencje peptydowe wewnątrzkomórkowych domen pokazano poniżej. Na fig. 9B przedstawiono cytolityczną aktywność delecyjnych mutantów monomerycznej chimery. Cytolityczną aktywność komórek, w których zachodzi ekspresja CD16: ζ (pełne kółka; mfi 495) porównano z aktywnością komórek, w których zachodzi ekspresja CD 16:ζ Asp66* (pełne kwadraty; mfi 527) lub mutantów CD 16:ζ Cys11Gly/Asp 15Gly/Asp66* (puste kwadraty; mfi 338) oraz CD16: ζ Cys 11Gly/Asp 15Gly/Glu60* (pełne trójkąty; mfi 259). Na fig. 9C przedstawiono cytolityczną aktywność z udziałem trójdzielnych białek fuzyjnych. Pełne trójkąty, CD16: ζ Asp66*; puste kwadraty, CD 16:5: ζ (48-65); pełne kwadraty CD16:7: ζ (48-65); puste trójkąty, CD16:7:ζ (48-59); puste kółka, CD16:5; pełne kółka, CD16:7. Na fig. 9D przedstawiono mobilizację wapnia przez mutantowe i trójdzielne chimery w TCR-ujemnej mutantowej linii komórek Jurkata JRT3.T3.5. Puste kółka, reakcja komórek, w których zachodzi ekspresja dimerycznego CD16: ζ Asp66*; pełne kwadraty, reakcja komórek, w których zachodzi ekspresja CD16:ζ Cys 11Gly/Asp 15Gly/Asp66*; puste kwadraty, reakcja komórek, w których zachodzi ekspresja CD16 ζCys 11Gly/Asp 15Gly/Glu60*; pełne trójkąty, reakcja komórek, w których zachodzi ekspresja CD 16: 7: ζ (48-65); oraz puste trójkąty, reakcja komórek, w których zachodzi ekspresja CD16: ζ (48-59). 180 066 15 Na figurach 1OA-F pokazano udział poszczególnych aminokwasów w aktywności 18-resztowego motywu przenoszącego sygnał cytolityczny. Na fig. 10A i 10 B pokazano cytolityczną aktywność, a na fig.10C pokazano mobilizację jonów wapniowych z udziałem chimer przenoszących mutacje punktowe w pobliżu tyrozyny na końcu karboksylowym (Y62). Na fig. 10A i 10B przedstawiono dane zebrane dla komórek, w których zachodzi odpowiednio ekspresja małych i dużych ilości białek fuzyjnych CD16: ζ Identyczne symbole użyto w przedstawianiu wyników mobilizacji wapnia i testów cytolizy, przedstawiając je kodem jednoliterowym z prawej strony. Pełne kółka, komórki, w których zachodzi ekspresja CD 16: ζ (mfi in A, 21; B, 376); pełne kwadraty, komórki, w których zachodzi ekspresja CD16:7:ζ (48-65) (mfi A, 31; B, 82); puste kwadraty CD 16:7: ζ (48-65) Glu60Gln (mfi A, 33; B, 92), krzyże, CD 16:7: ζ (48-65)Asp63Asn (mfi A, 30; B, 74); pełne trójkąty, CD16:7:ζ (48-65)Tyr62Phe (mfi A, 24; B, 88); puste kółka, CD16:7: ζ (48-65)Glu61Gln (mfi A, 20; B, 62); oraz puste trójkąty, CD16:7: ζ (48-65)Tyr62Ser (mfi B, 64). Na fig. 1OD i 10E pokazano cytolityczną aktywność, a na fig. 10F pokazano mobilizację jonów wapniowych przez chimery przenoszących mutacje punktowe w pobliżu tyrozyny na końcu aminowym (Y51). Identyczne symbole użyto w przedstawianiu wyników mobilizacji wapnia i testów cytolizy, przedstawiając je z prawej strony. Pełne kółka, komórki, w których zachodzi ekspresja CDI 6 ζζ: (mfi w D, 21.2; w E, 672); pełne kwadraty, komórki, w których zachodzi ekspresja CD 16:7: (48-65) (mfi D, 31.3; E, 179); pełne trójkąty, CD16:7: ζ (48-65)Asn48Ser (mfi D, 22.4; E, 209); puste kwadraty, CD 16:7:ζ(48-65)Leu50Ser (mfi D, 25.0; E, 142); oraz puste trójkąty, CD16:7: ζ (48-65)Tyr51Phe (mfi D, 32.3; E, 294). Na figurach 11A-B pokazano ułożenie wewnętrznych powtórek ζ i porównano ich zdolność do podtrzymywania cytolizy. Fig. 11A przedstawia schematyczny diagram chimer utworzonych przez podział wewnątrzkomórkowej domeny ζ na 3 części oraz dołączenie ich do przezbłonowej domeny chimery CD 16:7. Sekwencje wewnątrzkomórkowych domen pokazano poniżej, ze wspólnymi resztami w ramkach, a zbliżone reszty zaznaczono gwiazdkami. Na fig. 11B pokazano zdolność cytolityczną 3 subdomenζ Pełne kółka, komórki, w których zachodzi ekspresja CD16:ζ (mfi 476); pełne kwadraty, CD16:7: ζ (33-65) (mfi 68); puste kwadraty, CD16: 7: ζ (71-104) (mfi 114); oraz pełne trójkąty, CD16: 7: ζ (104-138) (mfi 104). Na figurze 12 pokazano schematycznie diagram chimery CD 16: FcRyll. Na figurach 13A-B pokazano mobilizację wapnia po sieciowaniu chimer CD4:FcRyII i CD 16: FcRyll. Na fig. 13A pokazano stosunek fluorescencji fioletowej do błękitnej emitowanej przez komórki obciążone wrażliwym na wapń fluoroforem Indo-1 w funkcji czasu po sieciowaniu pozakomórkowej domeny CD 16 przeciwciałami. Na fig,13B pokazano wyniki podobnej analizy wzrostu stosunku fluorescencji fioletowej do błękitnej dla komórek przenoszących chimery CD4:FcRyII, po sieciowaniu przeciwciałami. Na figurach 14A-B pokazano wyniki testu cytolizy chimer CD4:FcRyII i CD 16: FcRyll. Na fig.14A pokazano procent 5ICr uwolnionego z komórek hybrydomy anty-CD16 (cel), gdy komórki były eksponowane na zwiększającą się liczbę cytotoksycznych limfocytów T, w których zachodzi ekspresja chimer CD 16: FcRyll (komórki efektorowe). Na fig. 14B pokazano wyniki podobnej analizy cytotoksyczności z udziałem chimer CD4:FcRyII w stosunku do komórek docelowych, w których zachodzi ekspresja glikoprotein kopertowych HIV. Na figurach 15A-E przedstawiono identyfikację reszt w ogonie FcRyll A, istotnych dla cytolizy. Fig. 15A przedstawia schematycznie diagram konstruktów delecyjnych. Na fig. 15B i 15C pokazano mobilizację wapnia i cytolizę karboksy-końcowe delecyjne warianty CD16: FcRyll A. Na fig. 15D i 15E pokazano mobilizację wapnia i cytolizę przez trójdzielne chimery przenoszące coraz mniejszą część końca aminowego wewnątrzkomórkowego ogona CDI 6: FcRyll A. Na figurze 16 (SEQ ID NO: 24) pokazano sekwencję aminokwasów białka 5 receptora CD3; sekwencje w ramkach przedstawiają korzystną część przenoszącą sygnał cytolityczny. Na figurze 17 (SEQ ID NO: 25) pokazano sekwencję aminokwasów białka receptorowego y T3; sekwencje w ramkach przedstawiają korzystną część przenoszącą sygnał cytolityczny. Na figurze 18 (SEQ ID NO: 26) pokazano sekwencję aminokwasów białka receptorowego m bl; sekwencje w ramkach przedstawiają korzystną część przenoszącą sygnał cytolityczny. 16 180 066 Na figurze 19 (SEQ ID NO: 27) pokazano sekwencję aminokwasów białka receptorowego B28; sekwencje w ramkach przedstawiają korzystną część przenoszącą sygnał cytolityczny. Na figurach 20A-E pokazano schematyczny diagram chimer CD4. Cząsteczkę „A” stanowi CD4 (D1-D4): Ig:CD7; cząsteczkę „B” stanowi CD4 (D1, D2): Ig:CD7; cząsteczkę „C” stanowi CD4 (D1-D4): Ig:CD7:ζ; cząsteczkę „D” stanowi CD4 (D l, D2): Ig:CD7: ζ ; a cząsteczkę „E” stanowi CD4:ζ Pozakomórkową domenę ludzkiej cząsteczki CD4 odpowiadającą aminokwasom 1-394 prekursora połączono poprzez miejsce BamHI z zawiasą, domeny CH1 i CH2 ludzkiego IgGl, w sposób opisany uprzednio (Zettlmeissl i inni, DNA Cell Biol. 9:347 (1990)), z tym że wersję cDNA sekwencji ludzkiego Igs zastosowano, aby umożliwić ekspresję w rekombinantach wirusa krowianki. Dwu-domenową wersję chimery CD4 stworzono przez wstawienie adaptora BamHI w unikatowe miejsce Nhel (odpowiadające aminokwasowi 200) w cDNA prekursora CD4. Sekwencje łączące się z błoną zawierały 22 reszty z pierwszego egzonu ludzkiego IgG 1, związanego z błoną, a następnie reszty 146-203 CD7. Aminokwasy 55-163 z ζ, służyły jako motyw spustowy czterodzielnych konstruktów (C i D). W czterodzielnych konstruktach zawierających łańcuch ζ wewnątrzkomórkową ekspresję ζ udokumentowano, stosując dostępne w handlu przeciwciała przeciw wewnątrzkomórkowej domenie (Coulter). Na figurze 21 pokazano cytolizę docelowych komórek, w których zachodzi ekspresja glikoproteiny kopertowej HIV-1 z udziałem cytotoksycznego klonu komórek T, WH3, w których zachodzi ekspresja różnych chimer pochodzących z CD4 jako cząsteczek efektorowych. W testach cytotoksyczności ludzką ograniczoną linię komórek CD8* CD4' HLA B44, WH3, utrzymywano w IMDM uzupełnionym 10% ludzkiej surowicy, jak to opisano powyżej. Komórki pobudzano y-napromieniowanymi (3000 rad), B44- przenoszącymi jednojądrowymi komórkami i fitohemaglutyniną(PRA) w stężeniu 1μ g/ml. Po pobudzaniu przez 1 dzień RPA rozcieńczono do 0,5 μg/ml dodając świeży ośrodek; po 3 dniach ośrodek całkowicie zmieniono. Komórki hodowano przez co najmniej 10 dni przed zastosowaniem w testach cytotoksyczności. Komórki zainfekowano odpowiednimi rekombinantami wirusów krowianki w sposób podany w opisie dla vPE16. Całość pozostawiono na 3-4 godziny w celu zajścia infekcji w pełnym ośrodku, po czym komórki zebrano przez odwirowanie ponownie zawieszono w stężeniu 1 x 1 07/ml. Próbkę 100 μl dodano do każdej studzienki płytki mikrotiter z dnem w kształcie litery U zawierającej 100 μl/studzienkę pełnego ośrodka i rozcieńczono kolejno dwukrotnie. Dwie studzienki dla każdej próbki nie zawierały limfocytów, aby umożliwić pomiar spontanicznego uwalniania chromu i całkowite wchłanianie chromu. Komórki docelowe, HeLapodlinia S3 (HeLa-S3, ATCC) zainfekowano jak wyżej na 10 cm szalkach w vPE16.106zainfekowanych komórek oddzielono w PBS i 1 mM EDTA, odwirowano i ponownie zawieszono w 100 μl 5'CR chromianu sodowego (1 mCi/ml w PBS) na 1 godzinę w 37° ζ po czym przemyto 3 razy PBS. 100 μl znaczonych komórek docelowych dodano do każdej studzienki. Płytkę mikrotiter odwirowano przy 750 x g przez 1 minutę i inkubowano przez 4 godziny w 37°C. Pod koniec okresu inkubacji, komórki w każdej studzience ponownie zawieszono przez łagodne pipetowanie, pobrano próbkę do oznaczenia całkowitego wprowadzonego zliczenia i płytkę mikrotiter odwirowano przy 750 x g przez 1 minutę. Próbki (100 μl) supematantu pobrano i zliczono w liczniku scyntylacyjnym promieniowania y. Stosunek efektor:cel skorygowano, uwzględniając procent komórek zainfekowanych, oznaczony metodą cytometrii przepływowej. Na figurze 22 pokazano replikację HIV-1 w transfekowanych liniach komórek. Linie komórek, w których zachodzi trwała ekspresja dzikiego typu CD4 różne rekombinantowe chimery założono w podlinii ludzkiej linii komórek embrionalnych nerki 293. Przygotowano bazowy izolat HTV-1 IIIB o mianie ~106 infekcyjnych cząstek/ml oznaczonym metodą rozcieńczania do punktu końcowego z zastosowaniem ludzkiej linii komórek T C8166 jako wskaźnika. Infekcje prowadzono w przybliżonym MOI 1 przez 8-12 godzin w 37°C. Następnego dnia komórki przemyto PBS 3 razy, trypsynizowano, wysiano na nowych szalkach pobrano próbki supematantów hodowli w celu oznaczenia miana p24 (dzień 0). Następnie w odstępach 3-4 dniowych zbierano supematanty hodowli komórek i przechowywano do oznaczania p24. Hodowle komórek uzupełniono świeżym ośrodkiem zawierającym higromycynę B w stężeniu 100 μg/ml. Analizę su- 180 066 17 pematantów hodowli przeprowadzono, stosując dostępny oparty na teście ELISA zestaw do oznaczania antygenu HIV-1 p24 (Coulter) zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta. Wyniki odnoszą się do dwóch niezależnych doświadczeń o podobnym czasie trwania. Na figurze 23 pokazano sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów domen D 1-D4 w CD4 (CD4 Bam). Na fierurze 24 pokazano sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów domen D1-D2 (CD4 Nhe). Na figurze 25 pokazano sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów zawiasy, CH2, domen CH3 ludzkiego IgGl (Igh23 Bam). Na figurze 26 pokazano sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów domeny przezbłonowej CD7 (TM7 Bam Mlu). Na figurze 27 pokazano sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów domeny wewnątrzkomórkowej ζ (Zeta Mlu Not). Na figurze 28 pokazano sekwencję DNA i główną sekwencję aminokwasów syntetycznej helisy a Przykład I Konstrukcja chimer ludzki IgGI. receptor Ludzkie sekwencje ciężkiego łańcucha IgG1 otrzymano przez połączenie sekwencji w domenie CH3 z fragmentem cDNA pochodzącym z końca 3' przezbłonowej formy przeciwciała mRNA. Fragment końca 3' otrzymano w polimerazowej reakcji łańcuchowej, stosując bibliotekę cDNA z migdałka jako substrat, oraz oligonukleotyd zawierające sekwencje: CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (SEQ ID NO: 7) oraz CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (SEQ ID NO:8), odpowiadające odpowiednio końcom 5' i 3' pożądanych fragmentów DNA. 5' oligo jest komplementarny z miejscem w domenie Ch I ludzkiego IgGl, a 3' oligo jest komplementarny miejscem przy 5' sekwencji kodujących domenę przenikającą błonę. Produkt PCR strawiono BstXI BamHI zligowano pomiędzy miejsca BstXI i BamHI półsyntetycznego genu przeciwciała IgGl przenoszącego zmienne i stałe regiony. Po insercji fragmentu BstXI do BamHI, zamplifikowane części konstruktu wstawiono w miejsce Smal w C h 3 poprzez restrykcyjną wymianę fragmentów, tak tylko jedna część pomiędzy miejscem Smal i 3' oligo pochodzi z reakcji PCR. W celu wytworzenia ludzkiego chimerycznego receptora Ig G l: , gen ciężkiego łańcucha kończący się w miejscu BamHI połączono z miejscem BamHI chimeryζ opisanej poniżej, tak że sekwencje przeciwciała utworzyły część pozakomórkową. Cytomeria przepływowa komórek COS transfekowanych plazmidem kodującym chimerę wykazała wysoki poziom ekspresji determinantów przeciwciała przy współtransfekcji plazmidu ekspresji kodującym cDNA lekkiego łańcucha, oraz nieznaczną ekspresję determinantów przeciwciała w nieobecności plazmidu ekspresji lekkiego łańcucha. Podobne chimery zawierający ludzki IgGl połączony zηlub y (patrz poniżej), lub z dowolną przenoszącą sygnał częścią białka receptora komórki T lub receptora Fc można skonstruować zasadniczo w sposób opisany powyżej, wykorzystując standardowe techniki biologii molekularnej. W celu utworzenia pojedynczej jednostki transkrypcyjnej, która mogłaby umożliwić ekspresję zarówno ciężkiego jak i lekkiego łańcucha z pojedynczego promotora, stworzono plazmid kodujący bi-cistronowy mRNA z ζ i kodujących ciężki i lekki łańcuch, oraz 5' nietranslatowaną częścią mRNA kodującego regulowane przez glukozę białko o 78 kD, określane jako grp78 lub BiP. Sekwencje grp78 uzyskano metodąPCR ludzkiego genomowego DNA, stosując startery zawierające sekwencje: CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (SEQ ID NO: 9) oraz CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEQ ID NO: 10) odpowiednio na końcach 5' i 3'. Polimerazowe reakcje łańcuchowe z tymi oligomerami przeprowadzono w obecności 10% dimetylosulfotlenku. Fragment uzyskany PCR strawiono Notl i Hin- 18 180 066 cII i wstawiono pomiędzy miejsca NotI i HpaI w dół od sekwencji kodujących ludzki IgG1. Sekwencje kodujące cDNA lekkiego łańcucha ludzkiego IgGKwstawiono następnie w dół od lidera grp78 wykorzystując miejsce HincII i inne miejsce w wektorze. Plazmid ekspresji uzyskany w wyniku tych manipulacji zawierał półsyntetyczny gen ciężkiego łańcucha, a następnie kolejno sekwencje lidera grp78, sekwencje k cDNA lekkiego łańcucha oraz sygnały poliadenylowania pochodzące z fragmentu DNA SV40. Transfekcja komórek COS plazmidem ekspresji zapewniła znacznie zwiększoną ekspresję determinantów ciężkiego łańcucha w porównaniu z transfekcją plazmidu kodującego tylko determinanty ciężkiego łańcucha. W celu stworzenia genu bicistronowego zawierającego chimerę ciężki łańcuch/receptor lekki łańcuch, sekwencje w górę ciężkiego łańcucha można zastąpić dowolnym opisanym chimerycznym genem ciężki łańcuch/receptor. P r z y k ł a d II Konstrukcja chimer receptora CD4 Ludzki cDNA ζ (Weissman i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9709-9713 (1988b) oraz y (Küster i inni, J. Biol. Chem. 265:6448-6452 (1990) wydzielono metodą polimerazowej reakcji łańcuchowej z bibliotek uzyskanych z linii komórek nowotworowych HPB-ALL (Aruffo i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987b)) oraz z ludzkich naturalnych komórek zabijaczy, podczas gdy cDNA (Jin i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990) wydzielono z biblioteki mysich tymocytów. ζ, η i y cDNA połączono z pozakomórkową domeną skonstruowanej formy CD4 zawierającej miejsce BamHI tuż w górę od domeny przechodzącej przez błonę (Aruffo i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987b); Zettlmeissl i inni, DNA Cell Biol. 9-347-353 (1990)), która była połączona z miejscem BamHI występującym naturalnie w ζ iηcDNA w podobnym miejscu kilka reszt w górę od domeny przechodzącej przez błonę (SEQ IN NOS: 1,3,4 i 6). W celu uzyskania białka fuzyjnego z y miejsce BamHI wstawiono do sekwencji w przybliżeniu w tym samym miejscu (fig. 1; SEQ ID NO: 2 i 5). Fuzje genowe wprowadzono do plazmidu ekspresji wirusa krowianki przenoszącego gen gpt E. coli jako marker selekcjonujący, oraz wstawiono do genomu szczepu krowianki W R na drodze homologicznej rekombinacji i selekcji względem wzrostu w kwasie mikofenolowym (Falkner i inni, J. Virol. 62:1849-1854 (1988); Boyle i inni, Gene 65:123-128 (1988)). Przepływowa analiza cytometryczna wykazała, że rekombinanty krowianki kierują obfitym wytwarzaniem białek fuzyjnych CD4: ζ i nd CD4: y na powierzchni komórki, podczas gdy ekspresja CD4: η jest znacząco słabsza (fig. IB). To ostatnie odkrycie jest zgodne z najnowszym doniesieniem, że transfekcja plazmidu ekspresji η cDNA w mysiej linii komórek hybrydomy zapewnia znacznie słabszą ekspresję niż transfekcja porównywalnego plazmidu ekspresji ζ (Clayton i inni, J. Exp. Med. 172:1243-1253 (1990)). Immunostrącanie komórek zainfekowanych rekombinantami krowianki potwierdziło, że białka fuzyjne tworzą kowalencyjne dimery w przeciwieństwie do występującego naturalnego antygenu CD4. Stwierdzono, że masy cząsteczkowe monomerycznych białek fuzyjnych CD4: ζ i CD4: y oraz natywnego CD4 wynoszą odpowiednio 63, 55 i 53 kD. Większe masy białek fuzyjnych w przybliżeniu odpowiadają większej długości części wewnątrzkomórkowych, przewyższających długość natywnej CD4 o 75 (CD4: Q lub 5 (CD4: y) reszt. P r z y k ł a d III Chimery CD4 mogą ulegać asocjacji z innymi łańcuchami receptora Ekspresję na powierzchni komórek formy makrofag/naturalna komórka zabijacz ludzkiego Fcy RIII (CDI 6tm) na transfektantach ułatwia się poprzez współtransfekcję z mysim (Kurosaki i inni, Nature 342:805-807 (1989)) lub ludzkim (Hibbs i inni, Science 246:1608-1611 (1989)) y, a także z ludzkim ζ (Lanier i inni, Nature 342:803-805 (1989)). Zgodnie z tymi doniesieniami ekspresja chimer również umożliwia powierzchniową ekspresję CD16t m po doprowadzeniu do komórki docelowej na drodze współtransfekcji lub współinfekcji zrekombinowanymi wirusami krowianki (fig. 2). Ułatwianie powierzchniowej ekspresji CD 16TMprzezę było znaczniejsze niż w przypadku y (fig. 2) w badanej linii komórek, natomiast natywny CD4 nie wzmacniał powierzchniowej ekspresji CD16TM. 180 066 19 P r z y k ł a d IV Mutanty Asp ζ nie współasocjują z receptorem PC W celu stworzenia chimer, które mogłyby nie asocjować z istniejącym antygenem lub receptorami Fc, wytworzono mutantowe białka fuzyjneζ, które nie zawierały reszt, wewnątrzbłonowej Asp i/lub wewnątrzbłonowej Cys. Cytometria przepływowa wykazała, że nie występuje znacząca różnica w intensywności ekspresji na powierzchni komórek w przypadku różnych chimer mutantowych w porównaniu z nie mutowanym prekursorem, a eksperymenty immunoprecypitacji wykazały, że całkowita ekspresja przez chimery przebiega podobnie. Zgodnie z oczekiwaniem, chimery mutantowe nie zawierające przezbłonowej reszty cysteiny nie tworzą dimerów z połączeniem disulfidowym. Dwie mutantowe chimery pozbawione Asp nie były zdolne do podtrzymywania powierzchniowej ekspresji CD16TM, a monomeryczne chimery nie zawierające Cys, ale zawierające Asp, umożliwiają koekspresję CD16TM, ale z mniejszą wydajnością niż dimer macierzysty (fig. 3). Przykład V Mutantowe receptory zachowują zdolność do inicjowania reakcji wapniowej W celu ustalenia, czy sieciowanie białek fuzyjnych może spowodować nagromadzanie się wolnego wewnątrzkomórkowego wapnia w podobny sposób jak w przypadku receptora antygenu komórki T, komórki ludzkiej linii komórek białaczki T, Jurkat E6 (ATCC Accessior Number TIB 152, American Type Culture Collection, Rockville, MD), zainfekowano rekombinantami krowianki i zmierzono względne cytoplazmatyczne stężenie wapnia po sieciowaniu pozakomórkowej domeny z przeciwciałami. Pomiary metodą cytometrii przepływowej przeprowadzono dla komórek obciążonych wrażliwym na wapń barwnikiem Indo-1 (Grynkiewicz i inni, J. Biol. Chem. 260:3340-3450 (1985); Rabinovitch i inni, J. Immunol. 137:952-961 (1986). Na fig. 4A-D pokazano wyniki eksperymentów z przepływem wapnia dla komórek zainfekowanych CD4: oraz mutantami Asp" ζ i Cys'. Sieciowanie chimer powtarzanie zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom wapnia. CD4:η i CD4: y również umożliwiają nagromadzanie wewnątrzkomórkowego wapnia w zainfekowanych komórkach. Komórki Jurkata wytwarzają w wyniku ekspresji mniejsze ilości CD4 na powierzchni, z tym że sieciowanie natywnego CD4 w obecności lub bez CD I6: ζ nie wpływa na wewnątrzkomórkowy poziom wapnia (fig. 4A-B). P r z y k ł a d VI Chimery η oraz y uczestniczą w cytolizie celów, w których zachodzi ekspresja HIV gp 120/41 W celu stwierdzenia, czy chimeryczne receptory mogą uruchamiać cytolityczne programy efektorowe, stworzono modelowy układ cehefektor oparty na rozpoznawaniu przez CD4 kompleksu kopertowego HIV gp 120/gp41. Komórki HeLa zainfekowano rekombinantowymi wirusami krowianki, w których zachodzi ekspresja gp 120/gp41 (Chakrabarti i inni, Nature 320:535-537 (1986); Earl i inni, J. Virol. 64:2448-2451 (1990)) oraz wykonano znakowanie 51Cr. Znakowane komórki inkubowano z komórkami z ludzkiej allospecyficznej (CD8+, CD4") cytotoksycznej linii limfocytów T, którą zainfekowano rekombinantami krowianki, w których zachodzi ekspresja chimer CD4:ζ CD4:ηlub CD4: y, lub podwójną mutantową chimerą CD4: ζ 11GIy:Aspl5Gly. Na fig. 5A-C pokazano, że komórki HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41 zostały specyficznie zlizowane przez cytotoksyczne limfocyty T (CTL), w których zachodzi ekspresja chimery CD4. Niezainfekowane komórki HeLa nie stanowiły celu dla CTL zawierającymi chimery CD4: ζ, a komórki HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20/41 nie były rozpoznawane przez nie zainfekowane CTL. W celu porównania działania różnych chimer stosunki efektor:cel skorygowano uwzględniając frakcję CTL, w których zachodzi ekspresja chimer CD4, oraz frakcję komórek HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41, oznaczone metodą cytometrii przepływowej. Na figurze 5C pokazano cytometryczną analizę ekspresji CD4 przez CTL stosowane w eksperymentach cytolizy pokazanych Na fig. 5A i 5B. Jakkolwiek średnia gęstość powierzchniowa CD4: ζ znacznie przewyższa średnią gęstość CD4: η to cytolityczne zdolności komórek, w których zachodzi ekspresja obydwu form były podobne. Przy korygowaniu uwzględniającym 20 180 066 frakcję celów, w których zachodzi ekspresja gp120, skuteczności cytolizy z udziałem białek CD4: ζ i CD4: η są porównywalne z najlepszymi podawanymi skutecznościami dla par cel:efektor określonego receptora komórki T (średni stosunek efektora do celu dla 50% uwalniania przez komórki T, w których zachodzi ekspresja CD4: ζ wynosił 1,9 ± 0,99, n = 10. Fuzja CD4: y była mniej aktywna, podobnie jak fuzja CD4: ζ nie zawierająca przezbłonowych reszt Asp i Cys. Jednakże w obydwu przypadkach zaobserwowano znaczącą cytolizę (fig. 5B-C). Aby sprawdzić ewentualność, że infekcja krowianką może ułatwić artefaktyczne rozpoznawanie przez CTL, przeprowadzono podobne eksperymenty cytolizy z komórkami docelowymi zainfekowanymi rekombinantami krowianki, w których zachodzi ekspresja formy CD 16 połączonej z fosfatydyloinozytolem (CD16PI) i znakowanymi51CR, oraz z CTL zainfekowanymi kontrolnymi rekombinantami, w których zachodzi ekspresja CD16PI lub CD 16: ζ. Na fig. 6A pokazano, komórki T, w których zachodzi ekspresja chimer nie-CD4, nie rozpoznająnatywnych komórek HeLa lub komórek HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41, oraz, podobnie, że komórki T, w których zachodzi ekspresja chimer CD4, nie rozpoznają komórek HeLa, w których zachodzi ekspresja innych białek powierzchniowych kodowanych przez krowiankę. Na dodatek CTL, w których zachodzi ekspresja niechimerycznego CD4, nie powodują w znaczącym stopniu lizy komórek HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20/41 (fig. 6A). P r z y k ł a d VII Komórki przenoszące MEC klasy II nie stanowią celu dla chimer Uważa się, że CD4 oddziaływuje z niepolimorficzną sekwencją wytwarzaną w wyniku ekspresji przez antygen MHC klasy II (Gay i inni, Nature 328:626-629 (1987); Sleckman i inni, Nature 328:351-353 (1987)). Jakkolwiek specyficzne oddziaływanie między CD4 i antygenem klasy II nigdy nie zostało udokumentowane na oczyszczonych białkach, w pewnych warunkach można było stwierdzić adhezję komórek, w których zachodzi ekspresja CD4, do komórek, w których zachodzi ekspresja cząsteczek klasy II (Doyle i inni, Nature 330:256-259 (1987); Clayton i inni, J. Exp. Med. 177:1243-1253 (1990); Lamarre i inni,. Science 245:743-746 (1989)). Zbadano następnie, czy można wykryć zabijanie komórek przenoszących klasę II. Na fig. 6B pokazano, że nie obserwuje się specyficznej cytolizy skierowanej przez CD4: ζ przeciw linii komórek Raji B, w których zachodzi obfita ekspresja antygenu klasy U. Jakkolwiek zaobserwowano słabą (~ 5%) cytolizę, mutant klasy II-ujemny Raji, RJ2.2.5, (Accolla J. Exp. Med. 157:1053-1058 (1983)) wykazuje podobną podatność jak komórki Raji inkubowane z nie zainfekowanymi komórkami T. P r z y k ł a d VIII Wymagania odnośnie sekwencji do indukowania cytolizy przez łańcuch antygen komórki T/Fc receptor ζ Jakkolwiek chimery pomiędzy CD4 i ζ mogą uzbrajać cytotoksyczne limfocyty T (CTL), tak aby zabijały one docelowe komórki, w których zachodzi ekspresja HTV gp I20, poszukiwano alternatywny dla CD4, aby bezwarunkowo porównać właściwości chimer ζ wprowadzonych do ludzkich linii komórek T. Linie takie mogą wytwarzać w wyniku ekspresji CD4, co utrudnia konkretne ustalenie zależności pomiędzy typem i stopniem mobilizacji białkowej oraz potencjałem cytotoksycznym różnych chimer. Aby obejść ten problem wytworzono chimery pomiędzyζ, i CD 16, w których pozakomórkowa domena CD 16 j est połączona z przezbłonowymi i wewnątrzkomórkowymi sekwencjami ζ (fig. 7A). Fuzje genowe wprowadzono do plazmidu ekspresji wirusa krowianki przenoszącego gen gpt E. coli jako marker selekcji, po czym wykonano insercję do genomu szczepu krowianki WR na drodze homologicznej rekombinacji i selekcji względem wzrostu w kwasie mikofenolowym (Falkner i Moss, J. Virol. 62:1849 (1988); Boyle i Coupar, Gene 65:123(1988)). Linie komórek T zainfekowano rekombinantami krowianki i zmierzono względne cytoplazmatyczne stężenie wolnych jonów wapniowych po sieciowaniu pozakomórkowych domen przeciwciałami. Zarówno spektrofluorometryczne (populacja w masie) jak i przepływowe cytometryczne (pojedyncza komórka) pomiary przeprowadzono dla komórek obciążonych barwnikiem Indo-1 (Grynkiewicz i inni, J. Biol. Chem. 260:3440 (1985); Rabinovitch i inni, J. Immunol. 137:952 (1986)). Na fig. 7B pokazano wyniki lizy danych zebranych z komórek ludz- 180 066 21 kiej linii komórek białaczki T Jurkata, zainfekowanych rekombinantami krowianki, w których zachodzi ekspresja białka fuzyjnego CD16: ζ .Sieciujące chimery powtarzalnie zwiększają wewnątrzkomórkowy poziom wapnia, podczas gdy podobna obróbka komórek w których zachodzi ekspresja niechimerycznego CD 16, wywiera co najwyżej minimalny wpływ. Gdy chimera jest wytwarzana w wyniku ekspresji w mutantowych liniach komórek nie zawierających receptora antygenu, obserwuje się REX33A (Breitmeyer i inni, J. Immunol. 138:726 (1987); Sancho i inni, J. Biol. Chem. 264:20760 (1989)), lub mutant Jurkata JRT3.T3.5 (Weiss i inni, J. Immunol. 135:123 (1984)); albo silnąreakcję na sieciowanie przeciwciała CD 16. Podobne wyniki zebrano dla mutantowej linii komórek REX20A (Breitmeyer i inni, supra, 1987; Blumberg i inni, J. Biol. Chem. 265:14036 (1990)) oraz dla CD3/Ti-ujemnego mutanta linii komórek Jurkata założonej w tym laboratorium. Infekcja rekombinantami, w których zachodzi ekspresja CD 16: ζ, nie odtwarza reakcji na przeciwciała anty-CD3, co wykazuje, że białko fuzyjne nie oddziaływuje poprzez uwalnianie łańcuchów wewnątrzkomórkowego kompleksu CD3. Aby ocenić zdolność chimer do zmiany kierunku odporności z udziałem komórek CTL zainfekowano rekombinantami krowianki, w których zachodzi ekspresja chimer CDI 6, po czym zastosowano do przeprowadzenia specyficznej lizy komórek hybrydomy, w których zachodzi ekspresja związanych z błoną przeciwciał anty-CD16. Test ten stanowi rozszerzenie testu cytotoksyczności hybrydomy opracowanego pierwotnie do analizowania mechanizmów efektorowych komórek przenoszących receptory Fc (Graziano i Fanger, J. Immunol. 138:945, 1987; Graziano i Fanger, J. Immunol. 139:35-36,1987; Shen i inni, Mol. Immunol. 26:959,1989; Fanger i inni, Immunol. Today 10:92,1989). Na fig. 8B pokazano, że ekspresja CD16: ζ w cytotoksycznych limfocytach T umożliwia uzbrojenie CTL tak, że zabija on komórki hybrydomy 3G8 (anty-CD16; Fleit i inni, Proc. Natl. Acad, Sei, USA 79:3275, 1982), podczas gdy CTL, w których zachodzi ekspresja formy CD 16 połączonej z fosfatydyloinozytolem, jest nieaktywny. CTL uzbrojony w CD 16: t, również nie zabija komórek hybrydomy, w których zachodzi ekspresja niewłaściwego przeciwciała. Aby zidentyfikować minimalne sekwencje ζ niezbędne do zajścia cytolizy, otrzymano szereg mutantów delecyjnych, w których kolejno coraz więcej wewnątrzkomórkowej domeny ζ usunięto z końca karboksylowego (fig. 8A). Większość wewnątrzkomórkowej domeny ζ można usunąć z niewielkimi konsekwencjami w odniesieniu do potencjału cytolitycznego: pełnej długości chimera CD 16: ζ była zasadniczo równa pod względem skuteczności z chimerą, w której wykonano delecję do reszty 65, CD 16: ζ Asp66* (fig. 8B). Zasadniczy spadek cytotoksyczności zaobserwowano w przypadku delecji do reszty ζ 59 (chimera CD16: ζ Glu60ł), a dalsza delecja do reszty 50 spowodowała nieznaczny spadek aktywności. Jednakże pełnej utraty aktywności nie zaobserwowano nawet wtedy, gdy wewnątrzkomórkową domenę zredukowano do 3 reszt zakotwiczenia przezbłonowego (fig. 8B). Z uwagi na to, że ζjest dimerem z połączeniem disulfidowym, jedno z wyjaśnień zachowania aktywności cytolitycznej opiera się na tym, że endogenny t, tworzy heterodimery z chimeryczną delecją ζ, co powoduje odtworzenie aktywności. W celu sprawdzenia tego założenia reszty ζ l i i 15 zmieniono z Asp i Cys odpowiednio na Gly(CysllGly/Aspl5Gly), po czym przeprowadzono immunoprecypitacje w sposób następujący. Około 2 x 106 komórek CV1 zainfekowano przez 1 godzinę w ośrodku DME pozbawionym surowicy, ze zrekombinowaną krowianką przy krotności infekcji (moi) co najmniej 10. 6-8 godzin po infekcji komórki oddzielono od płytek za pomocą PB S/1mM EDTA i przeprowadzono znakowanie powierzchniowe 0,2 mCi 1251 na 2 x 106 komórek stosując laktoperoksydazę i H20 2, metodą Clarka i Einfelda (Leukocyte Typing II, str. 155-167, Springer Verlag, NY, 1986). Znakowane komórki zebrano przez odwirowanie i przeprowadzono lizę w 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15M NaCl, 0,05M Tris, pH 8,0, 5mM MgCl2, 5mM KC1, 0,2M jodoacetamid i 1mM PMSF. Jądra usunięto przez odwirowanie, po czym wykonano immunoprecypitację białek CD 16 przeciwciałem 3G8 (Fleit i inni, supra, 1982; Medarex) oraz agarozą z anty-mysim IgG (Cappel, Durham, NC). Próbki poddano elektroforezie przez 8% żel poliakrylamid/SDS w warunkach nieredukujących lub przez 10% żel w warunkach 22 180 066 redukujących. Takie immunoprecypitacje potwierdziły, że chimera CD16: ζ CysllGly/Aspl5Gły nie tworzy asocjatów w strukturach dimerowych z połączeniem disulfidowym. Zbadano również cytolityczną aktywność receptorów mutantowych. Zmutowana chimera z delecją do reszty 65 (CD 16: ζ Cysl lGly/Asp 15Gly/Asp66*) była, zależnie od warunków testu, 2-8 razy mniej aktywna w teście cytolizy niż porównywalna niemutowana chimera (CD 16: ζ Asp66ł), która zazwyczaj wykazywała aktywność mniej niż dwukrotnie niższą lub nierozróżnialną od aktywności CD 16: ζ (fig. 9B). Spadek aktywności mutantowej chimery jest podobny do spadku obserwowanego dla chimer CD4 o podobnej budowie (patrz powyżej) i można go najprawdopodobniej przypisać zmniejszonej skuteczności monomerów ζ w porównaniu z dimerami. Natomiast zmutowana chimera Asp', Cys' z delecjądo reszty 59 nie wykazuje aktywności cytolitycznej (fig. 9B), co potwierdza hipotezę, że asocjacja z innymi łańcuchami z udziałem przezbłonowych reszt Cys i/lub Asp jest odpowiedzialna za słabą stabilność aktywności cytolitycznej w delecjach wykraczających poza resztę 65 od końca aminowego. Badania przepływu cytometrycznego wykazały, że mutanty delecyjne nie zawierające przezbłonowych reszt Asp i Cys mogą w dalszym ciągu powodować wzrost stężenia wewnątrzkomórkowego wolnych jonów wapniowych w reakcji na sieciowanie przeciwciałami w TCR-mutantowej linii komórek Jurkata (fig. 9D). Podobne wyniki uzyskano dla chimer powstających w wyniku ekspresji w macierzystej linii Jurkata. W przypadku CD16: ζ Cysl lGly/Asp 15Gly/Glu60* wyniki wskazują, że zdolność w uczestniczeniu w reaktywności wapniowej można mutacyjnie oddzielić od zdolności do podtrzymywania cytolizy. Aby definitywnie wyeliminować ewentualny wpływ przezbłonowych reszt ζ, przezbłonowe i pierwszych 17 cytoplazmatycznych reszt ζ zastąpiono sekwencjami kodującymi przejście przez błonę oraz odpowiednio pierwszych 14 lub pierwszych 17 cytoplazmatycznych reszt antygenów CD5 lub CD7 (fig. 9A). Uzyskane trójdzielne białka fuzyjne CD 16: 5: ζ (48-65) i CD 16: 7: ζ (48-65) nie tworzą dimerów z połączeniem disulfidowym, podobnie jak prostsze chimery CDI 6: ζ, gdyż nie zawierająone cysteiny w przezbłonowej domenie £,. Obydwie trójdzielne chimery były zdolne do mobilizowania wapnia w liniach komórek Jurkata i TCR-ujemnej (fig. 9D) oraz wywoływały reakcję cytolityczną w CTL (fig. 9C oraz dane nie pokazane). Natomiast skrócenie części ζ do reszty 59 w chimerze CD16: 7: ζ (48-59) znosi zdolność trójdzielnej fuzji do kierowania reaktywnością wapniową w TCR-dodatnich lub -ujemnych komórkach Jurkata oraz do cytolizy w dojrzałych CTL (fig. 9C i 9D oraz dane nie pokazane). W celu zbadania udziałów poszczególnych reszt w motywie o 18 resztach wykonano szereg wariantów mutantowych na drodze mutagenezy ukierunkowanej, oraz oceniono ich zdolność do uczestniczenia w kierowanym przez receptor zabijaniu w warunkach niskiej (fig. 10A i 1OD) lub wysokiej (fig. 10B i 10E) ekspresji chimerycznego receptora. Na fig. 10A-F pokazano, że jakkolwiek szereg zachowawczych podstawień (np. zastępowanie reszt kwasowych ich pokrewnymi amidami lub tyrozyny fenyloalaniną) rozdzielających reszty 59 do 63 powoduje umiarkowany spadek skuteczności cytolitycznej, to w zasadzie warianty zachowują zdolność do mobilizowania wapnia. Jednakże reszty te stanowią łącznie ważny podmotyw, gdyż ich delecja eliminuje aktywność cytolityczną. Zmiana Tyr 62 na Phe lub Ser eliminuje zarówno cytotoksyczność jak i reakcje wapniowe. Przy końcu aminowym segmentu o 18 resztach zastąpienie Tyr 51 przez Phe eliminuje zarówno mobilizację wapnia jak i aktywność cytolityczną, natomiast zastąpienie Leu przez Ser w pozycji 50 eliminuje reakcję wapniową, ale tylko nieznacznie osłabia cytolizę. Nie wiążąc się żadną hipotezą wydaje się, że niezdolność mutanta Leu50Ser do mobilizowania wapnia w krótkotrwałym teście przepływu cytometrycznego nie w pełni odzwierciedla jego zdolność do znaczącego zwiększania wewnątrzkomórkowego stężenia wolnych jonów wapniowych w dłużej trwającym teście cytolizy. Jednakże o niewrażliwej na wapń aktywności cytolitycznej doniesiono w przypadku pewnych cytolitycznych linii komórek T, tak że nie można wykluczyć, że podobne zjawisko leży u podstaw uzyskanych rezultatów. Zastąpienie Asn48 przez Ser częściowo zmniejsza cytotoksyczność w pewnych eksperymentach, a w innych wywiera nieznaczny wpływ. 180 066 23 W celu zbadania potencjalnej roli zbędnych elementów sekwencji wewnątrzkomórkową domenę£, podzielono na 3 segmenty, obejmujące reszty 33 do 65,71 do 104 oraz 104 do 138. Każdy z tych segmentów przyłączono do chimery CD 16: CD7 przez miejsce Mlul wprowadzone za podstawowymi sekwencjami wewnątrzkomórkowej domeny CD7 zakotwiczenia w błonie (patrz poniżej; fig. 11A). Porównanie działania cytolitycznego trzech elementów wykazuje, że są one zasadniczo jednakowo skuteczne (fig. 1IB). Porównanie sekwencji (fig. 11A) wykazało, że drugi motyw przenosi 11 reszt pomiędzy tyrozynami, podczas gdy pierwszy i trzeci motyw zawierają po 10 reszt. Jakkolwiek nie ustalono dokładnie procesu uaktywniania komórki T, wyraźnie widać, że agregacja receptora antygenu lub chimer receptora przenoszących wewnątrzkomórkowe sekwencje ζ uaktywnia mobilizację wapnia, uwalnianie cytokiny i granulki, oraz ujawnienie się markerów aktywujących na powierzchni komórki. Aktywne miejsce w ζ, krótka liniowa sekwencja peptydowa, prawdopodobnie zbyt mała, aby wykazywać własną aktywność enzymatyczną, prawdopodobnie oddziaływuje z jednym lub co najwyżej kilkoma białkami uczestnicząc w uaktywnieniu komórki. Wyraźnie również widać, że sama mobilizacja wolnego wapnia nie wystarcza do uaktywnienia komórki, gdyż zdolność do uczestniczenia w cytolizie można mutacyjnie oddzielić od zdolności do uczestniczenia w nagromadzaniu wapnia. Jak to wykazano, dodanie 18 reszt z wewnątrzkomórkowej domeny ζ do przezbłonowej i wewnątrzkomórkowej domeny dwóch nie spokrewnionych białek powoduje, że uzyskane chimery ukierunkowują cytolityczną aktywność przeciw komórkom docelowym, które wiążą się z pozakomórkową częścią białek fuzyjnych. Jakkolwiek chimery przenoszące motyw o 18 resztach są w przybliżeniu ośmiokrotnie mniej aktywne niż chimery oparte na pełnej długości ζ, zmniejszoną aktywność można przypisać utracie oddziaływań przezbłonowych, które normalnie umożliwiajątworzenie przez ζ dzikiego typu dimerów z połączeniem disulfidowym. Oznacza to, że konstrukty delecyjne ζ zawierające taki sam koniec karboksylowy jak motyw, oraz nie zawierające przezbłonowych reszt Cys i Asp zazwyczaj wykazują mniejszą aktywność niż chimery przenoszące tylko motyw o 18 resztach. Cytolityczny element kompetencyjny, na który zwrócono uwagę, zawiera dwie tyrozyny oraz nie zawiera seryn ani treonin, co ogranicza ewentualny udział fosforylowania w aktywności. Mutacja którejkolwiek z tyrozyn niszczy aktywność, z tym że, mimo iż wstępne eksperymenty nie wykazały znaczącego fosforylowania tyrozyny po usieciowaniu chimerycznych antygenów powierzchniowych zawierających motyw o 18 resztach, nie można wykluczyć ewentualnego udziału takiego fosforylowania na niskim poziomie. Oprócz zaobserwowanego wpływu reszt tyrozynowych szereg podstawień na końcu aminowym i karboksylowym motywu osłabia aktywność w warunkach małej gęstości receptora. Sekwencje podobne do aktywnego motywu ζ znaleźć można w cytoplazmatycznych domenach szeregu innych białek przezbłonowych, w tym w cząsteczkach CD3 5 i y, w związanych z powierzchniowym IgM białkach mbi i B29, oraz w łańcuchach (3 i y receptora IgE o wysokim powinowactwie, FceRI (Reth, Naturę 338:383, 1989). Jakkolwiek działanie tych sekwencji nie jest pewne, to przy wydajnej ekspresji każda może być zdolna do autonomicznego uaktywniania komórki T; taką właśnie aktywnością można wyjaśnić resztkową reaktywność TCR obserwowaną w ζ -ujemnej mutantowej linii komórek (Sussman i inni, Celi 52:85, 1988). Sam ζ przenosi 3 takie sekwencje, w przybliżeniu równomiernie rozmieszczone, a zgrubny podział na 3 części wewnątrzkomórkowej domeny wykazuje, że każda z nich jest zdolna do inicjowania reakcji cytolitycznej. rj, stykowa izoforma ζ (Jin i inni, supra, 1990; Clayton i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5202,1991), nie zawiera karboksylowej połówki trzeciego motywu. W związku z tym, że usunięcie karboksylowej połówki pierwszego motywu eliminuje aktywność, wydaje się prawdopodobne, że większość aktywności biologicznej r) można przypisać pierwszym dwóm motywom. Choć w różnych pomiarach r] wykazuje taką samą aktywność jak £, w inicjowaniu uwalniania cytokiny z udziałem antygenu (Bauer i inni, Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:3842,1991) lub w ukierunkowywaniu cytolizy (patrz powyżej), r\ nie ulega fosforylowaniu w odpowiedzi na pobudzanie receptora (Bauer i inni, supra, 1991). W związku z tym albo obecność 24 180 066 wszystkich trzech motywów jest niezbędna do zajścia fosforylowania, albo też trzeci motyw stanowi korzystny substrat dla niezidentyfikowanej kinazy tyrozynowej. P r z y k ł a d IX Transdukcja sygnału cytolitycznego przez ludzki receptor Fc Aby ocenić działanie różnych podtypów ludzkiego receptora Fc stworzono chimeryczne cząsteczki, w których pozakomórkową domenę ludzkich antygenów CD4, CD 5 lub CD 16 połączono z przezbłonową i wewnątrzkomórkową domenąFcI I yA, podtypy B 1, B2 i C (nomenklatura Ravetcha i Kineta, Ann. Rev. Immunol. 9:457, 1991). W szczególności sekwencje cDNA odpowiadające domenom przezbłonowym i cytoplazmatycznym uprzednio opisanych izoform FCRIIA B 1 i B2 zamplifikowano z istniejącego klonu PC23 lub z biblioteki cDNA ludzkiego migdałka (skonstruowanej znanymi sposobami) stosując następujące syntetyczne startery oligonukleotydowe: CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (SEQ ID NO: 18; FCRIIA do przodu); CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEQ ID NO: 19; FCRII A odwrotnie); GCG GGG GGA TCC CAC TGT CC A AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEQ ID NO: 20; FCRII BI i FCRII B2 do przodu); oraz GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEQ ID NO: 21; FCRII BU i FCRII B2 odwrotnie). Startery te zawierały miejsca rozszczepiania odpowiednio dla enzymów BamHI i Notl, 6 reszt od końca 5'. Miejsce NotI znajdowało się bezpośrednio za kodonem terminacyjnym typu nonsens, CTA lub TTA. Wszystkie startery zawierały 18 lub więcej reszt komplementarnych z końcami 5' i 3' pożądanych fragmentów. Fragment cDNA odpowiadający cytoplazmatycznej domenie FcRIIyC, różniącej się od izoformy IIA jedynie jedną resztą aminokwasu (L zamiast P w reszcie 268) wytworzono metodą ukierunkowanej mutagenezy przez nakładanie PCR, stosując startery o sekwencjach: TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (SEQ ID NO: 22) oraz TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEQ ID NO: 23). Fragmenty PCR wstawiono do wektorów ekspresji wirusa krowianki, które zawierały odpowiednio pozakomórkowe domeny CD 16 lub CD4, po czym wykonano insercję do dzikiego typu krowianki na drodze rekombinacji w locus kinazy tymidynowej, przeprowadzając selekcję względem współintegracji z gpt E. coli, aby ułatwić identyfikację pożądanych rekombinantów. Identyczność wszystkich izoform (pokazanych Na fig. 12) potwierdzono przez sekwencjonowanie didezoksy. Wytwarzanie chimerycznych białek receptorowych potwierdzono w badaniach immunoprecypitacji. Około 107 komórek JRT3.T3.5 zainfekowano przez 1 godzinę w pozbawionym surowicy ośrodku IMDM ze zrekombinowaną krowianką przy krotności infekcji co najmniej 10. W 12 godzin po infekcji komórki zebrano i przeprowadzono znakowanie powierzchniowe 0,5 mCi 125I na 107komórek stosując metodę z laktoperoksydaząi oksydazą glukozową (Clark i Einfeld, supra). Znakowane komórki zebrano przez odwirowanie i przeprowadzono lizę w 1% NP-40,0,1 mMMgCl2,5mM KCl, 0,2Mjodoacetamid i ImM PMSF. Jądra usunięto przez odwirowanie, po czym wykonano immunoprecypitację białek CD 16 przeciwciałem 4G8 oraz agarozą z anty-mysim IgG. Próbki poddano elektroforezie w warunkach redukujących. Wszystkie cząsteczki immunostrącanego chimerycznego receptora cząsteczki wykazywały oczekiwane masy cząsteczkowe. W celu zbadania zdolności chimerycznych receptorów do uczestniczenia w zwiększaniu cytoplazmatycznego stężenia wolnych jonów wapniowych zastosowano zrekombinowane wirusy do zainfekowania TCR-mutantowej linii komórek Jurkata JRT3.T3.5 (jak to opisano powyżej), cytoplazmatyczne stężenie wolnego wapnia oznaczano w komórkach (w sposób opisany powyżej) po sieciowaniu pozakomórkowych domen receptora monoklonalnymi przeciwciałami 3GS lub Leu-3A (w sposób opisany powyżej). Eksperymenty te potwierdziły, że wewnątrzkomórkowe domeny FcRyll, A i C były zdolne do uczestniczenia w zwiększaniu cytoplazmatycz- 180 066 25 nego stężenia wolnych jonów wapniowych po sieciowaniu pozakomórkowych domen, podczas gdy wewnątrzkomórkowe domeny FcRyll, B 1 i B2, były nieaktywne w porównywalnych warunkach (fig. 13A i 13B). Hybrydy CD4, CD5 i CD 16 FcRyll A wykazują zasadniczo równą zdolność we wzmacnianiu reakcji wapniowej (fig. 13A-B). Inne linie komórek, zarówno z linii monocytowych jak i limfocytowych, były zdolne do odpowiadania na sygnał zainicjowany przez sieciowanie domen pozakomórkowych. W celu wyjaśnienia roli różnych wewnątrzkomórkowych domen FcRy II w cytolizie ludzkie cytotoksyczne limfocyty T (CTL) zainfekowano rekombinantami krowianki, w których zachodzi ekspresja chimer CD 16: FcRyll A, B 1, B2 oraz C. Zainfekowane komórki współhodowano następnie z 51Cr-obciążonymi komórkami hybrydomy (np. komórkami 3GS 10-2), które wytwarzają w wyniku ekspresji powierzchniowe przeciwciała względem CD 16. W teście tym CTL przenoszące chimerę CD 16 zabijają docelowe komórki hybrydomy (co umożliwia uwolnienie wolnego 5'Cr), jeśli pozakomórkowa domena CD 16 chimery była połączona z wewnątrzkomórkowym segmentem zdolnym do uaktywnienia limfocytowego programu efektorowego; ten test cytolizy opisano szczegółowo poniżej. Na fig. 14A pokazano, że CTL uzbrojone w CD16: FcRyllA oraz ζ ale nie w FcRyll BI lub B2, są zdolne do przeprowadzania lizy docelowych komórek, w których zachodzi ekspresja anty-CD16 przeciwciał powierzchni komórki. Aby wyeliminować ewentualność, że specyficzna cytoliza może być w pewnym stopniu przypisana oddziaływaniu z grupą CD 16, przeprowadzono eksperymenty cytolizy, których wewnątrzkomórkowe domeny FcRII przyłączono do pozakomórkowych domen CD4. W takim przypadku komórkami docelowym i były komórki HeLa, w których zachodzi ekspresja białek gp 12/41 koperty HIV (w szczególności komórki HeLa zainfekowane wektorem krowianki vPEl 6 (dostępnym z National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, MD). Podobnie jak dla układu CD 16, docelowe komórki, w których zachodzi ekspresja koperty HIV, były podatne na lizę przez komórki T, w których zachodzi ekspresja chimery CD4: FcRyll A, ale nie FcRyll BI lub B2 (fig. 14B). Wewnątrzkomórkowe domeny FcRyll A i C nie dzielą zasadniczej homologii sekwencji z jakimkolwiek innym białkiem, w tym z elementami rozszerzonej rodziny FcRy/TCR. W celu ustalenia elementów sekwencji odpowiedzialnych za indukcję cytolizy wykonano delecje 5' i 3' sekwencji kodujących wewnątrzkomórkowe domeny (opisane poniżej i pokazane na fig. 15A) oraz oceniono ich skuteczność w testach mobilizacji wapnia cytolizy (w sposób opisany powyżej). W tych eksperymentach, w których usunięto amino-końcową część wewnątrzkomórkowej domeny, przezbłonową domenę FcRyll zastąpiono przezbłonową domeną niespokrewnionego antygenu CD7, tak aby wyeliminować ewentualny udział oddziaływań z udziałem domeny przenikającej przez błonę. Na figurze 15B i 15C pokazano, że usunięcie 14 karboksy-końcowych reszt, obejmujących tyrozynę 298 powoduje całkowitą utratę zdolności cytolitycznej oraz zasadnicze zmniejszenie potencjału mobilizacji wapnia. Dalsza delecja do miejsca tuż przed tyrozyną 282 dała identyczny fenotyp (fig. 15B i 15C). Delecja od końca N wewnątrzkomórkowej domeny do reszty 268 nie wywierała zasadniczego wpływu ani na profil wapnia ani na zdolność cytolityczną, podczas gdy delecja do reszty 275 znacząco zaburzyła uwalnianie wapnia, ale wywarła nieznaczny wpływ na cytolizę (fig. 15D i 5E). Dalsza delecja do reszty 282 dała ogon FcRyll, który nie wykazuje zdolności do mobilizowania wapnia ani do uruchamiania cytolizy (fig. 15D i 15E). „Aktywny element” określony w tych zgrubnych pomiarach jest względnie duży (36 aminokwasów) i zawiera dwie tyrozyny rozdzielone przez 16 reszt. Przykład X Ukierunkowana cytoliza przez limfocyty przenoszące chimeryczne receptory CD4, które nie podtrzymują infekcji Jak to przedstawiono powyżej, można skonstruować takie cząsteczki efektorowe, które ukierunkowują aktywność cytolityczną CTL w sposób niezależny do MHC. Tak np. chimera złożona z pozakomórkowej domeny CD4 połączonej z łańcuchem w ludzkim klonie CTL, WH3, specyficznie zabija komórki docelowe zawierające powierzchniową glikoproteinę kopertową 26 180 066 HIV-1, gp120. W związku z tym, że pozakomórkowa domena cząsteczki CD4 nadaje podatność na infekcję HIV, uzbrojone CTL mogą stanowić cele dla wirusa, co osłabi ich skuteczność (Dalgleish i inni, Nature 312:767 (1984); Klatzmann i inni, Nature 312:767 (1984)). Aby zapobiec takim skutkom, zaprojektowano chimeryczne cząsteczki efektorowe oparte na CD4, skutecznym w specyficznym doprowadzaniu do komórek zainfekowanych przez HIV w celu doprowadzenia do ich zabicia, ale który nie nadaje podatności na infekcję HIV. Stworzono trójdzielne białko fuzyjne przez genetyczne złożenie pozakomórkowej domeny CD4 (fig. 23) z zawiasą oraz drugą i trzecią stałą domeną ciężkiego łańcucha ludzkiego I-gGl (Zettlmeissl i inni DNA Cell Biol, 2:347 (1990)) (fig. 25), które połączono w tym przypadku z częścią pierwszego przezbłonowego egzonu ludzkiego IgGl związanego z błoną, po której następowała część ludzkiego antygenu CD7 obejmująca sekwencje pomiędzy samą Ig-podobną domeną oraz sekwencję przenoszącą terminacją, a następnie domenę przezbłonową (Aruffo i Seed, EMBO J. 6:3313 (1987)) (fig. 26). Główna sekwencja aminokwasów grupy pozakomórkowej segmentu CD7 zawiera obszar bogaty w prolinę przypominający łodygo-podobną strukturę, która przenika Ig-podobną domenę z dala od powierzchni komórki (Aruffo i Seed, EMBO J. 6:3313 (1987)) (fig. 26). Otrzymano zrekombinowane wirusy krowianki, które wytwarzają w wyniku ekspresji te i inne chimery, w sposób podany w opisie. W szczególności zrekombinowane wirusy krowianki wygenerowano na drodze homologicznej rekombinacji w komórkach CV-1. Przeprowadzono co najmniej dwie rundy wizualizacji łysinek z OKT4 lub Leu3, po czym przeprowadzono oczyszczanie łysinek dla każdego asortymentu przed otrzymaniem asortymentów o wysokim mianie w komórkach CV-1. Trójdzielna chimera (CD4 (D1-D4):Ig:CD7) (fig. 20, cząsteczka „A”) wykazywała wydajną ekspresję na powierzchni komórki i została zbadana pod względem aktywności w działaniu jako receptor HIV w teście tworzenia zespólni opartym nakrowiance (Lifson i inni, Nature 323:725 (1986)); Ashom i inni, J. Virol. 64:2149 (1990)). Komórki HeLa zainfekowane zrekombinowanym wirusem krowianki (vPE 16) kodującym glikoproteinę kopertową HIV -1 (Earl i inni, J. Virol. 64:2448 (1990)) współhodowano z komórkami HeLa zainfekowanymi CD4, CD4: ζ lub CD4 (Dl-D4):Ig:CD7. 6-cm szalki z komórkami HeLa (ATCC, Rockville, MD) przy 50% zlania zainfekowano wolnym od surowicy ośrodku przez 1 godzinę przy przybliżonej krotności infekcji (MOI) 10. Komórki inkubowano przez dodatkowe 5-6 godzin w pełnym ośrodku, po czym oddzielono je w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) zawierającym 1 mM EDTA. Komórki, w których zachodzi ekspresja koperty i chimery CD4 wymieszano w stosunku 1:1 ponownie wysiano na 6-cm szalkach z pełnym ośrodkiem. Zespólnie zliczano w 6-8 godzin po współhodowaniu, po czym fotografowano je. Współhodowla CD4 i vPE16 doprowadziła do powstania łatwo wykrywalnych wielojądrowych komórek olbrzymich. Również chimera zawierająca pozakomórkową domenę CD4 zlaną z łańcuchem ζ z TCR (fig. 27) (CD4: Q była zdolna do uczestniczenia w tworzeniu zespólni, podczas gdy komórki, w których zachodzi ekspresja CD4 (Dl-D4):Ig:CD7, nie wykazały oznak fuzji komórek. Zbadano także konstrukt, w których zachodzi ekspresja tylko pierwszej i drugiej domen CD4 (fig. 24), CD4(D1,D2): Ig:CD7 (fig. 20, cząsteczka „B”), Gdyż w innym kontekście wykazano, że dwie domeny z końca aminowego CD4 są niezbędne do zainfekowania przez HIV (Landau i inni, Nature 334:159 (1988)). Okazało się, że cząsteczka ta również nie jest podatna na wywołane przez HTV tworzenie zespólni. Badania wiązania z rozpuszczalnym, 125I-znaczonym gp 120 wykazały, że zarówno CD4 (D1-D4):Ig:CD7 jak i CD4 (D1,D2):Ig:CD7 wykazują nie upośledzone powinowactwo względem gp120. Zbadano następnie, czy cząsteczki chimeryczne, które są odporne na tworzenie zespólni, mogą być zdolne do ukierunkowywania zabijania komórek, jeśli zostaną zaopatrzone w grupę wyzwalającą, w sposób podany w opisie. Przeprowadzono fuzję wewnątrzkomórkowej domeny ζ (fig. 27) z końcem 3' CD4 (D1-D4):Ig:CD7 i CD4 (D1,D2):Ig:CD7 oraz otrzymano odpowiednie zrekombinowane wirusy krowianki. Konstrukty te, CD4 (D1-D4) :Ig:CD7: ζ i CD4 (D1,D2) :Ig:CD7: ζ (fig. 20, cząsteczki „C” i „D”), doprowadzono do ekspresji w ludzkim klonie CTL WH3 i zbadano ich zdolność do znajdywania i zabijania komórek HeLa, w których zachodzi ekspresja powierzchnio- 180 066 27 wej glikoproteiny kopertowej HIV (stosując sposoby przedstawione w opisie). Na fig. 21 pokazano, że wewnątrzkomórkowa domena ζ złączona z CD4 (D1-D4):Ig:CD7 lub CD4 (Dl,D2):Ig:CD7 nadawać zdolność zabijania; konstrukty nie zawierające łańcucha £, nie były zdolne do uczestniczenia w tej aktywności. CD4: a dodatni element kontrolny, nadawał nieznacznie zwiększoną cytotoksyczność, a CD4 (D1,D2):Ig:CD7: ζ, był nieco mniej skuteczny pod względem cytotoksyczności niż CD4 (D1-D4):Ig:CD7: ζ (fig. 21). Jednakże wyraźnie widać, że zarówno chimera CD4 (D1-D4):Ig:CD7: ζ jak i CD4 (D1,D2):Ig:CD7: ζ wykazują zdolność do uczestniczenia w specyficznym zabijaniu komórek, w których zachodzi ekspresja białek kopertowych HIV na ich powierzchni. Czterodzielne chimery były również niezdolne do uczestniczenia w powstawaniu zespólni w teście opartym na krowiance. Wykazano także, że pojedynczy motyw Ctypu przedstawionego Na fig. 11A wystarcza do nadania cytolitycznej aktywności chimerze CD4 (D1-D4). Radioimmunoprecypitacje eksperymenty potwierdziły, że cząsteczki fuzyjne stanowią przede wszystkim, a być może wyłącznie dimery. W eksperymentach tych perełki agarozy z białkiem A zastosowano do immunowytrącenia rozpuszczonego ekstraktu metabolicznie znaczonych komórek HeLa zainfekowanych zrekombinowanąkrowianką, w których zachodzi ekspresja chimer CD4 (D 1-D4):Ig:CD7: ζ i CD4 (D1,D2):Ig:CD7: ζ Immunowytrącony materiał rozfrakcjonowano metodą elektroforezy na żelu agarozowym w warunkach redukujących i nie redukujących. W szczególności około 5 x 106komórek HeLa-S3 zainfekowano w sposób opisany powyżej w odniesieniu do vPE 16 odpowiednim wariantem wirusa krowianki. Komórki metabolicznie znakowano 200 gCi/ml Tran35S-Label (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) przez 6-8 godzin ośrodku zubożonym w cysteinę metioninę, po czym oddzielono w PBS zawierającym ImM EDTA. Komórki następnie oddzielono i przeprowadzono ich lizę w 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, 5mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,1% SDS, 5mM EDTA, ImM PMSF. Po usunięciu jąder przez odwirowanie 1/5 każdego ekstraktu komórkowego zaadsorbowano na przemytych perełkach agarozowych skoniugowanych z białkiem A przez 2 godziny w 4°C. Perełki przemyto następnie PBS zawierającym 1% NP-40 i eluowano buforem próbki zawierającym SDS w obecności lub bez merkaptoetanolu. Wyniki tych eksperymentów wykazują, że większość immunostrąconych chimer CD4 (D1-D4):Ig:CD7: ζ i CD4 (D1,D2):Ig:CD7: ζ migruje w postaci dimerów o oczekiwanych masach cząsteczkowych w nieredukcyjnych warunkach. Aby bezpośrednio ocenić zdolność komórek, w których zachodzi ekspresja fuzyjnych cząsteczek CD4, do podtrzymywania infekcji HIV, przeprowadzono długotrwałe badania infekcyjności na transfektantach, w których zachodzi ekspresja CD4 (D1-D4):Ig:CD7:ζ i CD4 (D1,D2):Ig:CD7. Trwałe transfektanty CD4 (D1-D4):Ig:CD7 i CD4 (D 1,D2):Ig:CD7 oraz CD4 otrzymano w podlinii komórek 293, ulegającej łatwo transfekcji linii komórek pochodzących z ludzkiej embrionalnej nerki. Chimeryczne cząsteczki subkłonowano w dwukierunkowych wektorach, w których gen higromycyny B był kierowany przez promotor kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej. Zlane w 60-70% komórki na 10-cm szalkach transfekowano 10 pg tego plazmidowego DNA przez współstrącanie fosforanu wapnia. Przed transfekcjąplazmidy zlinearyzowano w unikatowym miejscu Sfil, i końce wyrównano polimerazą T4 DNA. W 24 godziny po transfekcji komórki podzielono na 4 części a w 48 godzin po transfekcji komórki poddano selekcji higromycynąB (Sigma, St. Louis, Mo) w ilości 400 (μg/ml. Co 3-4 dni komórki dożywiano świeżym ośrodkiem zawierającym higromycynę. Odporne kolonie wybrano, rozszerzono i ich ekspresję oceniono metodą niebezpośredniej immunofluorescencji stosując skoniugowany z fluoresceinąanty-ludzki IgG Fc (Organon Teknika, West Chester, PA) lub Q4120, przeciwciało reagujące z ludzkim CD4 (Sigma), a następnie metodą cytometrii przepływowej (Coulter, Hialeah, FL). Dwa niezależne klony każdego konstruktu z poziomami CD4 na powierzchni komórek porównywanymi z występującymi w innych klonach wybrano do lizy Na fig. 22 pokazano, że po ekspozycji na HIV, p24 wykryto w hodowlach trwałych transfektantów CD4 już w 3 dni po infekcji. W hodowlach tych zaobserwowano obecność wielojądrowych komórek olbrzymich oraz charakterystyczne pęcherzenie już w 5 dni po infekcji. Natomiast znaczących poziomów p24 lub obecności wielojądrowych komórek ol- 28 180 066 brzymich nie wykryto w nietransfekowanej macierzystej linii komórek lub w dowolnym z dwóch niezależnie uzyskanych izolatów transfektantów CD4 (D 1-D4):Ig:CD7 i CD4 (D1,D2):Ig:CD7 po 32 dniach w hodowli (fig. 22). Po zakończeniu badań infekcyjnych komórki zbadano pod względem ekspresji CD4 na powierzchni. Gęstość powierzchniowych epitopów CD4 znacząco zmniejszyła się w zainfekowanych hodowlach, w których zachodzi ekspresja CD4, co jest zgodne z wirusową modulacją do dołu, ale nie uległa zmianie w hodowlach, w których zachodzi ekspresja CD4 (Dl-D4):Ig:CD7 i CD4 (D1,D2):Ig:CD7. Eksperymenty te potwierdziły, że można uzyskać chimeryczne cząsteczki przenoszące dwie wierzchołkowe domeny CD4, które po wykonaniu fuzji z łańcuchem receptora komórki T wykazują zdolność do dochodzenia do komórek zainfekowanych przez HIV i zabijania ich, ale nie podtrzymują infekcji HIV z udziałem CD4. Dodatkowe eksperymenty sugerują, że występuje pewna fizyczna odległość między pozakomórkową domeną cząsteczki CD4 i podwójną warstwą lipidową, która nadaje odporność na infekcję HIV. W pierwszym eksperymencie skonstruowano chimeryczną cząsteczkę z delecją rdzenia CD4 i domeny przezbłonowej; delecja ta usuwa bogaty w prolinę region części przezbłonowej CD7. Gdy wykona się fuzję tej domeny z pozakomórkową domeną CD4, zachowa ona zdolność skutecznego kotwiczenia pozakomórkowej domeny CD4, o czym świadczy zmierzona ekspresja cząsteczki D4 na powierzchni komórki (przedstawiona w opisie). Znika natomiast zdolność do przeciwstawiania się tworzeniu zespólni wywoływanemu przez glikoproteinę kopertową HIV. Tak więc delecja regionu bogatego w prolinę w cząsteczce CD7, który prawdopodobnie tworzy strukturę zwoju α-helisowego, na tyle zmniejsza odległość między pozakomórkową domeną CD4 i podwójną warstwą lipidową, że zanika zdolność chimery do przeciwstawianiu się tworzeniu zespólni wywołanemu przez HIV. W drugim eksperymencie wykazano, że zdolność przeciwstawiania się wywołanemu przez HIV tworzeniu zespólni może być nadana chimerze CD4/CD5, która, jak to wcześniej wykazano, służy jako przezbłonowe zakotwiczenie pozakomórkowej domeny CD4, ale która nie jest zdolna do przeciwstawiania się wywołanemu przez HTV tworzeniu zespólni. W eksperymencie tym domeny zawiasy, CH3 i CH3 ciężkiego łańcucha ludzkiego IgGl wstawiono do cząsteczki CD4/CD5; uzyskana chimera jest odporna na tworzenie zespólni, co ponownie sugeruje, że odległość zapewniana przez domeny immunoglobulinowe wystarcza do nadania odporności na wywoływane przez HIV tworzenie zespólni. W trzecim eksperymencie domenę CD4 wydłużono zmieniając odległości od błony komórkowej za pomocą syntetycznych α-helis o różnej długości. W szczególności zaprojektowano syntetyczne oligonukleotydy reprezentujące powtarzające się α-helisowe motywy reszt glicyny i kwasu glutaminowego flankowane dwoma resztami alanylowymi (patrz fig. 28, gdzie przedstawiono główne sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów). We wcześniejszych badaniach stwierdzono, że taki układ aminokwasów występuje z dużą częstotliwością w α-helisach, co sugeruje, że powtarzalne motywy powinny przyjmować konformację α-helisową, oraz że umieszczenie takich α-helis między domenąprzezbłonowąi domenami pozakomórkowymi CD4 powinno odsunąć CD4 od błony komórkowej. Zmieniając długość segmentu α-helisowego wykonano obliczenia wystającej odległości niezbędnej do przeciwstawienia się wejściu HIV, w oparciu o znane wielkości dla podnoszenia się i powrotu α-helisy. Wyniki podano w tabeli. 180 066 29 Ta b e l a Tworzenie zespólni Ekspresja Thy-1 A. CD4+H+CH2+CH3+CD7tm+stk - - B. CD(D1,D2)+H+CH2+CH3+CD7tm+stk - - +/-(a) + D. CD4+CD7tm (długa wersja) + + E. CD4+CD7tm (krótka wersja) + + F. CD4+CD5m + + G. CD4+CH2+CH3+CD5tm - - H. CD4+CH3+CD5tm - NO 1. CD4+CD34tm + + J. CD4 + syntetyczna helisa białkowa (24A) + CD34tm NO + K. CD4 + syntetyczna helisa białkowa (48 A) + CD34tm NO +/-(b) L. CD4 + syntetyczna helisa białkowa (24 A) + CD34tm NO - C. CD4+CD7tm+stk a Zasadnicze zmniejszenie w liczbie zespólni lub komórek, w których zachodzi ekspresja thy-1. NO - nie oznaczano W tabeli tej „CD4” oznacza CD4 (D1-D4), o ile nie zaznaczono tego inaczej; „H”, „CH2” i „CH3” oznaczają odpowiednio zawiasę i regiony CH2 i CH3 ludzkiego ciężkiego łańcucha I-gG l; „CD7tm i stk” oznaczają region przezbłonowy łodygowy CD7; „CD7tm (długa wersja)” i „CD7tm (krótka wersja)” oznaczają odpowiednio region przezbłonowy CD7 i region przezbłonowy CD7 z delecją domeny bogatej w prolinę ( jak to przedstawiono powyżej); „CD5tm” oznacza region przezbłonowy CD5; a „CD34tm” oznacza region przezbłonowy CD34. W wierszach J-L długość regionu helisowego podano w angstremach; wielkości te są oparte na tym, że na jeden obrót α-helisy przypada 3,6 reszt, co odpowiada 5,4 A (czyli 1,5 A/resztę). W związku z tym 16 reszt α-helisy będzie odsuwać pozakomórkową domenę CD4 na około 24 A. α-helisy o 48 72 A skonstruowano przez kolejne kaskadowe fragmentu BstY1 do fragmentów unikatowego miejsca BamH1 (patrz fig. 28), a następnie selekcję klonów o odpowiedniej orientacji. Powstawanie zespójni zliczano w testach współhodowania z komórkami HeLa,, w których zachodzi ekspresja glikoproteiny kopertowej HIV-1 konstruktu vPE-16 wirusa krowianki, (patrz wyżej). Ekspresję Thy-1 mierzono w sposób następujący. Skonstruowano żyjący wektor retrowirusa w oparciu o klon hxb.2 HIV-1. W wektorze tym niepodstawowy gen nef zastąpiono sekwencjąkodującą thy-1 szczura, wydajnie powstającą w wyniku ekspresji cząsteczkę na powierzchni komórki, która zakotwicza się na błonie poprzez połączenie fosfatydylo-inozytolowe. Wirus pochodzący z tego klonu cząsteczkowego, oznaczony jako hxb/thy-l, jest infekcyjny, o czym świadcząjego działania cytopatologiczne oraz wytwarzanie p24 w supematantach hodowli zainfekowanych komórek C8166 (ludzka linia komórek białaczkowych T CD4+). Na dodatek przy ekspozycji na hxb/thy-1 komórki HeLa przejściowo transfekowane CD4 wykazują oznaki ekspresji thy-1już w 18 godzin po infekcji, czego można było oczekiwać w przypadku informacji regulowanej w nef-podobny sposób. Informacje kodowane przez gen nef zazwyczaj należą do klasy wirusowych białek regulujących, które ulegająwielokrotnemu rozszczepieniu i nie zawierają elementu odpowiedzi odwrotnej. Informacje te mogą trwale nagromadzać się w cytoplazmie jako wczesne wirusowe produkty genowe. Oczekiwano, że informacje thy-1 będą regulowane podobnie, to znaczy wystąpią wcześnie w cyklu życia wirusa. W skrócie układ taki ułatwia ocenę wej ścia HIV, przy czym ekspresję thy-1 wykorzystuje się jako namiastkę wejścia wirusa. Różne chimery oparte na CD4 przejściowo transfekowano w komórkach HeLa stosując standardowe sposoby z DEAE-dekstranem. Transfekowane komórki eksponowano na wirus hxb/thy-l w 48 godzin po 30 180 066 transfekcji, a zliczanie ekspresji thy-1 wykonywano w 24-48 godzin po infekcji. W przypadku wyników podanych w tabeli 1 ekspresję thy-1 oznaczano w 24 godziny po infekcji stosując dostępne w handlu monoklonalne przeciwciało Thy-1 (Accurate). Z danych przedstawionych w tabeli 1 wywnioskowano, że pozakomórkowe domeny CD4 optymalnie powinny wystawać z błony komórki na co najmniej 48 Ä, a korzystnie na co najmniej 72 A, aby zapewnić odporność na infekcję HIV. Wykorzystując strategię zbliżoną do ogólnej strategii przedstawionej w opisie skonstruować można chimery oparte na anty-HIV przeciwciałach kopertowych, które kierują się do komórek zainfekowanych przez HIV. Przykłady takich przeciwciał podali Gomy i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1624 (1989) oraz Marasco i inni, J. Clin. Invest. 90:1467 (1992). P r z y k ł a d XI Dodatkowe białka wyzwalające receptor komórki T i receptor komórki B Inne wewnątrzkomórkowe i przezbłonowe domeny przenoszące sygnał według wynalazku mogą pochodzić z białek receptora komórki T, CD3 8 i T3 y, oraz z białek receptora komórki B, mbl i B29. Sekwencje aminokwasów w tych białkach pokazano na fig. 16 (CD3 8; SEQ ID NO: 24), fig. 17 (T3 y; SEQIDNO: 25), fig. 18 (mdl; SEQ ID NO: 26) oraz fig. 19 (B29; SEQ ID NO: 27). Części sekwencji wystarczające do przenoszenia sygnału cytolitycznego (i w związku z tym korzystnie wchodzące do chimerycznego receptora według wynalazku) zaznaczono w nawiasach. Chimeryczne receptory, które zawierają takie domeny białkowe, konstruuje się i stosuje w sposobach leczenia według wynalazku, opisanych powyżej. P r z y k ł a d XII. Metody eksperymentalne Infekcja krowianką i radioimmunoprecypitacja Około 5 x 106 komórek CV1 zainfekowano na 1 godzinę pozbawionym surowicy ośrodku DME ze zrekombinowaną krowianką przy krotności infekcji (moi) co najmniej 10 (miano oznaczane na komórkach CV1). Komórki po infekcji umieszczono w świeżym ośrodku i przeprowadzono metaboliczne znakowanie stosując 200μCi/ml 35S-metioniny + cysteiny (Tran35S-label, ICN; Costo Mesa, CA) w DMEM wolnym od metioniny i cysteiny (Gibco; Grand Island, NY) na 6 godzin. Znakowane komórki oddzielono w PBS zawierającym ImM EDTA, zebrano przez odwirowanie, poddano lizie w 1% NP-40,0,1 % SDS, 0,15 M NaCl, 0,05M Tris pH 8,0,5mM EDTA i ImM PMSF. Jądra usunięto przez odwirowanie, a białka CD4 immunostrącono przeciwciałami OKT4 agarozą z anty-mysim IgG (Cappel, Durham, NC). Próbki poddawano elektroforezie przez 8% żele poliakrylamid /SDS w warunkach nieredukujących (KR) i redukujących (R). Żele zawierające 35S-znaczone próbki impregnowano En3Hance (New England Nuclear, Boston, MA) przed autoradiografią. Ułatwioną ekspresję przezbłonowej form CD 16, CD16TM, oznaczano porównując jego ekspresję w komórkach CV1 zainfekowanych tylko CD16TMz ekspresją w komórkach współzainfekowanych wirusami kodującymi CD16TMi chimeryζ, lub y . Po infekcji i inkubacji trwającej 6 godzin lub dłużej komórki oddzielano z płytek w PBS, 1 mM EDTA i ekspresję CD 16t m lub chimer oznaczano metodą niebezpośredniej immunofluorescencji cytometrii przepływowej. Test przepływu wapnia Komórki Jurkata podlinii E6 (Weiss i inni, J. Immunol.: 123-128 (1984)), zainfekowano zrekombinowanymi wirusami krowianki przez 1 godzinę pozbawionym surowicy IMDM przy moi 10 i inkubowano przez 3-9 godzin w IMDM, 10% FBS. Komórki zebrano przez odwirowanie i ponownie zawieszono w stężeniu 3 X 106 komórek/ml w pełnym ośrodku zawierającym ImM acetometoksyestru Indo-1 (Grynkiewicz i inni, J. Biol. Chem. 260:3340-3450 (1985)) (Molecular Probes) inkubowano w 37°C przez 45 minut. Komórki obciążone Indo-1 odwirowano i ponownie zawieszono w stężeniu 1 x 106/ml pozbawionym surowicy IMDM, po czym przechowywano w temperaturze pokojowej w ciemności. Komórki analizowano na obecność wolnych jonów wapniowych mierząc równocześnie emisję fluorescencji fioletowej i błękitnej metodą cytometrii przepływowej (Rabinovitch i inni, J. Immunol. 137:952-961 (1986)). W celu zainicjowania przepływu wapnia do zawiesiny komórek dodawano Leu-3A skoniugowane z fikoerytryną (PE) (anty-CD4) (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) w stężeniu 1 (ig/ml, po czym 180 066 31 dodawano 10 (μg/ml nieskoniugowanego koziego, anty-mysiego IgG w czasie 0 lub nieskoniugowane 3G8 (anty-CD16) monoklonalne przeciwciała w stężeniu 1 Mg/ml, a następnie 10 pg/ml PE-skoniugowanego koziego Fab2' antymysiego IgG w czasie 0. Histogramy stosunku emisji fioletowej/niebieskiej zbierano dla PE-dodatnich (zainfekowanych) populacji komórek, które zazwyczaj stanowiły 40-80% wszystkich komórek. Reakcję receptora antygenu komórki T w nie zainfekowanych komórkach wyzwalano przeciwciałem OKT3, bez sieciowania. W eksperymentach obejmujących chimeryczne receptory CD 16 próbki, w których następowało przemieszczanie linii podstawowej w kierunku niższego wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia (bez przeciwciał) wykluczano z lizy Histogramy analizowano następnie przekształcając dane binarne na ASCII z zastosowaniem oprogramowania Write Hand Man (Cooper City, FL), po czym wykonano analizę za pomocą zbioru programów FORTRAN. Stosunek fiolet/błękit przed dodaniem drugiego przeciwciała jako reagentu wykorzystywano do ustalania znormalizowanego stosunku wyjściowego, któremu przypisywano wartość 1, oraz ustalania progu spoczynkowego, który nastawiano tak, aby 10% populacji spoczynkowej przekraczała wielkość progową. Test cytolizy Linię WH3 ludzkich komórek T, ograniczoną linię cytolitycznąCD8+CD4 HLA B44, utrzymywano w IMDM, 10% ludzkiej surowicy, ze 100 U/ml IL-2 i okresowo pobudzano niespecyficznie napromieniowanymi (3000 rad) HLA-niresparowanymi limfocytami krwi obwodowej oraz 1 (μg/ml fitohemaglutyniny, albo specyficznie, napromieniowanymi jednojądrowymi komórkami przenoszącymi B44. Po 1 dniu niespecyficznego pobudzania PHA rozcieńczono do 0,5 fig/ml dodając świeży ośrodek, a po 3 dniach ośrodek zmieniano. Komórki hodowano przez co najmniej 10 dni po pobudzaniu przed użyciem w teście cytotoksyczności. Komórki infekowano zrekombinowaną krowianką przy krotności infekcji co najmniej 10 przez 1 godzinę w wolnym od surowicy ośrodku, po czym inkubowano w pełnym ośrodku przez 3 godziny. Komórki zbierano przez odwirowanie i ponownie zawieszono w stężeniu 1 x 107komórek/ml. 100 pi hodowli dodawano do każdej studzienki płytki mikrotiter z dnem w kształcie litery U zawierającej 100 μl/studzienkę pełnego ośrodka. Komórki rozcieńczono kolejno dwukrotnie. Dwie studzienki dla każdej próbki nie zawierały limfocytów, aby umożliwić pomiar spontanicznego uwalniania chromu i całkowite wchłanianie chromu. Komórki docelowe, HeLa podlinia S3 infekowano jak wyżej na 6,0 lub 10,0-cm płytkach przy moi około 10 przez 1 godzinę w wolnym od surowicy ośrodku, po czym inkubowano w pełnym ośrodku przez 3 godziny. Komórki oddzielano z szalek w PBS, ImM EDTA i zliczano. Porcję 106docelowych komórek (komórki HeLa, Raji lub RJ2.2.5 w przypadku eksperymentów z chimerycznym receptorem CD4 oraz komórek 3G8 10-2; Shen i inni, Mol. Immunol. 26:959 (1989) w przypadku eksperymentów z chimerycznym receptorem CD 16) odwirowano i. ponownie zawieszono w 50μ l sterylnego 51Cr-chromianu sodu (1 mCi/ml, Dupont Wilmington, DE) na 1 godzinę w 37°C z okresowym mieszaniem, po czym przemywano 3 razy PBS. 100μ l znakowanych komórek ponownie zawieszonych w ośrodku w ilości 105komórek/ml dodawano do każdej studzienki. Docelowe komórki Raji i RJ2.2.5 znakowano w taki sam sposób jak komórki HeLa. Płytki mikrotiter odwirowano przy 750 x g przez 1 minutę i inkubowano przez 4 godziny w 37°C. Pod koniec okresu inkubacji komórki z każdej studzienki ponownie zawieszono przez łagodne pipetowanie, pobrano próbkę do oznaczenia całkowitego wprowadzonego zliczenia i płytkę mikrotiter odwirowano przy 750 x g przez 1 minutę. Próbki 100μ l supematantu pobrano i zliczono w liczniku scyntylacyjnym promieniowania y. Procent zabicia korygowano uwzględniając udział zainfekowanych komórek docelowych (zazwyczaj 50-90%) oznaczony metodą cytometrii przepływowej. W przypadku zainfekowanych komórek efektorowych stosunek efektor:cel korygowano uwzględniając udział zainfekowanych komórek (zwykle 20-50% w eksperymentach z chimerycznym receptorem CD4 i >70% w eksperymentach z chimerycznym receptorem CD 16). In vitro mutageneza sekwencji ζ W celu wykonania mutacji punktowych w resztach aminokwasów 11 i/lub 15 sekwencje ζ, syntetyczne oligonukleotydowe startery rozciągające się do miejsca BamHI w górę od przezbłonowej domeny ζ, oraz przekształcenia w ζ natywnej reszty 11 z Cys w Gly (C11G) lub reszty 15 z 32 ISO 066 Asp w Gly (D15G) albo wykonania obydwu zmian (C11G/D15G), otrzymano i zastosowano w reakcjach PCR w celu uzyskania zmutowanych fragmentów, które ponownie wstawiano do konstruktów CD4: dzikiego typu. W celu stworzenia delecji ζ, sekwencje cDNA ζ amplifikowano metodą PCR stosując syntetyczne oligonukleotydowe startery zaprojektowane tak, aby utworzyć kodon terminacji (UAG) po reszcie 50,59 lub 65. Startery miejsce rozszczepienia dla enzymu Notl wstawione 5 lub 6 reszt od końca 5', zwykle w sekwencji w postaci CGC GGG CGG CCG CTA (SEQ ID NO: 11), w której ostatnie 3 reszty odpowiadają antykodonowi terminacji. Po sekwencjach Notl i antykodonu terminacji następowało 18 lub więcej reszt komplementarnych z pożądanym końcem 3' fragmentu. Uzyskaną chimerę oznaczano odpowiednio jako CD16:ζ Y51*, CD16:ζE60* i CD16: ζD66*. Miejsce BamHI w górę domeny przezbłonowej oraz miejsce Notl stosowano do wytwarzania fragmentów, które wstawiano do dzikiego typu konstruktu CD 16: ζ Monomeryczne chimery ζ uzyskiwano uwalniając przezbłonowe błonowe sekwencje ζ w sąsiedztwie sekwencji wewnątrzkomórkowej przez trawienie BamHI i SacI konstruktu Asp' i Cys' CD4: ζ opisanego powyżej i wstawiając fragment odpowiednio do konstruktu CD16:ζ E60* i CD16:ζ D66*. Konstrukcja trójdzielnej chimery CD 16: 7:1,(48-65) i CD16: 7 (1,(48-59) W celu wytworzenia konstruktu C :ζ D66* sekwencję cDNAζ odpowiadającą przezbłonowej domenie oraz 17 kolejnym resztom cytoplazmatycznej domeny zastępowano odpowiednią przezbłonowącytoplazmatyczną domeną uzyskaną CD5 i CD7 cDNA. Fragmenty CD5 i CD7 wytwarzano w reakcji PCR stosując oligonukleotydy przodujące zawierające miejsce rozszczepiania restrykcyjnego BamH1 oraz odpowiednie dla regionu tuż w górę od domeny przezbłonowej odpowiednio CD5 i CD7 oraz następujące oligonukleotydy zwrotne zachodzące odpowiednio na sekwencje CD5 i CD7, a także sekwencję ζ zawierającąmiejsce rozszczepiania restrykcyjnego SacI. CD5: ζ: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTGGCG CTG CTT CTT CTG (SEQ ID NO: 12) CD7: ζ: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (SEQ ID NO: 13). Produkty PCR, CD5 i CD7, trawiono BamHI i SacI, po czym Iigowano ze strawionym za pomocą BamHI i SacI CD 16: ζE60* zastępując sekwencję ζ od BamHI do SacI fragmentem CD7. W celu wykonania konstruktów CD16: CD5 i CD16: CD7, fragmenty CD5 i CD7 otrzymano z PCR stosując oligonukleotyd zawierający miejsce rozszczepiania restrykcyjnego Notl i kodujący kodon terminacji (UAA) po reszcie Gln416 i Ala 193 odpowiednio w CD 5 i CD7. Fragmenty CD5 i CD7 z PCR trawiono BamHI i Notl, a następnie wstawiano do konstruktu CD 16: ζ Asp66*. In vitro mutageneza N-końcowych reszt w cytolitycznym motywie ζ przenoszącym sygnał Syntetyczne oligonukleotydowe startery rozciągające się od miejsca SacI wewnątrz motywu ζ i zmieniające natywną resztę 48 z Asn na Ser (N48S), resztę 50 z Leu na Ser (L50S) oraz resztę 51 z Tyr na Phe (Y51F) zsyntetyzowano i zastosowano w reakcji PCR w celu wygenerowania fragmentów, które wstawiono do dzikiego typu konstruktu CD16: 7: ζ (48-65). In vitro mutageneza C-końcowych reszt w cytolitycznym motywie ζ przenoszącym sygnał Syntetyczne oligonukleotydowe startery rozciągające się od miejsca Notl 3' do kodonu terminacji oraz zmieniające natywną resztę 60 z GIu na Gln (E60Q), resztę 61 z Glu na Gln (E61Q), resztę 62 z Tyr na Phe lub Ser (Y62F na Y62S) oraz resztę 63 z Asp na Asn (D63N) zsyntetyzowano i zastosowano w reakcji PCR w celu wygenerowania fragmentów, które w konstruktach dzikiego typu CD 16: ζ D66* od miejsca BamHI do miejsca Notl. Konstrukcje chimer CD 16: 7: ζ (33-65), CD16: 7: ζ (71-104) i CD I6: 7: ζ (104-137) Przezbłonowy fragment CD7 przenoszący miejsca Mlul i Notl w połączeniu pomiędzy domenami, przezbłonową wewnątrzkomórkową, otrzymano w PCR stosując oligonukleotyd o następującej sekwencji: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID NO: 14). Uzyskany fragment PCR strawiono BamHI i Notl, po czym wstawiono do konstruktu CD16: 7: ζ(48-65).Fragmenty ζ kodujące reszty 33do65,71 do 104oraz 104do 137uzyskanow reakcji PCR stosując pary starterów zawierających miejsca Mlul na końcu 5' starterów przo- 180 066 33 dujących i kodony terminacji po miejscach Notl przy końcu 5' starterów zwrotnych. W każdym przypadku miejsca restrykcyjne wstawiano 6 reszt od końca 5' startera, aby zapewnić rozszczepienie enzymem restrykcyjnym. ζ 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID NO: 15); ζ 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (SEQ ID NO: 16); oraz C 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ ID NO: 17). Konstrukcja mutantów delecyjnych FcRyllA Mutanty delecyjne FcRyllA na końcu karboksylowym konstruowano w PCR w taki sam sposób jak w przypadku konstruktów o pełnej długości, zmieniając sekwencje kodujące tyrozynę w pozycjach 282 i 298 na kodony terminacji (TAA). N-końcowe delecje generowano przez amplifikację fragmentów kodujących kolejno coraz mniejszą wewnątrzkomórkową domenę metodą PCR, stosując oligonukleotydy, które umożliwiają wstawienie uzyskanych fragmentów pomiędzy miejsca restrykcyjne Mlul i Notl w uprzednio skonstruowanym plazmidzie ekspresji kodującym pozakomórkową domenę CD16 złączoną z przezbłonową domeną CD7, przy czym ta ostatnia kończy się miejscem Mlul i połączeniu między przezbłonową i wewnątrzkomórkową domeną. Inne rozwiązania Opisane wyżej przykłady wykazują, że agregacja chimer ζ,η lub y wystarcza do zainicjowania cytolitycznej reakcji komórki efektorowej w komórkach T. Znany zakres ekspresji ζηi y, obejmujący limfocyty T, naturalne komórki zabijacze, granulocyty zasadochłonne, makrofagi i komórki tuczne, sugeruje, że motywy zachowanych sekwencji mogą oddziaływać z aparatem czuciowym wspólnym dla komórek pochodzenia hematopoetycznego, oraz że istotny składnik ochrony gospodarza w układzie odpornościowym może oddziaływać poprzez zjawiska agregacji receptorów. Siła reakcji cytolitycznej oraz brak odpowiedzi na komórki docelowe przenoszące receptory MHC klasy II wykazują, że chimery oparte n aζ ,ηi y tworzą podstawę do interwencji genetycznych w AIDS na drodze immunoterapii adoptywnej. Szeroki rozkład endogennych ζ i y oraz potwierdzenie, że receptory Fc związane z y uczestniczą z cytotoksyczności w różnych typach komórek (Fanger i inni, lmmunol. Today 10:92-99 (1989)), umożliwia rozważenie wykorzystania w tym celu różnych komórek. Tak np. obojętnochłonne granulocyty o bardzo krótkim okresie życia (~4 godzin) w krążeniu, które są silnie cytolityczne, stanowią atrakcyjne komórki docelowe dla ekspresji chimer. Jest mało prawdopodobne, aby infekcja obojętnochłonnych granulocytów przez HTV spowodowała uwolnienie wirusa, a obfitość tych komórek (przeważają wśród leukocytów) powinna ułatwić obronę organizmu. Inną atrakcyjną możliwość do wykorzystania jako komórki gospodarze stanowią dojrzałe komórki T, populacja, w przypadku której możliwe są obecnie manipulacje retrowirusowe (Rosenberg S.A. Sci. Am. 262:62-69 (1990)). Przy pomocy zrekombinowanych komórek IL-2 populacje komórek T można stosunkowo łatwo rozszerzyć w hodowli, a rozszerzone populacje wykazują zazwyczaj ograniczoną żywotność po ponownej infuzji (Rosenberg i inni, N. Engl. J. Med. 323:570-578 (1990)). W odpowiednich warunkach rozpoznawanie HIV przez komórki, w których zachodzi ekspresja chimery CD4, powinno dostarczyć mitogenicznych bodźców, co stwarza możliwość, że uzbrojona populacja komórek będzie odpowiadać dynamicznie na inwazję wirusową. Jakkolwiek w opisie skupiono się na zachowaniu białek fuzyjnych w cytolitycznych limfocytach T, to ekspresja chimer w limfocytach pomocnikach może dostarczyć HIV - mobilizowanego źródła cytokin, które mogą przeciwdziałać zanikowi pozdbioru komórek pomocników w AIDS. Ostatnie opisy szeregu schematów konstrukcji odporności na infekcję na etapach innych niż penetracja wirusów (Friedman i inni, Nature 335:452-454 (1988); Green i inni, Celi 58:215-223 (1989); Malim i inni, Celi 58:205-214 (1989); Tronoi inni, Celi 59:113-120 (1989); Buonocore i inni, Nature 345:625-628 (1990)) sugerują, że komórki przenoszące chimery CD4 można zaprojektować tak, aby udaremniały produkcję wirusów poprzez ekspresję odpowiednich środków działających wewnątrz komórki. 34 180 066 Zdolność do przekazywania sygnałów do limfocytów T przez autonomiczne chimery stwarza również możliwość regulowania retrowirusowo skonstruowanych limfocytów in vivo; Sieciujące bodźce, np. z udziałem specyficznych przeciwciał IgM skonstruowanych tak, aby usunąć domeny wiążące dopełniacz, mogą zapewnić zwiększenie liczby limfocytów in situ, podczas gdy zastosowanie podobnych specyficznych przeciwciał IgG (np. rozpoznających warianty aminokwasów wprowadzone do chimerycznego) może selektywnie zubożyć skonstruowaną populację. Dodatkowo przeciwciała anty-CD4 IgM nie wymagają dodatkowego sieciowania, aby mobilizowały wapń w komórkach Jurkata, w których zachodzi ekspresja chimery CD4: Zdolność do regulowania populacji komórek bez powrotu do powtarzanej pozaustrojowej amplifikacji może zasadniczo rozszerzyć zakres i skuteczność obecnych zastosowań zaproponowanych dla genetycznie zmodyfikowanych komórek T. Jakkolwiek wynalazek opisano w odniesieniu do konkretnych rozwiązań, zrozumiałe jest, że możliwe są dalsze modyfikacje, tak że zgłoszenie niniejsze obejmuje warianty, zastosowania lub adaptacje wynalazku, a także obejmuje takie odstępstwa od niniejszego ujawnienia, w dziedzinie, do której wynalazek należy, i które jako takie wynikająz zakresu załączonych zastrzeżeń. 180066 Zestawienie sekwencji (1) Informacje ogólne: (i) Zgłaszający: Brian Seed i inni (ii) Tytuł wynalazku: Ukierunkowana cytoliza komórek zainfekowanych przez HIV, przez komórki noszące chimeryczny receptor CD4 (iii) Liczba sekwencji: 27 (iv) Adres do korespondencji: (A) Adresat: Fish & Richardson (B) Ulica: 225 Franklin Street (C) Miasto: Boston (D) Stan: MA (E) Państwo: USA (F) Kod: 02110-2804 (v) Postać odczytywana komputerowo: (A) Nośnik: Dyskietka 3,5 cala, 1,44 MB (B) Komputer: IBM PS/2 Model 50Z lub 55SX (C) System operacyjny: IBP P.C. DOS (Version 3.30) (D) Oprogramowanie: Wordperfect (Version 5.0) (vi) Dane (A) (B) (C) dotyczące zgłoszenia: Numer zgłoszenia: Data zgłoszenia: Klasyfikacja: (vii) (A) (B) (C) Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia: Numer zgłoszenia: 07/847 566 Data zgłoszenia: 6 marca 1992 Klasyfikacja: (A) (B) (C) Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia: Numer zgłoszenia: 07/665 961 Data zgłoszenia: 7 marca 1991 Klasyfikacja: (vii) (viii) (A) (B) (C) (ix) Informacja dotycząca pełnomocnika/rzecznika: Nazwisko: Clark, Paul T. Numer rejestracyjny: 30,162 Numer rzecznika: 00786/212001 Informacja telekomunikacyjna: (A) Telefon: (617) 542-5070 (B) Faks: (617) 542-8906 (C) Teleks: 200154 180066 Informacja dotycząca SEQ ID N O : 1 : (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 1728 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji:: SEQ ID N O : 1: ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTCGTCC TCCAACTGCC 50 CCTCCTCCCA GCACCCACTC AGCGAAACAA AGTGCTGCTG GGCAAAAAAC 100 TTCCACTCCA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGCAA ATCAGCGCTC 200 GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAC 300 GGGATACAG? GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTCAA TGATCCCGCT CACTCAAGAA ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTCCAGGACC AGAAGGAGGA I5O 250 350 GCTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTCC CAACTCTGAC ACCCACCTGC 400 CCCTCAGTGC AATGTACGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGCAA 500 TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTCACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC 450 CACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGACCTCCA CGATAGTCGC ACCTGGACAT 550 CTCCTAGCTT TCCACAAGCC CTCCAGCATA CTCTATAAGA AAGAGGGCGA 650 GCAGTCGCCA CCIGTCGTGC CAGGCGGAGA GCCCTTCCTC CTCCAACTCT 750 CCAGGACCCT AASCTCCACA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850 CCACTGTCTT GCACAACCAG AACAAGCTGG AGTTCAAAAT AGACATCCTC ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CBCTCGCCTT TACACTTGAA BACCTCACCC TGGATCACCT TTGACCTCAA GAACAAGGAA CTGTCTGTAA AACGGCTTAC TCCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTCGAAACCT CACCCTGGCC CTTCAAGCGA AAACAGCAAA GTTCCATCAG GAAGTGAACC TCGTGGTGAT 600 700 800 900 950 GAGAGCCACT CAGCTCCACA AAAATTTCAC CTCTCAGCTG TGGCCACCCA 1000 GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTC AGCCCGCCAT 1100 CCTCCCCTAA GCTGATGCTC ACCTTGAAAC TGGAGAACAA GCAGGCAAAC GTGGCAGTGT CTGCTGACTC ACTCCGCACA CGTCCTGCTG CAATCCAACA 1050 1150 TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC 1200 CCTOTACCTG AGAGCAAAAT TCAGCAGGAG TGCAGAGACT GCTCCCAACC 1300 TGCTACTTGC TAGATGGAAT CCTCTTCATC TACGGAGTCA TCATCACAGC TGCAGGACCC CAACCAGCTC TACAATGAGC TCAATCTAGG GCGAAGACAG GAATATGACG TCTTGGAGAA GAAGCGGGCT CGCGATCCAG AGATGGGAGG CAAACAGCAG AGGAGGAGGA ACCCCCAGGA AGGCGTATAC AATGCACTGC AGAAACACAA GATGCCAGAA GCCTACAGTG AGATCGGCAC AAAAGGCGAC AGGCGGAGAG GCAAGGGGCA CGATGGCCTT TACCAGGACA GCCACTTCCA AGCAGTCCAG TTCGGGAACA GAAGAGAGAG AGAACGTTCA GAACTCACAA GGACCCTTGG GTTAAGAGCC CGCCCCAAAG GTGAAAGCAC CCAGCAGAGT AGCCAATCCT GTGCCAGCGT CTTCAGCATC CCCACTCTGT GGAGTCCATG GCCACCCAGT ACCAGCTCCC ACCTCTAA 1250 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 1700 1728 180066 Informacja dotycząca SEQ ID NO:2: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 1389 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:2: ATGAACOGGG GACTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTCC TGCAACTGCC 50 GCTCCTCCCA GCAGCCACIC AGCGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAC 100 GGCATACAC? CGAACTGACC TCTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA 150 TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC 200 CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAACCTGAA TCATCCCGCT GACTCAACAA 250 CAACCCTTTG GGACGAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG 300 ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTCTCAA GTCGAGGACC AGAAGGAGCA 350 GGTGCAATTC CTAGTCTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC 400 TTCAGCGGCA GACCCTGACC CTCACCTTGG AGACCCCCCC TGGTASTACC 450 CCCTCAGTGC AATGTAGCAG TCCAAGGGCT AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500 GACCCTCTCC CTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGCACAT 550 GCACTGTCTT GCACAACCAS AAGAAGCTSG ACTTCAAAAT ACACATCGTG 600 CTCCTACCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGCGGCA 650 ACAGCTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACCC 700 GCAGTCGCGA GCTCTGGTGG CAGGCCCAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750 TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC 800 CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGCCCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850 TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGCCI CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900 CTTGAAGCOA AAACAGCAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTCAT 950 GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGCGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA GCTCATCCTG AGCTTCAAAC TGCAGAACAA GGAGGCAAAG 1050 GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GCTGTGGCTG CTGAACCCTC AGGCCCCCAT 1100 CTGCCACTGT CTGCTGAGTG ACTCCGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150 TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGC TGCACGCGGA TCCGCAGCTC 1200 TCCTATATCC TGCATttCCAT CCTGTTTTTG TATGGTATTG TCCTTACCCT 1250 CCTCTACTGT CGACTCAAGA TCCAGCTCCG AAAGGCAGAC ATAGCCAGCC 1300 GTGAGAAATC AGATGCTGTC TACACGGGCC TGAACACCCG GAACCAGCAC 1350 ACATATGAGA CTCTGAAACA TGAGAAACCA CCCCAATAG 1389 180 066 Informacja dotycząca SEQ ID N O : 3: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) (B) (C) (D) Długość: 1599 par zasad Typ: kwas nukleinowy Niciowość: podwójna Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: SEO ID N O : 3: ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTCC TGCAACTGGC 50 GCTCCTCCCA CCAGCCACTC AGCGAAACAA AGTGCTCCTG GGCAAAAAAG 100 GGGATACAGT GGAACTGACC TCTACAGCTT CCCACAAGAA GAGCATACAA 150 TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC 200 CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAACCTGAA TGATCGCGCT GACTCAACAA 250 CAAGCCTTTC GCACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG 300 ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA 350 GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC 400 TTCAGGGGCA GAGCCTCACC CTGACCTTCG AGAGCCCCCC TCCTAGTAGC 450 CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500 GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT 550 CCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG 600 cTccTAccrr TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA 650 ACACGTCGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACACTTGAA AAGCTGACGG 700 GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750 TGCATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AAOGGGTTAC 800 CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850 TGCCCCAGCC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900 CTTGAACCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTCAT 950 GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG 1050 GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT 1100 GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150 TCAAGCTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC 1200 TGCTACCTGC TGGATGCAAT CCTCTTCATC TATGGTCTCA TTCTCACTGC 1250 CTTGTTCCTG AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG CGCAGAGCCC CCCGCGTACC 1300 AGCAGGGCCA GAACCAGCTC TATAACGAGC TCAATCTAGG ACGAAGAGAG 1350 GAGTACGATG TTTTGGACAA GAGACGTGCC CGGGACCCTG ACATGGCCGG 1400 AAAGCCGAGA AGGAAGAACC CTCAGGAAGG CCTGTACAAT GAACTGCAGA 1450 AAGATAAGAT GGCGGAGGCC TAGAGTGAGA TTGGGATGAA AGGCGAGCGC 1500 CGGAGGGGCA AGGGGCACGA TGGCCTTTAC CAGGGTCTCA GTACAGCCAC 1550 CAAGGACACC TACGACGCCC TTCACATGCA GCCCCTGCCC CCTCGCTAA 1599 180 066 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N O : 4: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) (B) (D) Długość: 575 aminokwasów Typ: aminokwas Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:4: Thr Gly Lye Leu His 305 Gln Leu Gln Lya Aan 325 Lys Leu Met Lau Ser 340 Lys Arg Glu Lys Pro 355 Gln Cyo Leu Leu Ser 370 Lye Val Leu Pro Thr 385 Cys Tyr Lau Leu Asp 405 Ala Leu Tyr Leu Arg 420 Aon Leu Gln Asp Pro 435 Arg Glu Glu Tyr Asp 450 Met Gly Gly Lys Gln 465 Asn Ala Leu Cln Lya 485 Thr Lys Gly Glu Arg 500 Aep Ser HIS Pho Gln 515 Gly Sar Clu La u Thr 530 Glu Sar Thr Gln Gln 555 Pro Thr Leu Trp Ser 565 Pro Phe Arg Bis Leu 10 Ala Thr Gln Cly Aon 25 Glu Leu Thr Cye Thr 40 Lya Aan Ser Aon Gln 55 Ser Thr Lys Gly 70 Leu Trp Aop Gln Gly 90 Clu Asp Ser Asp Thr 105 Val Gln Leu Leu Val 120 Leu Gln Gly Gln Ser 135 Ser Pro Ser Vł 1 Gln 150 Gly Lys Thr Leu Ser 170 Trp Thr Cyo Thr VAl 185 Asp Ile Val Val Leu 200 Lys Glu Gly Glu Gln 215 Glu Lye Leu Thr Gly 230 Ser ser Ser Lye Ser 250 Ser Val Lye Arg Val 265 Leu Pro Leu Kia Leu 260 Ser Gly Aan Leu Thr 295 0 Au Met Asn Arg Gly Val 1 5 Ala Leu Lau Pro Ala 20 Lys Gly Asp Thr Val 35 Ile Gln Pho His Trp 50 Gln Gly Sar Phe Leu 65 Asp Ser Arg Arg Ser 85 Lye Aan Leu Lyo Ile 100 Asp Gln Lys Glu Clu 115 Ser Asp Thr Hio Leu 130 Ser Pro Pro Gly Ser 145 Lye Asn Ile Gln Gly 165 Gln Asp Ser Gly Thr 180 Val Clu Phe Lyo Ile 195 Ser Ile Val Tyr Lys 210 Leu Ala Phe Thr Val 225 Gln Ala Glu Arg Ala 245 Lya Aan Lyo Glu Val 260 Gln Met Gly Lyo Lys 27S Pro Gln Tyr Ala Gly 290 Gln Glu Val Asn Leu 310 Leu Thr Cye Glu Val 330 Leu Lya Leu Glu Aon 345 Val Trp Val Lau Asn 360 Asp Ser Gly Gln Val 375 Trp Ser Thr Pro Val 390 Gly Ile Leu Phe Ile 410 Ala Lys Phe Ser Arg 425 Aan Cln Leu Tyr Aan 440 Val Leu Glu Lya Lys 455 Gln Arg Arg Arg Aan 470 Asp Lyo Ket Pro Glu 490 Arg Arg Cly Lye Gly 505 Ala Val Gln Pho Gly 520 Arg Thr Leu Gly Leu 535 Sar Ser Gln Ser Cys 550 Pro Trp Pro Pro Sar 570 Leu Leu Val Leu Cln 15 Lys Val Val Leu Gly 30 Ala Ser Gln Lys Lye 45 Ile Lyo Ile Lau Cly 60 Lyo Lau Aon Aep Arg 75 Aan Phe Pro Leu Ile 95 Tyr Ila Cys Glu val 110 Phe Gly Lau Thr Ala 125 Leu Thr Leu Thr Leu 140 Cye Arg Ser Pro Arg 155 Val Ser Gln Leu Glu 175 Leu Gln Asn Gln Lys 190 Ala Phe Gln Lys Ala 205 Val Glu Phe Ser Phe 220 Ser Gly Glu Leu Trp 235 Trp Ile Thr Phe Asp 255 Thr Gln Aep Pro Lys 270 Thr Leu Pro Gln Ala 285 Leu Ala Leu Glu Ala 300 Val Val Mat Arg Ala 315 Trp Gly Pro Thr Sor 335 Lys Glu Ala Lys Val 350 Pro Glu Ala Gly Moc 365 Leu Leu Clu Ser Asn 380 Bis Ala Aep Pro Lye 395 Tyr Cly Val Ile Ile 415 ser Ala Clu Thr Ala 430 Glu Lau Asn Lau Gly 445 Arg Ala Arg Asp Pro 460 Pro Gln Glu Gly Val 475 Ala Tyr Ser Glu Ile 495 Bis Asp Cly Leu Tyr 510 Asn Arg Arg Clu Arg 525 Arg Ala Arg Pro Lys 540 Ala Ser Val Pho Sor 565 Ser Sar Ser Cln Leu 575 Leu Lya Ser Asn Ala 80 Ile Glu Asn Glu Gly 160 Leu Lya Ser Pro Trp 240 Leu Leu Leu Lys Thr 320 Pro Sar Trp Ile Lau 400 Thr Ala Arg Glu Tyr 480 Gly Cln Clu Gly Ilo 560 180066 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N O : 5: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 462 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:5: Met Aen Arg Gly Val 1 5 Ala Leu Lau Pro Ala 20 Lya Gly Asp Thr val 35 Ile Gln Phe His Trp 50 Gln Gly Ser Phe Leu 65 Asp Ser Arg Arg Ser 85 Lye Aen Leu Lys Ile 100 Asp Gln Lya Glu Glu 115 Ser Asp Thr Hia Leu 130 Ser Pro Pro Gly Ser 145 Pro Phe Arg His Lau 10 Ala Thr Gln Gly Asn 25 Glu Lau Thr Cys Thr 40 Lya Asn Ser Asn Gln 55 Thr Lye Gly Pro Ser 70 Leu Trp Asp Gln Gly 90 Glu Asp Ser Asp Thr 105 Val Gln Leu Leu Val 120 Leu Gln Gly Gln Ser 135 Ser Pro Ser Val Gln 150 Lyo Asn Ile Gln Gly 165 Gln Asp Ser Gly Thr 180 Val Clu Phe Lye Ile 195 Ser Ile Val Tyr Lys 210 Leu Ala Phe Thr Val 225 Gln Ala Glu Arg Ala 245 Lyo Asn Lys Glu Val 260 Gln Met Gly Lyn Lyo 275 Pro Gln Tyr Ala Gly 290 Thr Gly Lya Lau His 305 Gln Leu Gln Lyo Asn 325 Lys Leu Kat Lau Sar 340 Lys Arg Glu Lye Pro 355 Gln Cye Lau Leu Sar 370 Lys Val Leu Pro Thr 385 cyo Tyr Ilo Lau Asp 405 Leu Leu Tyr Cye Arg 420 Ser Arg Glu Lys Ser 435 Gln Glu Thr Tyr Glu 450 Gly Lye Thr Lau Sar 170 Trp Thr Cys Thr Val 185 Asp Ile Val Val Lau 200 Lya Glu Gly Glu Gln 215 Glu Lys Leu Thr Gly 230 Ser Sar Ser Lya Ser 250 Ser Val Lyo Arg val 265 Leu Pro Lau His Lau 280 Ser Gly Asn Leu Thr 295 Gln Clu Val Asn Lau 310 Lau Thr Cye Glu Val 330 Lau Lye Lau Glu Asn 345 Val Trp Val Lau Asn 360 Asp Sar Gly Gln Va.l 375 Trp Ser Thr Pro Val 390 Ale Ile Lau Phe Lau 410 Leu Lys Ile Gln Val 425 Asp Ala Val Tyr Thr 440 Thr Leu Lya His Glu 455 Leu Lau Val Lau Cln Leu 15 Gly Lys Lya Val Val Lau 30 Ala Ser Gln Lye 45 Ilo Lyo Ile Leu 60 Lys Leu Aon Asp 75 Aan Phe Pro Leu Tyr Phe Leu Cye 155 Lyo Ser Gly Asn Arg Ala 80 Ile Ile 95 Ile Cyo Glu Val Glu 110 Gly Leu Thr Ala Asn 125 Thr Leu Thr Leu Glu 140 Arg Ser Pro Arg Gly 160 Val Ser Gln Leu Glu 175 Leu Gln Asn Gln Lys 190 Ala Phe Gln Lyo Ala 205 Val Glu Phe Sar Phe 220 ser Gly Glu Leu Trp 235 Trp Ilo Thr Pho Aep 255 Thr Gln Asp Pro Lys 270 Thr Leu Pro Cln Ala 285 Leu Ala Leu Glu Ala 300 Val Val Met Arg Ala 315 Trp Gly Pro Thr Ser 335 Lys Glu Ala Lys Val 350 Pro Glu Ale Cly Ket 365 Lau Lau Glu Sar Aan 380 His Ala Asp Pro Gln 395 Tyr Gly Ile Val Lau 415 Arg Lys Ala Asp Ile 430 Gly Leu Asn Thr Arg 445 Lys Pro Pro Gln 460 462 Leu Lys Sar Pro Trp 240 Lau Leu Leu Lys Thr 320 Pro Ser Trp Ile Lau 400 Thr Ala Aan 180066 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N O : 6: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 532 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:6: Met Ann Arg Gly Val 1 5 Ala Leu Leu Pro Ala 20 Lys Gly Asp Thr Val 35 Ile Gln Phe His Trp 50 Cln Gly Ser Phe Leu 6S Asp Ser Arg Arg Ser 85 Lys Aan Leu Lys Ile 100 Asp Gln Lys Glu Glu 115 Pro Phe Arg His Lau 10 Ala Thr Gln Gly Asn 25 Glu Leu Thr Cys Thr 40 Lys Asn Ser Asn Gln 55 Thr Lys Gly Pro Ser 70 Leu Trp Asp Gln Cly 90 Glu Asp Ser Asp Thr 105 Val Cln Leu Leu Val 120 Lau Lau Val Leu Gln 15 Lys Val Val Lau Gly 30 Ala Ser Gln Lys Lyo 45 Ile Lys Ile Leu Gly 60 Lys Leu Asn Asp Arg 75 Asn Phe Pro Leu Ile 95 Tyr Ile Cys Glu Val 110 Phe Gly Leu Thr Ala 125 Sar Asp Thr His Leu Leu Gln 130 135 Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro 145 150 Lys Aon Ila Gln Cly Gly Lyo 165 Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr 180 Val Glu Phe Lyo Ile Asp Ilo 195 Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu 210 215 Leu Ala Phe Thr Val Clu Lya 225 230 Gln Ala Glu Arg Ala Sar Ser 245 Lys Asn Lyo Glu Val Sar Val 260 Gln Met Gly Lyo Lyo Lau Pro 275 Pro Gln Tyr Ala Gly Sar Gly 290 295 Thr Gly Lys Lau His Gln Glu 305 310 G ln Leu Gln Lyo Asn Lau Thr 325 Lys Lau Kat Leu Sar Lau Lys 340 Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Gly Gln Sar Leu Thr 140 Ser Val Gln Cys Arg 155 Thr Lau Sar Val Ser 170 Cys Thr Val Lau Gln 185 Val Val Lau Ala Phe 200 Gly Glu Gln Val Clu 220 Leu Thr Gly Ser Gly 235 Ser Lys s e r Trp Ile 250 Lys Arg Val Thr Gln 265 Leu His Lau Thr Lau 280 Asn Leu Thr Leu Ala 300 Val Aon Leu Val Val 315 Cyo Glu Val Trp Gly 330 Lau Glu Asn Lys Glu 345 Val Lau Asn Pro Glu Gln Cys Lau Lau Sar Asp Ser 370 375 Lys Val Lau Pro Thr Trp Sar 385 390 Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile 405 Ala Leu Phe Lau Arg Val Lyo 420 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln 435 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Lau 450 455 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg 465 470 Glu Lau Gln Lys Asp Lys Met 485 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 500 Leu Sar Thr Ala Thr Lys Aop 515 Leu Pro Pro Arg 530 Oly Gln Val Lau 355 360 Leu Lyo Ser Asn Ala 80 Ile Glu Asn Leu Thr Leu Glu Sar Pro Arg Gly 160 Gln Leu Glu Lau 175 Asn Gln Lys Lys 190 Gln Lyo Ala Sar 205 Phe Ser Phe Pro Glu Lau Trp Trp 240 Thr Pha Asp Leu 255 Asp Pro Lyo Lau 270 Pro Gln Ala Leu 285 Lau Glu Ala Lyo Mat Arg Ala Thr 320 Pro Thr Sor Pro 335 Ala Lya Val Sar 350 Ala Gly Kat Trp 365 Lau Glu Sar Asn Ile 380 Ala Asp Pro Lys Lau 400 Cly Val Ilo Lau Thr 415 Ala Glu Pro Pro Ala 430 Lau Asn Lau Gly Arg Thr Pro Val Bis 395 Lau Phe Ile Tyr 410 Pha Sar Arg Ser 425 Leu Tyr Asn Glu 440 Asp Lys Arg Arg Cly 460 Lys Asn Pro Gln Glu 475 Ala Glu Ala Tyr Sar 490 Lyo Gly His Asp Gly 505 Thr Tyr Aop Ala Leu 520 445 Arg Aop Pro Glu Gly Leu Tyr Asn 480 Glu Ile Gly Mat 495 Leu Tyr Gln Gly 510 His Met Gln Ala 525 180066 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N O : 7: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C ) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:7: CGCGGGCTGA CCCTCCCCTC CACCAGCTTC CCC (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:8: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 50 par zasad B) Typ: kwas nukleinowy ( C ) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:8: CGCGGGGATC CGTCGTCCAC ACCCCGTCCA CCTCCCCGTC CTGCGCCTCA (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:9: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:9: CGCCGCCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC (2) Informacja dotyczącą SEQ ID NO:10: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) (B) (C) (D) Długość: 33 pary zasad Typ: kwas nukleinowy Niciowość: pojedyncza Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:10: CGCGTTGACG ACCAGCCAGT TCGGCAGCAC CAG (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:11: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 15 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:11: CGCGGGCGGC CCCTA 180066 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:12: (i) (ii) (xi) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 42 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa Typ cząsteczki: kwas nukleinowy Opis sekwencji: SEQ ID NO:12: CCCGGGCTCG TTATAGACCT GCTTCTGCCG CTGCTTCTTC TG (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:13: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 48 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:13: CGCGGGGACC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TTATCCGG (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:14: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) (B) (C) (D) Długość: 33 pary zasad Typ: kwas nukleinowy Niciowość: pojedyncza Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:14: CCCGGGCCGG CCACGCCTCC TCGCCAGCAC ACA (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:15: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 36 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:15: CGCGGGACGC CTTTCAGCCG TCCTCGCCAG CACACA 180066 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:16: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 33 pary zasad (B) (C) (D) Typ: kwas nukleinowy N i c i owość: pojedyncza Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:16: CGCGGCACGC GTGACCCTGA GATGGGCGGA AAO (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:17: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy C () Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:17: CCCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAOCCCAS CCC (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:18: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 26 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:18: CCCGGATCCC AGCATGGCCA CCTCTT (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:19: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 42 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:19: CGCGGCCCGG CCGCTTTAOT TATTACTGTT GACATGGTCG TT 180 066 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:20: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D ) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:20: GCGGGCGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAC (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:21: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 32 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:21: GCGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:22: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 31 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:22: TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:23: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 31 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:23: TTGTTGCTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A 180066 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:24: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) (B) (D) Długość: 171 aminokwasow Typ: aminokwas Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: aminokwas (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:24: Mat Glu Ele Sar Thr 5 Sar Gln Val Sar Pro 20 val Phe Val Aon Cys 35 Gly Thr Leu Leu Ser 50 Leu Asp Pro Arg Gly 65 Aop Lye Glu Ser Thr 85 Val Glu Leu Aop Pro 100 Ala Ile Thr Lau Leu 115 Glu Thr Gly Arg Leu 130 Aon Asp Gln Val Tyr 145 Sar Bis Lau Gly Gly 165 (2) Phe Lau Sar Gly Leu 10 Pha Lye Ile Pro Ile 25 Asn Thr Ser Ilo Thr 40 Asp Ile Thr Arg Lau 55 Ile Tyr Arg Cya Aon 70 Val Gln val Bis Tyr 90 Ala Thr Val Ala Gly 105 Leu Ala Leu Gly Val 120 Sar Gly Ala Ala Aop 135 Gln Pro Lau Arg Alp 150 Aon Trp Ala Arg Asn 170 Val Leu Ala Thr Leu 15 Glu Glu Leu Glu Asp 30 Trp Val Glu Gly Thr 45 Asp Leu Lys Arg 60 Gly Thr Asp Ilo Tyr 75 Arg Met Cyo Gln Ser 95 Ile Ile Val Thr A»p 110 Pha Cya Phe Ala Gly 125 Thr Gln Ala Leu Leu 140 Arg Asp Asp Ala Gln 155 Lya Leu Arg Val Ile Lya 80 Cys Val His Arg Tyr 160 Informacja dotyczącą SEQ ID NO:25: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 182 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: aminokwas (xi) Opis sekwencji : SEQ ID NO:25 : Ile Ile Leu 15 Aan Bis Leu Val Lys 30 Leu Thr Cys Asp Ala 45 Lys Met Ile Gly Phe 60 Ser Asn Ala Lyo Asp 80 Asn Lys Ser Lys Pro 95 Ile Glu Leu Asn Ala 110 Val Sar Ile Phe Val 125 Asp Gly Val Arg Gln 140 Ile Leu Met Glu Cln Gly Lyo 5 Lau Cln Gly Thr Lau 20 Val Tyr Asp Tyr Cln 35 Glu Ala Lys Asn Ile 50 Leu Thr Glu Asp Lys 65 Pro Arg Gly Met Tyr 85 Leu Gln Val Tyr Tyr 100 Ala Thr Ile Ser Gly 115 Leu Ala Val Gly Val 130 Gly Leu Ala Val Lau 10 Ala Gln Ser Ile Lye 25 Glu Asp Gly Ser Val 40 Thr Trp Phe Lys Asp 55 Lys Lys Trp Asn Leu 70 Gln Cys Lys Gly Ser 90 Arg Met Cys Gln Asn 105 Phe Leu Phe Ala Glu 120 Tyr Phe Ile Ala Gly 135 Sar Arg Ala Sar Asp 145 Gln Pro Leu Lya Arg 165 Asn Gla Leu Arg Arg 180 Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Lau Tyr 155 160 150 Arg Glu Asp Asp Cln Tyr Ser His Leu Gln Gly 170 175 Asn Gly Leu Gly Gly 75 Gln Cys Ile Cln 180066 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:26: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 220 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: aminokwas (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:26: Met Pro Gly Gly Leu 5 Leu Ser Tyr Ala Cya 20 Gly Gly Pro Pro Sar 35 Thr Cym Glu Asn Asn 50 Lau Gln Ser Asn Ile 65 Gly Thr Thr Gly Gln 85 Ala Cyn Thr Gly Cys 100 Cys Gly Thr Tyr Leu 115 Asp Met Gly Glu Gly 130 Ile Leu Leu Phe Cys 145 Lys Arg Trp Gln Asn 165 Glu Asp Glu Asn Leu 180 Tyr Glu Asp Ile Ser 195 Asn Leu His Ile Gly 210 (2) Glu Ala Leu Arg Ala 10 Leu Gly Pro Gly Cys 25 Lau Thr Val Asn Lau 40 Gly Arg Asn Pro Asn 55 Thr Trp Pro Pro Val 70 Lau Pho Pho Pro Glu 90 Gln val Ile Glu Asn 105 Arg Val Arg Asn Pro 120 Thr Lys Asn Arg Ile 135 Ala Val Val Pro Gly 150 Glu Lya Pho Gly Val 170 Tyr Glu Gly Lau Asn 185 Arg Gly Leu Gln Cly 200 Asp Ala Gln Leu Glu 215 Leu Pro Leu Leu Leu 15 Gln Ala Lau Arg Val 30 Cly Glu Glu Ala Arg 45 Ile Thr Trp Trp Pho 60 Pro Leu Gly Pro Gly 75 Val Asa Lyo Asn Thr 95 Asn Ile Leu Lyo Arg 110 Val Pro Arg Pro Pho 125 Ile Thr Ala Glu Gly 140 Thr Leu Leu Leu Phe 155 Asp Met Pro Asp Asp 175 Leu Asp Asp Cys Ser 190 Thr Tyr Gln Asp Val 205 Lya Pro 220 Pha Glu Lau Sar Gln 80 Gly Ser Leu Ile Arg 160 Tyr Ket Gly Informacja dotycząca SEQ ID NO:27: (i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 228 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: aminokwas (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:27 Met Ala Thr Leu Val Leu Ser Ser Het Pro Cys His Trp Leu Leu Phe 15 10 5 Leu Leu Leu Leu Phe Ser Gly Glu Pro Val Pro Ala Met Thr Ser Ser 30 25 20 A0p Leu Pro 35 His Pro Arg 50 Cys Tyr Thr 65 Ser Gln Gln Thr Gln Asn a Asp Asn 115 His Asn Val 130 Ser Thr Leu 145 Ile Leu Ile Phe Leu Leu His Thr Tyr 195 Ile val Thr 210 Pro Gly Gln 225 Leu Asn Phe Gln Gly 40 Phe Ala Ala Lys Lys 55 Asn His Ser Gly Ala 70 Pro Gln Glu Leu Val 85 Gly Ser Val Tyr Thr 100 Gly Ile Tyr Phe Cys 120 Thr Asp Ser Cys Gly 135 Asp Gln Lau Lya Arg 150 Gln Thr Leu Leu Ile 165 Leu Asp Lys Asp Asp 180 Glu Gly Leu Asn Ile 200 Leu Arg Thr Gly Glu 215 Glu Ser Pro Cys Ser Gln 45 Arg Ser Ser Mec Val 60 Leu Thr Trp Phe Arg 75 Ser Glu Glu Gly Arg 90 Leu Thr Ile Gln Asn 105 Lys Gln Lys Cys Asp 125 Thr Glu Leu Leu Val 140 Arg Asn Thr Lau Lyo 155 Ile Leu Phe Ile Ile 170 Gly Lys Ala Gly Ket 185 Asp Gln Thr Ala Thr 205 Val Lys Trp Ser val 220 Ile Trp Gln Lys Pha His Lys Arg Gly 80 Ile Val Gln 95 Ila Gln Tyr 110 Sar Ala Asn Leu Gly Phe Asp Gly Ile 160 Val Pro Ile 175 Glu Glu Asp 190 Tyr Glu Asp Gly Glu Hia 180066 FIG. 1a FIG. 1b Intensywność fluorescencji 180066 FIG. 2 FIG. 3 180066 FIG. 4a FIG. 4b 180066 FIG. 4c FIG. 4d FIG. 5a FIG. 5b 180066 F IG . 5 c 180066 FIG. 6a FIG.6b 180066 FIG. 7a FIG. 7b 180066 FIG. 8a FIG. 8b 180066 FIG. 9a FIG. 9b 180066 FIG. 9c FIG. 9d 180066 FIG. 10a FIG. 10b 180066 FIG. 10c FIG. 10d 180066 FIG. 10e RG. 10f FIG. 11a FIG. 11b FIG. 12 180066 FIG. 13a FIG. 13b 180066 FIG 14a FIG. 14b 180066 FIG. 15a FIG. 15b FIG. 15c 180066 FIG. 15d FIG. 15e 180066 FIG.16 (Seq. ID Ho: 24) 1 MEHSTFLSGL VLATLLSQVS PFKIPIEELE 51 DRVFVNCNTS LLSDITKLDL GKRILDPRGI YRCNGTDIYK ITWVEGTVGT DKESTVQVHY 101 PATVAGIIVT DVIATLLLAL RKCQSCVELD GVFCFAGHET GfeLSGAADTQ 151 PLRDRDDAQY ALLRNDQVYQ SHLGGNWARN K* FIG. 17 (Seq ID NO: 25) 1 MEQGKGLAVL ILAIILLQGT LAQSIKGNHL VKVYDYQEDG SVLLTCDAEA 51 KNITWFKDGK MIGFLTEDKK KWNLGSNAKD PRGMYQCKGS QNKSKPLQVY 101 YRMCQNCIEL NAATISGFLF AEIVSIFVLA VGVYFIAGQD (GVRQSRASDK 151 QTLLPNDQLY QPLKDREDDQ YSHLQGNQLR RN* FIG. 18 (Seq ID No: 26) 1 MPGGLEALRA LPLLLFLSYA CLGPGCQALR VEGGPPS LTV NLGEEARLTC 51 ENNGRNPNIT WWFSLQSNIT WPPVPLGPGQ GTTGQLFFPE VNKNTGACTG 101 CQVIENNILK RSCGTYLRVR NPVPRPFLDM GEGTXNRIIT AEGIILLFCA 151 W P G T L L L F R KRWQNEKFGV DHPDDYEDEN LYEGLNLDDC SHYEDISRGL 201 QGTYQDVGNL HIGDAQLEKP FIG. 19 3 (Seq ID No: 27) 1 MATLVLSSMP CHWLLFLLLL FSGEPVPAMT SSDLPLNFQG SPCSQIWQHP 51 RFAAKKRSSM VKFHCYTNHS GALTWFRKRG SQQPQELVSE EGRIVQTQNG 101 SVYTLTIQNI QYEDNGIYFC KQKCDSANHN VTDSCGTELL VIiGFSTLDQL 151 KRRNTLKDGI ILIQTLLIIL FIIVPIFLLL DKlDDGKAGME DQTATYEDIV TLRTGEVKWS VGEHPGQE*! 20 1 EDHTYEGLNI Fig. 20e Fig. 20d Fig. 28 Fig. 20c Fig. 20b Fig. 20a 180066 FIG. 21 FIG. 22 180066 FIG. 23 180066 FIG. 24 FIG. 25 180066 FIG. 26 FIG. 27 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.