Zastosowanie organizmów wskaźnikowych do

Toksykologia - dwiczenie 3 i 4
Zastosowanie organizmów wskaźnikowych do badania stopnia skażenia gleby i odpadów
Materiał badawczy (na jedną sekcję)


Gleba kontrolna wilgotna – 50 g na sekcję
Gleba skażona wilgotna – 50 g na sekcję
Zadanie 1. Ocena aktywności dehydrogenazowej gleby odpadowej, skażonej związkami
powierzchniowo czynnymi.
Materiały (na jedną sekcję)








Plastikowe pojemniki – 2 na sekcję
Probówki szklane (przynajmniej 20 ml objętości) – 6 na sekcję
Bufor Tris, c = 0,1 mol/l: rozpuścid 12,11 g tris-u w 600 ml wody destylowanej i doprowadzid pH
do 7,6 (HCl) i dopełnid wodą destylowaną do 1000 ml.
1 % TTC w buforze TRIS (roztwór jest stabilny przez tydzieo w temp 4ºC).
Trifenyloformazan (TF) do krzywej kalibracyjnej: stężenie koocowe 5 mg w 50 ml metanolu lub
acetonu.
krzywa kalibracyjna: Przygotowad 5 rozcieoczeo TF w metanolu w objętości 10 ml o stężeniach: 0
μg/ml , 3,33 μg/ml, 6,67 μg/ml, 16,7 μg/ml a 33,3 μg/ml.
Metanol lub aceton – 60 ml na sekcję
Probówki wirówkowe (15 ml lub więcej) lub bibuła filtracyjna, lejki (2 na sekcję lub więcej) oraz
dodatkowe probówki szklane (6 na sekcję)
Wykonanie
Zważ i umieśd w probówkach (w trzech powtórzeniach) po 2 g gleby kontrolnej oraz gleby
zanieczyszczonej z zadania 1. Zanotuj wagę porcji gleby, którą umieściłeś w probówce. Dodaj 2 ml
roztworu TTC do probówki. Zamknij probówki, dokładnie wymieszaj i inkubuj w 25ºC w ciemności
przez 24 h (dla grup OŚ – 7 dób).
Przeprowadź ekstrakcję. Do każdej probówki dodaj 10 ml acetonu i dobrze wymieszaj.
Następnie przenieś do probówek wirówkowych i odwiruj (co najmniej 4000 rpm, 10 min).
Alternatywnie – odfiltruj przez bibułę filtracyjną do nowych probówek szklanych.
Zmierz absorbancję dla długości fali 490 nm. Korzystając z krzywej kalibracyjnej wyznacz
stężenie TF.
Wyniki
Aktywnośd dehydrogenaz oblicz korzystając ze wzoru:
a
TF V 100
m t
Gdzie: a – aktywnośd dehydrogenazowa, µg/g s.m.,h
TF – stężenie TF, µg/l
V – objętośd roztworu (ekstrahent + roztwór TTC)
m – masa próbki, g s.m.
t – czas inkubacji, h
Ponadto wyznacz inhibicję aktywności dehydrogenazowej
I
Ak
Ab
Ak
100
Gdzie: I – inhibicja aktywności dehydrogenaz, %
Ak – absorbancja próby kontrolnej (średnia)
Ab – absorbancji próby badanej (średnia)
Zadanie 2. Wpływ zanieczyszczeo na procesy respiracji gleby
Materiały






Butelka 100 ml zakręcana – 3 na sekcję
Szklane naczynie (fiolka, kuweta) o pojemności co najmniej 7 ml – 3 na sekcję
Pipety szklane, łyżeczki
Roztwór NaOH 0,2 M – 20 ml na sekcję
Roztwór HCl 0,1 M – do miareczkowania, dla całej grupy
Kolby lub zlewki
Przygotowanie eksperymentu
W zakręcanych butelkach o pojemności 100 ml należy umieścid glebę zgodnie z instrukcjami
zawartymi w dwiczeniu 1 (sekcja „przygotowanie próbek gleby”). Przygotowad 3 szklane naczynka, w
których należy umieścid 1,0 M NaOH w objętości 5 ml.
Następnie naczynka należy umieścid w butelkach z glebą. Trzecie naczynko umieścid w pustej butelce,
będzie to próba ślepa. Butelki szczelnie zakręcid. Inkubowad w 25ºC przez 24 godziny (lub do
następnych cwiczeo).
Oznaczenie CO2
Następnie oznaczyd ilośd CO2. Szklane naczynie z roztworem NaOH należy wyjąd z butelki i przelad do
kolby lub małej zlewki. Dodad 2 cm3 BaCl2, dwie krople fenoloftaleiny i odmiareczkowad pozostały
NaOH kwasem solnym (0,5 M). Zapisad ilośd zużytego kwasu.
Wyniki
Szybkośd respiracji mikroorganizmów wyznaczyd z następującego wzoru:
R 0, 224
A B
, ml CO2 / g , d
2tm
Gdzie: A – ilośd HCl zużytego do odmiareczkowania próby ślepej
B – ilośd HCl zużytego do odmiareczkowania próby badanej
T – czas inkubacji, d
m – masa próbki gleby, g s.m.
Zadanie 3. Ocena toksyczności ekstraktu glebowego na rozwój roślin
Materiały (na jedną sekcję)
nasiona roślin: rzeżucha ogrodowa (Lepidium sativum), jęczmieo (Horodeum vulgare), żyto
zwyczajne, (Secale cereale), owies zwyczajny (Avena sativa);
cylindry miarowe 50 ml, 100 ml;
kolby 200 ml (2 sztuki), kolby 50 ml (3-4 sztuki);
łyżka do gleby, lejki (3-4 sztuki), wata, bibuła filtracyjna;
łaźnia wodna z funkcją wytrząsania (2 stanowiska na sekcję).
Wykonanie
Przygotowanie ekstraktu glebowego. Do dwóch osobnych, dużych kolb należy naważyd 50 g gleby
kontrolnej oraz 50 g gleby skażonej. Do obu kolb dodad 100 ml wody destylowanej, następnie kolbę z
glebą kontrolną oraz kolbę z glebą skażoną należy umieścid w łaźni wodnej, w temp 60°C oraz
wytrząsad przez 30 minut. Następnie wyjąd kolby z łaźni, odstawid na kilka minut i zlad ostrożnie
roztwór wodny do nowej kolbki używając do tego celu sitka, waty oraz lejka w celu wstępnej filtracji.
Przefiltrowad uzyskany ekstrakt tak aby otrzymad co najmniej 20 ml filtratu. Taka ilośd wystarczy na
wykonanie eksperymentu na dwóch rodzajach nasion.
Należy wykonad roztwory ekstraktu glebowego o stężeniach:
50%, 10%, 5%, 2,5%, 1,25%: 10 ml/próbę – w przypadku gdy uzyskaliśmy jedynie 20 ml filtratu.
100%, 50%, 10%, 5%, 2,5%: 10 ml/próbę – w przypadku gdy uzyskaliśmy 40 ml filtratu.
Za 100% roztwór należy przyjąd wyjściowy ekstrakt gleby.
Umieścid po 10 sztuk nasion w szalkach Petriego z bibułą lub watą nasączoną roztworami o różnych
stężeniach (10 ml). Do próby kontrolnej dodad 10 ml ekstraktu z gleby kontrolnej. Wszystkie płytki
należy umieścid w termostacie o temp. 25ºC w ciemności na okres 7 dni.
Wyniki
Po czasie inkubacji należy: policzyd nasiona które skiełkowały (podad jaki %) zmierzyd długośd korzeni
testowych.
Inhibicję wzrostu ocenid według wzoru:
Gdzie: Lk – średnia długośd korzeni kontrolnych, mm
Lt – średnia długośd korzeni testowych, mm
W sprawozdaniu należy zamieścid także krzywe: zależnośd procentu skiełkowanych nasion *N%+ - od
stężenia danego środka chemicznego - C*%+, oraz zależności inhibicji wzrostu – I*%+ od stężenia
danego środka chemicznego – C[%].