Toksykologia - dwiczenie 3 i 4 Zastosowanie organizmów wskaźnikowych do badania stopnia skażenia gleby i odpadów Materiał badawczy (na jedną sekcję) Gleba kontrolna wilgotna – 50 g na sekcję Gleba skażona wilgotna – 50 g na sekcję Zadanie 1. Ocena aktywności dehydrogenazowej gleby odpadowej, skażonej związkami powierzchniowo czynnymi. Materiały (na jedną sekcję) Plastikowe pojemniki – 2 na sekcję Probówki szklane (przynajmniej 20 ml objętości) – 6 na sekcję Bufor Tris, c = 0,1 mol/l: rozpuścid 12,11 g tris-u w 600 ml wody destylowanej i doprowadzid pH do 7,6 (HCl) i dopełnid wodą destylowaną do 1000 ml. 1 % TTC w buforze TRIS (roztwór jest stabilny przez tydzieo w temp 4ºC). Trifenyloformazan (TF) do krzywej kalibracyjnej: stężenie koocowe 5 mg w 50 ml metanolu lub acetonu. krzywa kalibracyjna: Przygotowad 5 rozcieoczeo TF w metanolu w objętości 10 ml o stężeniach: 0 μg/ml , 3,33 μg/ml, 6,67 μg/ml, 16,7 μg/ml a 33,3 μg/ml. Metanol lub aceton – 60 ml na sekcję Probówki wirówkowe (15 ml lub więcej) lub bibuła filtracyjna, lejki (2 na sekcję lub więcej) oraz dodatkowe probówki szklane (6 na sekcję) Wykonanie Zważ i umieśd w probówkach (w trzech powtórzeniach) po 2 g gleby kontrolnej oraz gleby zanieczyszczonej z zadania 1. Zanotuj wagę porcji gleby, którą umieściłeś w probówce. Dodaj 2 ml roztworu TTC do probówki. Zamknij probówki, dokładnie wymieszaj i inkubuj w 25ºC w ciemności przez 24 h (dla grup OŚ – 7 dób). Przeprowadź ekstrakcję. Do każdej probówki dodaj 10 ml acetonu i dobrze wymieszaj. Następnie przenieś do probówek wirówkowych i odwiruj (co najmniej 4000 rpm, 10 min). Alternatywnie – odfiltruj przez bibułę filtracyjną do nowych probówek szklanych. Zmierz absorbancję dla długości fali 490 nm. Korzystając z krzywej kalibracyjnej wyznacz stężenie TF. Wyniki Aktywnośd dehydrogenaz oblicz korzystając ze wzoru: a TF V 100 m t Gdzie: a – aktywnośd dehydrogenazowa, µg/g s.m.,h TF – stężenie TF, µg/l V – objętośd roztworu (ekstrahent + roztwór TTC) m – masa próbki, g s.m. t – czas inkubacji, h Ponadto wyznacz inhibicję aktywności dehydrogenazowej I Ak Ab Ak 100 Gdzie: I – inhibicja aktywności dehydrogenaz, % Ak – absorbancja próby kontrolnej (średnia) Ab – absorbancji próby badanej (średnia) Zadanie 2. Wpływ zanieczyszczeo na procesy respiracji gleby Materiały Butelka 100 ml zakręcana – 3 na sekcję Szklane naczynie (fiolka, kuweta) o pojemności co najmniej 7 ml – 3 na sekcję Pipety szklane, łyżeczki Roztwór NaOH 0,2 M – 20 ml na sekcję Roztwór HCl 0,1 M – do miareczkowania, dla całej grupy Kolby lub zlewki Przygotowanie eksperymentu W zakręcanych butelkach o pojemności 100 ml należy umieścid glebę zgodnie z instrukcjami zawartymi w dwiczeniu 1 (sekcja „przygotowanie próbek gleby”). Przygotowad 3 szklane naczynka, w których należy umieścid 1,0 M NaOH w objętości 5 ml. Następnie naczynka należy umieścid w butelkach z glebą. Trzecie naczynko umieścid w pustej butelce, będzie to próba ślepa. Butelki szczelnie zakręcid. Inkubowad w 25ºC przez 24 godziny (lub do następnych cwiczeo). Oznaczenie CO2 Następnie oznaczyd ilośd CO2. Szklane naczynie z roztworem NaOH należy wyjąd z butelki i przelad do kolby lub małej zlewki. Dodad 2 cm3 BaCl2, dwie krople fenoloftaleiny i odmiareczkowad pozostały NaOH kwasem solnym (0,5 M). Zapisad ilośd zużytego kwasu. Wyniki Szybkośd respiracji mikroorganizmów wyznaczyd z następującego wzoru: R 0, 224 A B , ml CO2 / g , d 2tm Gdzie: A – ilośd HCl zużytego do odmiareczkowania próby ślepej B – ilośd HCl zużytego do odmiareczkowania próby badanej T – czas inkubacji, d m – masa próbki gleby, g s.m. Zadanie 3. Ocena toksyczności ekstraktu glebowego na rozwój roślin Materiały (na jedną sekcję) nasiona roślin: rzeżucha ogrodowa (Lepidium sativum), jęczmieo (Horodeum vulgare), żyto zwyczajne, (Secale cereale), owies zwyczajny (Avena sativa); cylindry miarowe 50 ml, 100 ml; kolby 200 ml (2 sztuki), kolby 50 ml (3-4 sztuki); łyżka do gleby, lejki (3-4 sztuki), wata, bibuła filtracyjna; łaźnia wodna z funkcją wytrząsania (2 stanowiska na sekcję). Wykonanie Przygotowanie ekstraktu glebowego. Do dwóch osobnych, dużych kolb należy naważyd 50 g gleby kontrolnej oraz 50 g gleby skażonej. Do obu kolb dodad 100 ml wody destylowanej, następnie kolbę z glebą kontrolną oraz kolbę z glebą skażoną należy umieścid w łaźni wodnej, w temp 60°C oraz wytrząsad przez 30 minut. Następnie wyjąd kolby z łaźni, odstawid na kilka minut i zlad ostrożnie roztwór wodny do nowej kolbki używając do tego celu sitka, waty oraz lejka w celu wstępnej filtracji. Przefiltrowad uzyskany ekstrakt tak aby otrzymad co najmniej 20 ml filtratu. Taka ilośd wystarczy na wykonanie eksperymentu na dwóch rodzajach nasion. Należy wykonad roztwory ekstraktu glebowego o stężeniach: 50%, 10%, 5%, 2,5%, 1,25%: 10 ml/próbę – w przypadku gdy uzyskaliśmy jedynie 20 ml filtratu. 100%, 50%, 10%, 5%, 2,5%: 10 ml/próbę – w przypadku gdy uzyskaliśmy 40 ml filtratu. Za 100% roztwór należy przyjąd wyjściowy ekstrakt gleby. Umieścid po 10 sztuk nasion w szalkach Petriego z bibułą lub watą nasączoną roztworami o różnych stężeniach (10 ml). Do próby kontrolnej dodad 10 ml ekstraktu z gleby kontrolnej. Wszystkie płytki należy umieścid w termostacie o temp. 25ºC w ciemności na okres 7 dni. Wyniki Po czasie inkubacji należy: policzyd nasiona które skiełkowały (podad jaki %) zmierzyd długośd korzeni testowych. Inhibicję wzrostu ocenid według wzoru: Gdzie: Lk – średnia długośd korzeni kontrolnych, mm Lt – średnia długośd korzeni testowych, mm W sprawozdaniu należy zamieścid także krzywe: zależnośd procentu skiełkowanych nasion *N%+ - od stężenia danego środka chemicznego - C*%+, oraz zależności inhibicji wzrostu – I*%+ od stężenia danego środka chemicznego – C[%].