1. Opracowanie metod krótkoterminowych hodowli komórkowych w
advertisement
Opracowanie metod krótkoterminowych hodowli komórkowych w celu przeżyciowego diagnozowania genetycznej płci ryb. dr Konrad Ocalewicz Katedra Ichtiologii Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie Wprowadzenie Wykonanie testów diagnostycznych na rybach, które następnie mają być wykorzystane w badaniach laboratoryjnych, pracach selekcyjnych i innych zabiegach wymaga opracowania technik przeżyciowego pobierania materiału badawczego, na przykład fragmentów płetw, tkanki mięśniowej, krwi, etc. Po odpowiednim pobraniu materiału biologicznego, ryby w dobrej kondycji powinny wrócić do akwariów, basenów lub stawów hodowlanych. W wielu dziedzinach badawczych, istotą problemu jest utrzymanie „przy życiu” komórek pobranych z badanego organizmu poza tym organizmem, w warunkach laboratoryjnych. W przypadku realizowanego w niniejszym projekcie zadania badawczego, celem było opracowanie techniki przeżyciowego poboru krwi z pstrągów tęczowych, hodowli limfocytów izolowanych z pobranej krwi w warunkach laboratoryjnych, a następnie uzyskanie z hodowanych metodami in vitro komórek preparatów chromosomowych do celów diagnostyki genetycznej płci badanych ryb. Metody poboru krwi, izolacji limfocytów oraz warunki utrzymywania żywych komórek w warunkach laboratoryjnych (in vitro) są opracowane dla wielu gatunków organizmów stałocieplnych. Dostępne odczynniki do badań in vitro, w większości przypadków są produkowane z myślą o hodowli komórek ssaczych. Badania w niniejszym zadaniu dotyczyły więc dostosowania istniejących na rynku odczynników i aparatury do hodowli komórek zwierząt zmienno cieplnych do jakich należą ryby. Materiał i metody 1. Pobieranie krwi. Krew od ryb pobierana była z ogonowych naczyń krwionośnych przy pomocy tradycyjnych strzykawek (2 ml) i igieł. Założyliśmy, że z jednej ryby musimy pobrać około 4 ml krwi. Taka objętość wydaje się wystarczająca do izolacji limfocytów- komórek, które będą przeznaczone do dalszej hodowli. Wybraliśmy 20 pstrągów tęczowych o wymiarze 500 g. Pomiędzy 21.04.2007 i 15.06.2007 krew z ryb pobieraliśmy 6 razy w ciągu starając się aby od jednej ryby nie pobierać krwi częściej niż raz na 3 tygodnie. 4 ml krwi były konfekcjonowane w dwóch probówkach typu eppendorf o pojemności 2 ml. 2. Izolacja limfocytów. Mechaniczna izolacja limfocytów okazała się najskuteczniejszą metodą frakcjonowania tych komórek. Frakcję limfocytów uzyskaliśmy wirując 2 ml krwi przy prędkości 1000 obrotów na minutę i temperaturze 10oC. Niepowodzeniem okazały się próby frakcjonowania limfocytów w przy pomocy odczynników chemicznych. Po zwirowaniu krwi pełnej w wyżej wymienionych warunkach, frakcja limfocytów jako najlżejsza znajdowała się na powierzchni. Przeniesienie tylko i wyłącznie limfocytów, bez jakiegokolwiek udziału krwinek czerwonych okazało się niemożliwe. 3. Medium hodowlane. Z dostępnych na rynku pożywek (mediów hodowlanych) do hodowli komórek w warunkach laboratoryjnych używaliśmy medium kompletnego zawierającego w swoim składzie min. surowicę bydlęcą, czynniki powodujące podziały komórek oraz antybiotyki (PB Max) oraz medium, które przygotowaliśmy sami w oparciu o wyżej wymienione komponenty, ale kupowane oddzielnie. 4. Warunki hodowli. Temperatura: hodowle prowadziliśmy w temperaturach: 17oC, 19oC, 20 oC, 21oC i 25oC. Długość hodowli: Frakcja limfocytów po wprowadzeniu do 8 ml medium hodowlanego była inkubowana przez 5, 6 i 7 dni w wyżej wymienionych warunkach termicznych. Po tym okresie, do hodowli dodano 0,05ml 0,2% roztworu kolchicyny w celu zatrzymania podziałów komórkowych. Zawiesiny komórek były następnie wirowane, supernatant usuwany, a w jego 2 miejsce wprowadzano 0, 075M roztwór KCl w celu hypotonizacji komórek. Następnie komórki były utrwalane w roztworze metanolu i kwasu octowego (3:1). 20 μl zawiesiny utrwalonych komórek umieszczano na szkiełku mikroskopowym. Preparaty analizowano pod mikroskopem w świetle białym, metodą kontrastu fazowego, powiększenie 10X i 60X. Wyniki Wystarczającą ilość limfocytów do założenia hodowli komórkowej znajdowała się już w 2 ml krwi. Niestety problemem okazało się przeniesienie do probówek z pożywką samych limfocytów bez erytrocytów. Hodowle z domieszką czerwonych krwinek charakteryzowały się mniejszym indeksem mitotycznym (limfocyty nie dzieliły się tak często w obecności erytrocytów). Krew pobierana od tych samych osobników częściej niż raz na 3 tygodnie zawierała mniej limfocytów i metody hodowli in vtro w takich przypadkach były nieskuteczne. Wykazano też międzyosobnicze różnice w liczbie limfocytów i ich zdolności do podziałów. Komórki z różnych osobników hodowane w tych samych warunkach, charakteryzowały się bardzo różną liczbą podziałów, a co za tym idzie różna była skuteczność takich hodowli. Zdecydowanie lepszym medium hodowlanym okazało się medium PB Max zawierające już w swoim składzie elementy niezbędne do prawidłowo funkcjonowania limfocytów. Za optymalne warunki do prowadzenia hodowli limfocytów z krwi pstrągów tęczowych, w których to warunkach, komórki przeżywają i się dzielą, uważamy temperaturę 19oC lub 20 oC i długość prowadzenia hodowli; 7 dni. Niezbędnym do prawidłowego wzrostu komórek okazało się dodanie do medium hodowlanego surowicy krwi pstrągów uzyskanych podczas frakcjonowanie komórek. Czas hypotonizacji został oszacowany na 25 minut. Liczba komórek w stadium metafazy po podaniu roztworu kolchicyny była znacznie wyższa niż w przypadku podania tego samego roztworu bezpośrednio rybom (metoda in vivo). W kilku przypadkach, pomimo spełnienia wyżej wymienionych warunków, nie zaobserwowano 3 podziałów limfocytów. Prawdopodobnie cechy osobnicze lub kondycji ryb, mogły mieć wpływ na liczbę limfocytów i ich zdolność do podziałów. Konkluzja: Technika otrzymywania preparatów chromosomowych z limfocytów pstrąga tęczowego frakcjonowanych i hodowanych w warunkach laboratoryjnych okazała się skuteczną w stopniu wystarczającym do przeprowadzania badań diagnostycznych tych ryb na podstawie obrazu chromosomowego. 4
