1. Opracowanie metod krótkoterminowych hodowli komórkowych w

advertisement
Opracowanie metod krótkoterminowych hodowli komórkowych w celu przeżyciowego diagnozowania genetycznej
płci ryb.
dr Konrad Ocalewicz
Katedra Ichtiologii Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie
Wprowadzenie
Wykonanie testów diagnostycznych na rybach, które następnie mają być
wykorzystane w badaniach laboratoryjnych, pracach selekcyjnych i innych zabiegach
wymaga opracowania technik przeżyciowego pobierania materiału badawczego, na przykład
fragmentów płetw, tkanki mięśniowej, krwi, etc. Po odpowiednim pobraniu materiału
biologicznego, ryby w dobrej kondycji powinny wrócić do akwariów, basenów lub stawów
hodowlanych. W wielu dziedzinach badawczych, istotą problemu jest utrzymanie „przy
życiu” komórek pobranych z badanego organizmu poza tym organizmem, w warunkach
laboratoryjnych. W przypadku realizowanego w niniejszym projekcie zadania badawczego,
celem było opracowanie techniki przeżyciowego poboru krwi z pstrągów tęczowych, hodowli
limfocytów izolowanych z pobranej krwi w warunkach laboratoryjnych, a następnie
uzyskanie z hodowanych metodami in vitro komórek preparatów chromosomowych do celów
diagnostyki genetycznej płci badanych ryb.
Metody poboru krwi, izolacji limfocytów oraz warunki utrzymywania żywych
komórek w warunkach laboratoryjnych (in vitro) są opracowane dla wielu gatunków
organizmów stałocieplnych. Dostępne odczynniki do badań in vitro, w większości
przypadków są produkowane z myślą o hodowli komórek ssaczych. Badania w niniejszym
zadaniu dotyczyły więc dostosowania istniejących na rynku odczynników i aparatury do
hodowli komórek zwierząt zmienno cieplnych do jakich należą ryby.
Materiał i metody
1. Pobieranie krwi.
Krew od ryb pobierana była z ogonowych naczyń krwionośnych przy pomocy
tradycyjnych strzykawek (2 ml) i igieł. Założyliśmy, że z jednej ryby musimy pobrać około 4
ml krwi. Taka objętość wydaje się wystarczająca do izolacji limfocytów- komórek, które będą
przeznaczone do dalszej hodowli. Wybraliśmy 20 pstrągów tęczowych o wymiarze 500 g.
Pomiędzy 21.04.2007 i 15.06.2007 krew z ryb pobieraliśmy 6 razy w ciągu starając się aby od
jednej ryby nie pobierać krwi częściej niż raz na 3 tygodnie. 4 ml krwi były konfekcjonowane
w dwóch probówkach typu eppendorf o pojemności 2 ml.
2. Izolacja limfocytów.
Mechaniczna izolacja limfocytów okazała się najskuteczniejszą metodą frakcjonowania
tych komórek. Frakcję limfocytów uzyskaliśmy wirując 2 ml krwi przy prędkości 1000
obrotów na minutę i temperaturze 10oC. Niepowodzeniem okazały się próby frakcjonowania
limfocytów w przy pomocy odczynników chemicznych. Po zwirowaniu krwi pełnej w wyżej
wymienionych warunkach, frakcja limfocytów jako najlżejsza znajdowała się na powierzchni.
Przeniesienie tylko i wyłącznie limfocytów, bez jakiegokolwiek udziału krwinek czerwonych
okazało się niemożliwe.
3. Medium hodowlane.
Z dostępnych na rynku pożywek (mediów hodowlanych) do hodowli komórek w warunkach
laboratoryjnych używaliśmy medium kompletnego zawierającego w swoim składzie min.
surowicę bydlęcą, czynniki powodujące podziały komórek oraz antybiotyki (PB Max) oraz
medium, które przygotowaliśmy sami w oparciu o wyżej wymienione komponenty, ale
kupowane oddzielnie.
4. Warunki hodowli.
Temperatura: hodowle prowadziliśmy w temperaturach: 17oC, 19oC, 20 oC, 21oC i 25oC.
Długość hodowli: Frakcja limfocytów po wprowadzeniu do 8 ml medium hodowlanego była
inkubowana przez 5, 6 i 7 dni w wyżej wymienionych warunkach termicznych. Po tym
okresie, do hodowli dodano 0,05ml 0,2% roztworu kolchicyny w celu zatrzymania podziałów
komórkowych. Zawiesiny komórek były następnie wirowane, supernatant usuwany, a w jego
2
miejsce wprowadzano 0, 075M roztwór KCl w celu hypotonizacji komórek. Następnie
komórki były utrwalane w roztworze metanolu i kwasu octowego (3:1). 20 μl zawiesiny
utrwalonych komórek umieszczano na szkiełku mikroskopowym. Preparaty analizowano pod
mikroskopem w świetle białym, metodą kontrastu fazowego, powiększenie 10X i 60X.
Wyniki
Wystarczającą ilość limfocytów do założenia hodowli komórkowej znajdowała się już
w 2 ml krwi. Niestety problemem okazało się przeniesienie do probówek z pożywką samych
limfocytów bez erytrocytów. Hodowle z domieszką czerwonych krwinek charakteryzowały
się mniejszym indeksem mitotycznym (limfocyty nie dzieliły się tak często w obecności
erytrocytów). Krew pobierana od tych samych osobników częściej niż raz na 3 tygodnie
zawierała mniej limfocytów i metody hodowli in vtro w takich przypadkach były
nieskuteczne. Wykazano też międzyosobnicze różnice w liczbie limfocytów i ich zdolności
do podziałów. Komórki z różnych osobników hodowane w tych samych warunkach,
charakteryzowały się bardzo różną liczbą podziałów, a co za tym idzie różna była skuteczność
takich hodowli. Zdecydowanie lepszym medium hodowlanym okazało się medium PB Max
zawierające już w swoim składzie elementy niezbędne do prawidłowo funkcjonowania
limfocytów. Za optymalne warunki do prowadzenia hodowli limfocytów z krwi pstrągów
tęczowych, w których to warunkach, komórki przeżywają i się dzielą, uważamy temperaturę
19oC lub 20 oC i długość prowadzenia hodowli; 7 dni. Niezbędnym do prawidłowego wzrostu
komórek okazało się dodanie do medium hodowlanego surowicy krwi pstrągów uzyskanych
podczas frakcjonowanie komórek. Czas hypotonizacji został oszacowany na 25 minut. Liczba
komórek w stadium metafazy po podaniu roztworu kolchicyny była znacznie wyższa niż w
przypadku podania tego samego roztworu bezpośrednio rybom (metoda in vivo). W kilku
przypadkach, pomimo spełnienia wyżej wymienionych warunków, nie zaobserwowano
3
podziałów limfocytów. Prawdopodobnie cechy osobnicze lub kondycji ryb, mogły mieć
wpływ na liczbę limfocytów i ich zdolność do podziałów.
Konkluzja:
Technika otrzymywania preparatów chromosomowych z limfocytów pstrąga
tęczowego frakcjonowanych i hodowanych w warunkach laboratoryjnych okazała się
skuteczną w stopniu wystarczającym do przeprowadzania badań diagnostycznych tych ryb na
podstawie obrazu chromosomowego.
4
Download
Random flashcards
123

2 Cards oauth2_google_0a87d737-559d-4799-9194-d76e8d2e5390

ALICJA

4 Cards oauth2_google_3d22cb2e-d639-45de-a1f9-1584cfd7eea2

Motywacja w zzl

3 Cards ypy

Prace Magisterskie

2 Cards Pisanie PRAC

słowka

2 Cards kksenia.kot1997

Create flashcards