Elektroforeza agarozowa
advertisement
Elektroforeza agarozowa Technikę elektroforezy agarozowej wykorzystuje się do określania jakości ekstraktów DNA i całkowitego RNA. Oceny jakościowej ekstraktów DNA dokonuje się w 0,6% żelu agarozowym a integralność całkowitego RNA ocenia się w 1-1,2% żelach agarozowych. Cząsteczki kwasów nukleinowych, w buforach o pH zbliżonym do neutralnego, posiadają ładunek ujemny i dlatego w żelach elektroforetycznych migrują zawsze w kierunku anody [elektrody (+)]. Uzyskanie poprawnego rozdziału elektroforetycznego wymaga zastosowania odpowiednich warunków prądowych. W praktyce stosuje się napięcie 5 do 8 V/cm, w odniesieniu do odległości pomiędzy elektrodami. Zastosowanie zbyt wysokiego napięcia może spowodować podniesienie temperatury żelu, efektem czego będzie jego roztopienie oraz denaturacja DNA i RNA. Integralność wyekstrahowanego całkowitego RNA i DNA można jednocześnie sprawdzić elektroforetycznie w 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Przygotowanie żelu agarozowego rozpoczyna się od sporządzenia naważki 0,3g agarozy, którą wprowadza się do 30ml 1 buforu TAE. Bufor roboczy (1x stężony) TAE należy wcześniej przygotować z 50x stężonego (242g Tris o pH 8.3; 57,1 ml lodowatego kwasu octowego (CH3COOH); 18,6 g EDTA lub 100ml 0,5M EDTA o pH 8,0). Bufor roboczy należy przechowywać w 4 oC. Agarozę rozpuszcza się w łaźni wodnej lub kuchence mikrofalowej (czas inkubacji dobrać empirycznie do mocy). Uzyskany roztwór rozpuszczonej agarozy uzupełnić wodą do końcowej objętości 30ml. Po schłodzeniu roztworu do około 60oC dodać 20l bromku etydyny (Cp=1mg/ml, Ck=0,67g/ml). Końcowe stężenie bromku etydyny w żelu powinno wynosić około 0,5µg/ml. Tak sporządzony roztwór agarozy wlewa się na płytkę. Grubość żelu agarozowego powinna wynosić około 5mm. Zestalony żelu wprowadzić do aparatu elektroforetycznego i wlać schłodzony, 1x bufor TAE. Ilość dodanego buforu powinna przekraczać o około 1mm poziom żelu. Aparat do elektroforezy wraz z osprzętem mającym bezpośredni kontakt z żelem agarozowym należy wcześniej, przed wykonaniem elektroforezy, dwukrotnie przepłukać 0,1M NaOH, aby pozbyć się RNaz. Przygotowanie próbek do elektroforezy: 1. RNA Przygotowanie próbki polega na zmieszaniu 10l ekstraktu RNA z 1l 20% SDS oraz 9l mieszaniny buforu obciążającego i buforu denaturującego zmieszanych w stosunku 1:4 (skład buforu obciążającego: 0,05% w/v błękit bromofenolowy i 0,05% w/v ksylen cjanolowy zmieszane w stosunku 1:1 oraz 40% w/v sacharoza; skład buforu denaturującego: 95% formamid w 20mM EDTA). Następnie mieszaninę ogrzewa się w 70oC przez 10 minut w celu rozdzielenia się RNA. Po inkubacji próbki schładza się w lodzie i po wymieszaniu wprowadza się do studzienek w żelu przenosząc próbki z probówek umieszczonych w lodzie. 2. DNA Próbkę DNA można wymieszać z buforem obciążającym w stosunku 1:1 (stosunek może przyjąć wartości od 1:1 do 5:1). Do obciążania próbek DNA można wykorzystać bufor o następującym składzie: 0,05% w/v błękit bromofenolowy i 0,05% w/v ksylen cjanolowy zmieszane w stosunku 1:1 oraz 40% w/v sacharoza. Minimalna ilość DNA, którą widać na żelu w postaci prążka to 20 ng. Ilość DNA w prążku nie powinna przekraczać 200 ng, ponieważ obserwuje się przeładowanie studzienki. Rozdział elektroforetyczny przeprowadza się w temperaturze pokojowej, w środowisku 1x buforu TAE, przy stałym napięciu wynoszącym 50V-90V do momentu przebycia przez barwnik zawarty w buforze obciążającym 2/3 długości żelu. Oceny jakościowej uzyskanych rozdziałów elektroforetycznych wybarwianych bromkiem etydyny dokonuje się w transluminatorze UV. Zakłada się, że ilość wyizolowanego RNA z materiału biologicznego jest większa niż 100ng, gdyż w takim przypadku jakość ekstraktu można sprawdzić elektroforetycznie [McPherson i wsp., 1995]. Kiedy całkowity RNA podczas ekstrakcji nie uległ degradacji, to w rozdziale elektroforetycznym są wyraźnie widoczne zazwyczaj dwa prążki 28S i 18S rRNA. Smuga pomiędzy tymi prążkami świadczy o obecności mRNA (1-5% całkowitego RNA), a poniżej 18S wskazuje na jego degradację. Natomiast obecność prążka powyżej 28S wynika z zanieczyszczenia ekstraktu RNA genomowym DNA, który można wyeliminować traktując próbkę DNazą wolną od RNaz. Prążek rmigrujący jako pierwszy stanowi frakcja tRNA oraz niskocząsteczkowe RNA. Intensywność świecenia frakcji 28S powinna być dwa razy intensywniejsza niż frakcji 18S. Zachowanie tej zależności świadczy o niewystąpieniu degradacji wyizolowanego materiału. RNA jest uznawane za wysokiej jakości, gdy stosunek pasm (prążków) 28S : 18S jest równy około 2.0 i większy. Rys. 1. Rozdział elektroforetyczny ekstraktów całkowitego RNA w 1,2% żelu agarozowym wybarwionym bromkiem etydyny.
