Easy MolBio Size Determination
advertisement
Zestaw dydaktyczny Nr kat. DY78 EasyMolBio DNA Size Oetermination Wersja zestawu: 1.2012 Zestaw do wyznaczania wielkości molekularnej DNA ZASADA EKSPERYMENTU Zestaw dydaktyczny przeprowadzenie fragmenty EasyMolBio elektroforezy DNA o nieznanej molekularnej wielkości, analizowanych DNA elektroforezie agarozowej Mierząc elektroforetyczną) krzywą wzorcową, analizowanej rt D Detarmination a następnie poddaje drogę każdego która Size umożliwia próbek zawierających wyznaczenie wielkości częsteczek dsDNA. Oprócz badanych próbek (markery DNA). DNA w żelu agarozowym się także wzorce wielkości migracji z fragmentów umożliwi w markera następnie żelu DNA (ruchliwość DNA wyznacza wyznaczenie czasteczki DNA. A GDAŃSK się wielkości BURT S.A., ul. Trzy Lipy 3/1.38, 80-172 Gdańsk, www.dnagdansk.com T: +48 58 739 61 50 F: +48 58 739 61 51 E: [email protected] Nr kat. DYl8 1. PRZEBIEG ĆWICZENIA Rozdział elektroforetyczny próbek DNA należy prowadzić w 2% żelu agarozowym. Przed przystąpieniem TAE poprzez do wykonania żelu należy przygotować 50-krotne przygotowania rozcieńczenie 1000 ml buforu Każda grupa laboratoryjna tx stężony bufor 50x TAE. Na przykład dla tx TAE należy do naczynia o odpowiedniej sox TAE i 980 wielkości nalać 20 mt buforu ml wody. przygotowuje dla siebie jeden żel 2% w nastęujący sposób: 1 g agarozy należy rozpuścić w 50 ml buforu roztwór do całkowitego rozpuszczenia agarozy rx TAE podgrzewając (mikrofalówka lub palnik laboratoryjny). Ostudzić żel agarozowy do temperatury UWAGA!!! Wszystkie operacje rękawiczkach nitrylowych, ok. 60°C. od tego momentu należy wykonywać w stanowiących ochronę przed bromkiem etydyny (czynnik rakotwórczy). Dodać 5 l roztworu bromku etydyny o stężeniu 1 mg/mI. Wymieszać i wylać ostrożnie osadzonym odpowiednio było pęcherzyków schłodzonym powietrza. do tacki do wylewania żeli z Należy zwrócić uwagę, aby w żelu nie Pęcherzyki mogą być spowodowane zbyt żelem - taki żel należy rozpuścić ponownie. Po zastygnięciu studzienek. żel agarozowy grzebieniem. żelu wyjąć grzebień w taki sposób, aby Wstawić żel do komory aparatu do elektroforezy tx TAE tak, aby całkowicie wypełnił komory elektrodowe nie uszkodzić i zalać buforem i pokrył powierzchnię żelu. Każda grupa laboratoryjna próbkami M100-500 losuje po jednej próbce DNA (1, 2, 3). Jedna osoba z grupy powinna i 3 analizowane próbki, natomiast z trzech woreczków z nanieść na żel marker druga osoba z grupy powinna nanieść te same 3 analizowane próbki oraz marker M100-1000. Nanoszenie na żel należy wykonać w następujący sposób: - 10 l markera DNA (M100-500 gotowy do użycia) - 2 l buforu obciążającego 6x Green i po 10 l trzech losowo wybranych próbek DNA (oznaczenie próbek DNA od A do S) - 10 l markera DNA (M100-1000 gotowy do użycia) Rozdział należy prowadzić przez 0,5-1 h, przy napięciu ok. 5-10 V/cm długości żelu (60-120 V). Po zakończonej transiluminatora. który interkaluje elektroforezie żel należy analizować w świetle Analiza DNA w żelu jest możliwa dzięki bromkowi z dsDNA i RNA, tworząc kompleksy fluoryzujące UV etydyny, w świetle UV (około 300 nm). UWAGAI Promieniowanie UV jest szkodliwe dla skóry i oczu. www.dnagdansk.com --... ~I t ~ GDA~SK ~ Detekcję także kwasów poprzez nukleinowych inkubację zakończonej elektroforezie. skonstruowana w żelu agarozowym żelu w roztworze Dzięki specjalnemu bardzo maŁej ilości umieszczenie go bezpośrednio ~ W świetle UV można porównując drogę migracji prążków etydyny po DNA barwionego żelu z tacki. Jednak w przypadku DNA zaleca się wyjęcie żelu z tacki i na filtrze transiluminatora. wstępnie oszacować prążków wielkości analizowanych fragmentów wielkości DNA. Jeżeli np. fragment pomiędzy prążkami markera 200 DNA do drogi odpowiednich w markerze wysokości dopiero rodzajowi materiaŁu, z którego jest tacka do żelu możliwa jest obserwacja bromkiem etydyny bez potrzeby wyjmowania rozdziaŁów można przeprowadzić bromku i 300 DNA migruje pz, można na wstępnie oszacować, że jego wielkość wynosi ok. 250 pz. ~ Wielkość liniowych dokłednościę to wykres fragmentów zależności można mierzyć ochronnych nieprzepuszczającą linijki lub promieni z umieszczony przedstawiona Rys. 1. Przykładowy stabilnie znanych bezpośrednio UV) lub najlepiej z większą Krzywa kalibracyjna fragmentów DNA a pokrywą lub (w transiluminatora po zrobieniu na statywie w żelu na transiluminatorze zestaw do archiwizacji nad transiluminatorem trzymany wyznaczyć w żelu. Drogę migracji przezroczystą tego celu można użyć specjalny cyfrowy długością tych fragmentów przy pomocy także krzywej kalibracyjnej. pomiędzy dŁugościami dróg migracji okularach DNA można poprzez wykreślenie zdjęcia żelu (do żeli, aparat cyfrowy ewentualnie w ręku). PrzykŁadowa krzywa aparat kalibracyjna jest na Rys. 1. wykres zaLeżności wieLkości Liniowego DNA od długości drogi migracji w żeLu agarozowym. E 500 :! 400 i E 300 ~ "l} 200 a. ~ co ~ 100 ł o o 30 20 10 droga mlgr.c' ~ Wykres ten można wykorzystać 40 50 [mm] do określania wielkości liniowego fragmentu DNA o nieznanej masie na podstawie jego drogi migracji w tym samym żelu, co fragmenty ~ DNA, które posŁużyŁy do wyznaczenia krzywej kalibracyjnej. Roztwór do nanoszenia migrują w żelu odpowiadającej na żel 6x Green zawiera dwa barwniki, agarozowaym: barwnik dsDNA o wielkości Orange G migruje ok. 50pz, natomiast migruje na wysokości ok. 4 kpz w 1 % żelu agarozowym. śledzenie postępu elektroforezy. które także na wysokości cyjanol ksylenu FF Barwniki umożliwiają Nr kat. DYl8 2. ~ DODATKOWE UWAGI Nie każde dwa fragmenty DNA można rozdzielić w elektroforezie agarozowej (np. bardzo trudno jest rozdzielić prążki 501 i 489 pz lub 2300 i 2250 pz). ~ Bromek etydyny jest naŁadowany dodatnio i migruje w kierunku przeciwnym do DNA. Podczas zbyt długiego rozdziału elektroforetycznego jest usuwany z części żelu przy elektrodzie dodatniej, bromek etydyny tak że fragment który znalazł się w tej części żelu może stać się niewidoczny. DNA, Aby ponownie zobaczyć ten fragment trzeba wybarwić żel w roztworze bromku etydyny. ~ MaŁe fragmenty DNA szybko wychodzą z żelu. Orientacyjne dane o szybkości migracji daje pozycja barwnika. ~ Są dostępne programy komputerowe cyfrowego wzorca wykreśla www.dnagdansk.com do obliczania dŁugości fragmentów zdjęcia żelu po rozdziale elektroforetycznym wielkości. krzywą Na podstawie kalibracyjną dokŁadnością wielkość fragmentu programu jest Quantity one" obrazu elektroforetycznego, i na jej podstawie DNA badanej DNA z badanej próbki DNA i określa program nam sam z dużą próbce. PrzykŁadem takiego l-D Analysis Software.
