Diagnostyka zakażeń w OIT
advertisement
Diagnostyka zakażeo w OIT Waleria Hryniewicz Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowy Instytut Leków, Warszawa Zakażenia wywoływane są przez: • • • • Wirusy Bakterie Grzyby Pasożyty (zarażenia) Rutynowym zadaniem diagnostyki mikrobiologicznej jest ustalanie : etiologii zakażenia wrażliwości na antybiotyki, prowadzenie regularnej analizy wyników celem dostarczania danych dla terapii empirycznej oraz nadzorowania sytuacji epidemiologicznej w szpitalu • Szybkie ustalenie etiologii oraz antybiotykowrażliwości (bakterie, grzyby) jest szczególnie ważne w sytuacji pacjentów krytycznie chorych (OIT) • Opornośd na antybiotyki szczególnie wysoka u patogenów szpitalnych Najgroźniejsze zakażenia leczone na OIT • Pozaszpitalne : zapalenie płuc, zapalenie opon mózgowordzeniowych, bakteriemia/sepsa • Szpitalne: zapalenie płuc (respiratorowe) , sepsa Zakażenia pozaszpitalne w OIT drogi oddechowe 73 73 97 121 przewód pokarmowy,w tym otrzewna układ moczowy 148 pierwotne zakażenie krwi 976 192 skóra i tkanki miękkie OUN Inne Alberti C: Intensive Care Med 2002; 28:108–121 Zakażenia pozaszpitalne leczone na OIT • Etiologia zapaleo płuc – Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus (CA-MRSA), wirus grypy • Etiologia zapaleo opon mózgowo-rdzeniowych ( >1m-ca ż) –Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis • Etiologia bakteriemii/sepsy - Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli Pozaszpitalne zakażenia krwi w OIT – 5 pierwszych miejsc Klebsiella pneumoniae 11 13 Neisseria menigitidis 46 55 Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae 86 Escherichia coli Valles J., Alvarez-Lerma F., Palomar M: Health-care-Associated Bloodstream Infections at Admission to the ICU, 2011;139:815-20 8 Zakażenia szpitalne - OIT • Zapalenie płuc – pałeczki Gram-ujemne, Staphylococcus aureus • Zapalenie płuc respiratorowe – Gram-ujemne pałeczki niefermentujące – Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp • Bakteriemia/sepsa – Staphylococcus aureus (odcewnikowe), Enterococcus spp, POCT w OIT • • • • Ocena makroskopowa materiału Preparat bezpośredni !!! Immunodiagnostyka Diagnostyka molekularna Uwaga: • Posiew materiału i oznaczenie lekowrażliwości (bakterie, grzyby) – pozostaje złotym standardem . Zapalenie płuc Klebsiella pneumoniae – plwocina „galaretka porzeczkowa” Badanie mikroskopowe • Mikroskop świetlny • Preparaty barwione – metoda Grama – metody specjalne np. barwienie na obecnośd zarodników Laseczka tężca Clostridium tetani, zarodniki na koocu komórki bakteryjnej nadające kształt pałeczki dobosza Badanie mikroskopowe Neisseria meningitidis Preparat z osadu płynu mózgowordzeniowego barwiony metodą Grama Cryptococcus neoformans Preparat tuszowy z osadu płynu mózgowordzeniowego Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae - preparat z plwociny Szybkie testy immunoenzymatyczne • Wykrywanie antygenów wirusowych lub bakteryjnych bezpośrednio w materiale pobranym od chorego (np. wymaz z gardła, mocz) → wybór odpowiedniej terapii • Czas wykonania kilka minut Diagnostyka meningitis • Testy lateksowe wykrywające antygeny drobnoustrojów w płynie mózgowo-rdzeniowym, surowicy i moczu • Neisseria meningitidis A,C, Y/W135 • Neisseria meningitidis B/E.coli k1 • Haemophilus influenzae b • Streptococcus pneumoniae • Streptococcus agalactiae wykrywanie antygenów krążących w surowicy i płynach ustrojowych!!! (Cryptococcus neoformans) Bakteryjne zakażenia dolnych dróg oddechowych - szybkie testy diagnostyczne – materiał pobierany nieinwazyjnie ◦ Testy immunochromatograficzne (IC) Binax NOW® Legionella Urinary Antigen Test (materiał biologiczny – MOCZ; nie należy stosowad do innych materiałów takich jak plwocina, popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe, krew, materiały środowiskowe) Binax NOW® Streptococcus pneumoniae Antigen Test (materiały biologiczne: mocz – zakażenie ddo i płyn mózgowo-rdzeniowy – zakażenie OUN) Warunki przechowywania testów – 15-30ºC (!!!) Antygeny w moczu mogą byd wykrywane w trakcie antybiotykoterapii lub po jej zakooczeniu Postępowanie z materiałem klinicznym: Mocz – pobrad standardowo do pojemnika (nie musi byd jałowy) Test do 24 godz. – temp. 15-30ºC, do 14 dni – 2-8 ºC, powyżej 14 dni – zamrożenie (-10)-(-20) ºC MOCZ Czułość - 86% Specyficzność 94% PMR Czułość - 97% Specyficzność 99% Wykrywanie antygenów wirusowych • Metody immunochromatograficzne – IC (testy paskowe) – – – – Szybkie testy – 15-30 min. Głównie wirus grypy i syncytialny wirus oddechowy (RSV) Łatwe do wykonania Praktyczne zastosowanie zwłaszcza w POZ, gabinetach lekarzy rodzinnych – Czułośd i swoistośd testów dla wirusów A i B – 65% i 100% (Ghebremedhin i wsp. JCM. 2009, 58: 365-370) – Czułośd i swoistośd testów dla RSV - 90% i 94-100% (Selvarangan i wsp. DMID. 2008, 62: 157-161) – Szybkie testy paskowe do diagnostyki zakażenia górnych i dolnych dróg oddechowych wywołanych przez adenowirusy – swoistośd 91-100%, czułośd relatywnie niska (54,5-95%) (Levent i wsp. JCV. 2009, 44: 173-175) Diagnostyka molekularna • Wykrywanie czynnika etiologicznego zakażenia bezpośrednio w materiale klinicznym – Drobnoustroje typowe • np. wykrywanie S. pneumoniae we krwi – zapalenie płuc z bakteriemią – Drobnoustroje atypowe • Mechanizmy oporności na antybiotyki • Wykrywanie nosicielstwa np. pałeczek jelitowych wytwarzajacych karbapenemazy • Badania epidemiologiczne Wykrywanie antygenów wirusowych Metody biologii molekularnej – metody wykorzystujące amplifikację kwasów nukleinowych NAT (nucleic acid technology) RT-PCR (Real-Time PCR) NASBA – metoda oznaczania ilości transkryptu na podstawie sekwencji kwasu nukleinowego Multiplex real-time PCR – jednoczesna diagnostyka kilku/kilkunastu wirusów + bakterii atypowych w wydzielinie z nosogardła Połączenia multiplex RT-PCR z nowymi technikami wykorzystującymi mikromacierze i mikrokulki (bead detection formats) Zakażenie ddo ludzkim metapneumowirusem (hMPV) – wynik dodatni – 33% hodowli, 100% RT-PCR (Ebihar i wsp., JCM., 2004, 42:126-134) (RT-PCR - najbardziej czuła i specyficzna metoda) Potwierdzenie etiologii rhinowirusowej u dzieci z zapaleniem oskrzelików – met. molekularne – 21,2%, met. hodowlana – 2,2% (Paranhos-Baccala i wsp., JCV. 2008: 40(1): S11-S14) • Hodowla i identyfikacja Hodowla i identyfikacja drobnoustrojów Hodowla i wstępna identyfikacja drobnoustrojów CPS Podłoża wybiórcze, wybórczo-różnicujące chromogenne i specjalne MacConkey agar S. agalactiae C. perfringens Systemy automatyczne Systemy automatyczne stosowane są do hodowli drobnoustrojów (np. Bactec, Bact/ALERT, do posiewów krwi) lub do identyfikacji i oznaczenia lekowrażliwości wyhodowanych wcześniej na podłożach stałych drobnoustrojów VITEK 2 Compact BioMerieux Phoenix BD Diagnostic Systems Spektrometria MALDI-TOF Automatyzacja • Automatyzacja pracy w laboratorium zapewnia: – Zwiększenie liczby wykonywanych badao – wpływ na wydajnośd pracy – Unikanie błędów związanych z manualnym wykonaniem badao – Zwiększenie bezpieczeostwa pracy pracowników laboratorium – ograniczenie styczności z czynnikami zakaźnymi – Zapewnienie jakości wykonywanych badao poprzez: • Standaryzację wykonania oznaczeo • Powtarzalnośd • Spójnośd pomiarową • Automatyzacja może obejmowad: – określony etap badania (np. posiew na podłoża, etap identyfikacji i/lub oznaczenia lekowrażliwości) – kilka etapów badania Metody molekularne • Stosowane głównie metody oparte o reakcje PCR lub realtime PCR • Dostępne różne gotowe testy komercyjne w dwóch wariantach – Zestaw odczynników do wykrywania bakterii, reakcja w dowolnym aparacie do PCR lub real-time PCR – Zestawy odczynników lub zamknięte systemy diagnostyczne przeznaczone do użycia w aparacie określonej firmy • Testy zarówno do wykrycia bakterii np. M.tuberculosis jak i identyfikacji ważnych epidemiologicznie bakterii np. MRSA lub wykrycia toksyn bakteryjnych • Oznaczanie lekowrażliwości • Oznaczanie mechanizmów oporności na antybiotyki Patogeny alarmowe ze względu na mechanizmy oporności Gram-dodatnie • Staphylococcus aureus oporny na meticylinę (MRSA) • Staphylococcus aureus oporny na glikopeptydy (GRSA) • Streptococcus pneumoniae oporny na penicylinę i iniekcyjne cefalosporyny III gen.(PRP) • Enterococcus spp oporny na wankomycynę (VRE) Patogeny alarmowe ze względu na mechanizmy oporności Gram-ujemne • Pałeczki Enterobacteriaceae wytwarzające betalaktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) • Pałeczki Enterobacteriaceae oporne na karbapenemy • Pałeczki Pseudomonas aeruginosa oporne na karbapenemy • Pałeczki Acinetobacter spp. oporne na karbapenemy Szybkie oznaczenie lekowrażliwości ANTYBIOGRAM: • Ma na celu poznanie profilu wrażliwości badanego szczepu bakterii na antybiotyki: – zakwalifikowanie szczepu do kategorii wrażliwości (wrażliwy, średniowrażliwy, oporny) – wykrycie mechanizmów oporności • Umożliwia zmianę leczenia empirycznego na leczenie celowane – Terapia deeskalacyjna – Zaprzestanie stosowania terapii skojarzonej • Umożliwia stwierdzenie zmiany profilu lekowrażliwości drobnoustroju w trakcie leczenia • Dostarcza danych do śledzenia trendów lekooporności w szpitalach i w środowisku pozaszpitalnym – monitorowania lekowrażliwości Oznaczenie lekowrażliwości drobnoustrojów • Oznaczanie metodą rozcieoczeniową – Gotowe testy diagnostyczne do odczytu manualnego – Oznaczanie za pomocą systemów automatycznych Oznaczanie MIC penicyliny (PG) i cefotaksymu (CT) dla Streptococcus pneumoniae metodą dyfuzji z paska nasączonego gradientem antybiotyku MIC penicyliny (PG) = 0,38 mg/L MIC cefotaksymu (CT) = 0,19 mg/L Etest • • • • • • • • • Amfoterycyna B(0,002-32 mg/l) Flucytozyna (0,002-32 mg/l) Ketokonazol (0,002-32 mg/l) Itrakonazol (0,002-32 mg/l) Flukonazol (0,016-256,0 mg/l) Worykonazol (0,002-32 mg/l) Pozakonazol (0,002-32 mg/l) Kaspofungina (0,002-32 mg/l) Anidulafungina (0,002-32 mg/l) Oznaczanie mechanizmów oporności na antybiotyki – podłoża chromogenne MRSA ESBL VRE Systemy automatyczne do oznaczanie lekowrażliwości • Systemy automatyczne – Inkubacja, odczyt , interpretacja i generacja raportu w ramach systemu • Systemy pół-automatyczne – Inkubacja poza systemem, odczyt, interpretacja i generacja raportu w ramach systemu • Interpretacja wyników oznaczeo z zastosowaniem programów kontroli jakości i programów eksperckich, uwzględniających obowiązujące rekomendacje dotyczące interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości • Większośd systemów automatycznych ma możliwośd podłączenia do laboratoryjnych sieci informatycznych Oznaczanie lekowrażliwosci drobnoustrojów metody • Oznaczanie MIC – Gotowe testy diagnostyczne do odczytu manualnego lub automatycznego – Oznaczanie w systemach automatycznych (najczęściej stężenia w zakresie wartości granicznych) – Oznaczanie z użyciem pasków z gradientem antybiotyku Czy można szybciej? Antybiogram • Oznaczanie lekowrażliwości bakterii z zastosowaniem próbki pobranej bezpośrednio z dodatniej butelki z posiewem krwi lub próbki moczu – metodą dyfuzyjno-krążkową i metodą z paska z gradientem antybiotyku – z zastosowanie Merlin MICRONAUT System – z zastosowaniem systemu VITEK – z zastosowaniem systemu Phoenix • Skrócenie czasu badania o 18-24 godz. (otrzymanie przybliżonego wyniku antybiogramu) ALE UWAGA! Wszystkie wymienione oznaczenia mogą byd zastosowane jako badanie wstępne, zawsze należy wykonad oznaczenie lekowrażliwości dla czystej hodowli Czy można szybciej? Wykrycie mechanizmów oporności • Szybkie testy – Szybkie testy lateksowe • np. wykrywanie produktu genu mecA białka PBP2’ u S.aureus – Szybkie testy kolorymetryczne • test β LACTATM do wykrywania oporności na trzecią generację cefalosporyn u pałeczek Enterobacteriaceae; • test NP do wykrywania karbapenemaz u pałeczek Gram-ujemnych Test NP Roztwór A Roztwór A + imipenem K KPC+ MBL+ Wykrywanie genów oporności na antybiotyki metoda PCR Zastosowanie do wykrywania opisanych genów oporności na antybiotyki: karbapenemaz KPC, NDM, OXA-48, genów oporności na wankomycynę vanA, vanB, genów oporności na metycyline mecA, mecC Izolacja DNA → reakcja PCR → elektroforeza Wykrywanie genów oporności na antybiotyki - mikromacierze Zastosowanie np. testy wykrywające geny oporności na antybiotyki β-laktamowe: karbapenemazy, ESBL, AmpC firmy Check-Points np. Check-MDR 103 Hodowla → Izolacja DNA → przyłączanie i ligacja starterów rozpoznawanie idealnie pasujących sekwencji → amplifikacja → hybrydyzacja do mikromacierzy → detekcja i odczyt kolorymetryczny; czas wykonania 6-7 godz. Real-time PCR System GeneXpert Cepheid Dostępne zestawy do diagnostyki czynników etiologicznych zakażeo: •szpitalnych: C. difficile, MRSA, VRE, CPE •w układzie oddechowym: prątek gruźlicy, wirus grypy •w układzie nerwowym: enterowirusy •w układzie moczowo-płciowym: wirus HPV, Chlamydia trachomatis, GBS Przykład: Testy typu Xpert MRSA Wykrywanie MRSA w próbce wymazu z rany, w próbce z dodatniej butelki z posiewem krwi, w próbce wymazu z nosa; czas wykonania 60-90 minut Antygen JF5: LFD • mannoproteiny uwalniane przez rosnące strzępki Aspergillus • nie są uwalniane przez konidia • wykrywalne w surowicy i w BAL na kilka dni przed objawami klinicznymi • oznaczanie – metodą immunochromatograficzną typu lateral flow (LFD) przy użyciu monoklonalnego przeciwciała JF5 skoniugowanego z cząstkami złota (Aspergillus LFD, OLM Diagnostics) • wynik jest widoczny w postaci barwnego paska • procedura trwa 10 minut • test ma być dostępny w Polsce w Q4 2014 Antygen JF5: LFD cd. Antygen JF5: LFD cd. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Thornton CR. Current Fungal Infection Reports 2013, published online. DOI:10.1007/s12281-013-0138-x. Thornton CR. Clinical and Vaccine Immunology 2008, 15: 1095-1105. Thornton CR, Johnson G, Agrawal S. Journal of Visualized Experiments 2012, 61: e3721. Hoenigl WM et al.Journal of Infection 2012, 65: 588-591. White PL et al. Journal of Clinical Microbiology 2013, 51: 1510-1516. Held J et al. Infection 2013, published online. DOI: 10.1007/s15010-013-0472-5. Szybka identyfikacja czynnika etiologicznego (1) • Wykrycie i identyfikacja czynnika etiologicznego bezpośrednio w próbce pobranej od pacjenta • Identyfikacja drobnoustroju w pierwotnej hodowli materiału pobranego od pacjenta: – dodatnie posiewy krwi – hodowla na podłożach mikrobiologicznych Szybka identyfikacja czynnika etiologicznego w próbce pobranej od pacjenta (2) • Szybkie testy immunoenzymatyczne chromogenne • Metody molekularne – Real-time PCR – Technika hybrydyzacji DNA • Metody mikroskopowe: – Mikroskop fluorescencyjny immunofluorescencja Szybka identyfikacja czynnika etiologicznego w pierwotnej hodowli materiału pobranego od pacjenta (3) • Hodowla na podłożach chromogennych • Spektrometria masowa • Metody molekularne: • Technika FISH i PNA-FISH • PCR • Mikromacierze (metoda hybrydyzacji) • Szybkie testy immunoenzymatyczne, lateksowe Teraźniejszośd : Tok badania mikrobiologicznego - posiew • Pobranie materiału od pacjenta • Preparat mikroskopowy z materiału • Hodowla na podłożach bakteriologicznych czas 0 czas 1-2 godz. czas 18-24 godz. • Bogate podłoża hodowlane • Podłoża wybiórcze i wybiórczo-różnicujące • • Izolacja podejrzanych kolonii Identyfikacja czas 36-48 godz. czas 40-72 godz. • Metody manualne (np. preparat mikroskopowy, katalaza, testy lateksowe) • Identyfikacja biochemiczna (systemy manualne i automatyczne) • Oznaczenie lekowrażliwości • Metoda dyfuzyjno-krążkowa • Paski z gradientem antybiotyku • Metody automatyczne czas 40-72 godz. Niedaleka przyszłośd: Tok badania mikrobiologicznego • Pobranie materiału od pacjenta • Wykrycie czynnika etiologicznego czas 0 kilka minut - 2 godz. • Hodowla na podłożach bakteriologicznych 18-24 godz. • 20 – 24 godz. • Podłoża chromogenne – mechanizm oporności Identyfikacja • MALDI-TOF • Metody molekularne • Szybkie testy immunoenzymatyczne i kolorymetryczne • Oznaczenie lekowrażliwości, mechanizmów oporności • • • • 20-30 godz. Metoda dyfuzyjno-krążkowa Metody automatyczne np. Phoenix, VITEK MALDI-TOF Metody molekularne • W przypadku konieczności izolacji wydłużenie czasu analizy o 18 godz. • Możliwe skrócenie czasu potrzebnego do otrzymania wyniku badania mikrobiologicznego (identyfikacja + antybiogram) o 24 godz. Podsumowanie • W nowoczesnej diagnostyce mikrobiologicznej obserwuje się następujące trendy: – Automatyzacja procesu diagnostycznego – Stosowanie metod umożliwiających: • Szybkie wykrycie i identyfikację czynnika etiologicznego zakażenia • Oznaczenie lekowrażliwości w możliwie najkrótszym czasie – Integracja różnych systemów i aparatury stosowanej w laboratorium za pomocą systemu informatycznego – Wykorzystanie systemów eksperckich umożliwiających szybką i prawidłowa interpretacje wyniku badania mikrobiologicznego – Rozbudowa systemów informatycznych, włączenie systemu informatycznego laboratorium mikrobiologicznego do systemu informatycznego szpitala • Dziękuję za uwagę
