Badanie polimorfizmu krótkich powtórzeń
advertisement
Materiał pochodzi ze strony molekularnie.wordpress.com Kopiowanie i rozpowszechnianie wyłącznie w całości, z zachowaniem praw autorskich zgodnie z zasadami licencji GNU Dziękuję za uszanowanie mojej pracy, Marzena Badanie polimorfizmu krótkich powtórzeń tandemowych w kryminalistyce W ludzkim DNA, najczęściej poza sekwencją kodującą, znajduje się wiele obszarów polimorficznych, różniących się długością. Tzw. krótkie powtórzenia tandemowe (STR, short tandem repeats) to grupa sekwencji, różniących się ilością występujących po sobie kilkunukleotydowych traktów, np. [GATC]n, [AT]n itd. Tego typu polimorfizmy są wymarzonym markerem w kryminalistyce z kilku powodów: po pierwsze są bardzo zmienne w populacji. Jedna osoba może cechować się 25-cioma powtórzeniami (GATC) w jednym allelu, zaś 15-toma w drugim, inna może mieć 18 powtórzeń pierwszego i 64 powtórzenia drugiego... I tak dalej. Wariantów jest bardzo wiele- tak wiele, że szansa na znalezienie dwóch osób o takim samym wzorze polimorfizmów jest znikoma. Badacze wyliczyli, że posługując się zestawem 13 markerów STR (przy założeniu zupełnie losowego dobierania osób w pary) szansa, że dwoje niespokrewnionych ludzi będzie posiadało dokładnie taki sam wzór polimorfizmów jest jak 1 do 375 trylionów! Obecnie na świecie jest 7 mld ludzi, a gdyby połaczyć ich w losowe pary, to takich par byłoby mniej niż 5000 trylionów. Dalsza matematyka jest już prosta: statystycznie tylko 8-10 par osób niespokrewnionych ze sobą na całej planecie może mieć przypadkowo taki sam zestaw sekwencji. Jak powstaje różnorodność STR w naszych genomach? By odpowiedzieć na to pytanie, musimy pamiętać, czym jest zjawisko crossing-over. Crossing-over (C-O) jest sposobem organizmu na zwiększanie różnorodności genetycznej poprzez wymianę homologicznych (czyli odpowiadających sobie) fragmentów chromosomów podczas podziału mejotycznego. Proces jest bardzo dokładny, maszyneria komórkowa skrupulatnie sprawdza, czy obszary flankujące rejon, w którym zachodzi C-O są identyczne. Jeżeli jednak w odcinku, w którym ma miejsce rekombinacja DNA znajdują się wielokrotnie, tandemowo powtórzone trakty DNA, to czasami (choć rzadko) maszyneria się “omsknie” i nierówno sparuje odcinki DNA! W czasie takiej nierównej wymiany dochodzi do powstania jednej nici DNA ze zmniejszoną liczbą powtórzeń i drugiej ze zwiększoną (patrz: rysunek). Taka zmieniona sekwencja przekazana jest potomkowi. Zmiana ilości powtórzeń najczęściej przytrafia się poza sekwencją kodującą i jest zupełnie nieszkodliwa, chociaż opisano jednostki chorobowe, w których amplifikacja powtórzeń tandemowych ma miejsce w sekwencji kodującej* i kończy się tragicznie. Przykładem takiego schorzenia jest choroba Huntingtona. * w naturze zawsze znajdziemy wyjątki- czasami tandemowe powtórzenia pozagenowe takze są chorobotwórcze, a czasami polimorfizm STR wewnątrzgenowy nie jest... Struktura polimorfizmów STR O ile łatwo sobie wyobrazić na bazie powyższego rysunku prosty ciąg powtórzeń, np. [GATC]n, o tyle nie zawsze, a raczej rzadko kiedy, tandemowe ciągi są tak proste. Zwykle w toku różnicowania populacji dochodzi do zmian w struturze powtórzeń, pojawiają się „złamania szyku”, dodatkowe trakty o innej sekwencji itd. Posiłkując się bazą STRBase spójrzmy na sekwencję popularnych wariantów FES/FPS i D21S11 ... Polimor fizm FES/FPS D21S11 Allel1 Allel2 Allel3 Allel4 Allel5 Allel6 Allel7 Allel8 [ATTT]7 [TCTA]4 [TCTG]6 [TCTA]3 TA [TCTA]3 TCA [TCTA]2 TCCA TA [TCTA]6 [ATTT]8 [TCTA]4 [TCTG]6 [TCTA]3 TA [TCTA]3 TCA [TCTA]2 TCCA TA [TCTA]8 [ATTT]9 [TCTA]4 [TCTG]3 [TCTA]3 TA [TCTA]3 TCA [TCTA]2 TCCA TA [TCTA]10 [ATTT]10 [TCTA]5 [TCTG]6 [TCTA]3 [ATTT]11 [TCTA]4 [TCTG]6 [TCTA]3 TA [TCTA]3 TCA [TCTA]2 TCCA TA [TCTA]8 [ATTT]12 [TCTA]4 [TCTG]6 [TCTA]3 TA [TCTA]3 TCA [TCTA]2 TCCA TA [TCTA]9 [ATTT]13 [TCTA]6 [TCTG]5 [TCTA]3 TA [TCTA]3 TCA [TCTA]2 TCCA TA [TCTA]8 [ATTT]14 [TCTA]5 [TCTG]5 [TCTA]3 TA [TCTA]3 TCA [TCTA]2 TCCA TA [TCTA]9 TCA [TCTA]2 TCCA TA [TCTA]10 Wzór ogólny [ATTT]n [TCTA]m [TCTG]n [TCTA]k TA [TCTA]s TCA [TCTA]t TCCA TA [TCTA]r Tak to mniej więcej wygląda. Są polimorfizmy proste i złożone, są nawet takie, które wyglądają na zupełnie chaotyczne, np. SE33, jeden z „najpiękniejszych” markerów, bo bardzo różnorodny w populacji, w związku z tym także o ogromnej heterozygotyczności (cała baza alleli tutaj: http://www.cstl.nist.gov/strbase/str_SE33.htm) Problem z polimorfizmem Opisany mechanizm tworzenia się STR rodzi pewne konsekwencje: przede wszystkim w róznych populacjach różne powtórzenia występują z inną częstotliwością- szczególnie w izolowanych populacjach mogą wystąpić nietypowe warianty polimorficzne. Jest to pewnym utrudnieniem dla kryminalistyki, która w różnych krajach powinna posługiwać się różnymi markerami, dobranymi tak, by ich zmienność w populacji była jak największa. Poza tym należy pamiętać, że często sprawy kryminalne dotyczą rodzin- zabójstwa, kontrowersje spadkowe, problem ojcowstwa. A w rodzinach układy polimorficzne są bardzo podobne- wszak dziedziczymy (zwykle) połowę naszej konstelacji genetycznej od ojca, a połowę od matki. Łatwo sobie wyobrazić, jak trudnym zadaniem jest wykrycie różnic w genotypie bliźniąt jednojajowych. Niszowym problemem, ale także rozważanym przez specjalistów z dziedziny kryminalistyki jest tzw. chimeryzm genetyczny po przeszczepieniu sypiku kostnego. Okazuje się, że pobrana na badania krew biorcy przeszczepu może mieć inny układ STR niż np. sperma, komórki nabłonka pobrane z odcisków palców czy też inne tkanki (tzn. układ dawcy). Co gorsza w bardzo rzadkich przypadkach także włosy i nabłonek jamy ustnej (najpowszechniejszy materiał do badań kryminalistycznych) “porastają” komórkami epitelialnymi wyprodukowanymi przez komórki macierzyste dawcy. Jak wykonuje się badanie STR? Metodyka jest stosunkowo prosta: wystarczy zwykła reakcja PCR z rozdziałem elektroforetycznym, żeby uwidocznić różnice we wzorze prążkowym. Taką reakcję demonstracyjną można przygotować w każdym laboratorium biologii molekularnej. Jednakże w kryminalistyce potrzeba czegoś więcej, niż żelu agarozowego i zwykłego PCR Jeżeli coś ma być niepodważalnym dowodem sądowym, musi być całkowicie wiarygodne. Dlatego rutynowo korzysta się z kilku fluorescencyjnych reakcji multiplex-PCR, w których można wykryć po kilka różnych STR naraz, oraz z fluorescencyjnej elektroforezy kapilarnej, by dokładnie, co do nukleotydu, określić wielkości uzyskanych prążków/pików. Tylko wówczas możliwe oszacowanie faktycznej liczby powtórzeń w danym loci. Rycina poniżej: Elektroforegram uzyskany dla jednego z polimorfizmów w systemie multiplex. J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press Widok na wszystkie kanały D3S13 TH D21S D5S8 D7S8 D13S3 Pent D18S CSF1 D16S5 Panel niebieski Panel zielony Pent Panel żółty VW Amelogenina Chr. X/Y D8S11 TP FG Panel czerwony ILS600 DNA standard wielkości 200 400 500 100 300 325 350 375 425 450 475 bp bp bp 120 140 160 180 bp 225 250 275 bp Analiza statystyczna Wynik badania STR do celów sądowych jest formuowany np. tak: “stwierdzono z prawdopodobieństwem graniczącym z pewnością, że osoba X jest ojcem dziecka”, albo „istotne różnice we wzorze markerów STR wykluczają przynależność śladów biologicznych z miejsca zbrodni do osoby Y”. Tak więc można z pewnością wykluczyć pokrewieństwo/tożsamość sprawcy, ale nie da się jej potwierdzić w 100% (zwykle jest to ok. 99,99%). Przy potwierdzaniu nie można nigdy orzec na 100% że ze zgodności STRwynika wprost tożsamość osoby, bo taj kaj na wstępie zaznaczyłam, jest pewna szansa, że dzielimy ukłąd STR z kilkomainnymi mieszkańcami naszej planety. Czasami,szczególnie podczas rozpatrywania tzw. mikrośladów biologicznych, w ogóle nie da się wydać rozstrzygającego wyniku, gdyż np. DNA jest zbyt mało do analizy. Może być on także poderadowany, lub byc mieszanką kilku różnych genomów o róznym skłądzie procentowym. Podczas obróbki danych z elektroforegramu genetyk sądowy musi sprawdzić czy piki nie są artefaktami, czy nie doszło do „zamaskowania” jednego z alleli, albo czy reakcja PCR nie faworyzowała zbyt mocno amplifikacji jednego allelu nad drugim. To bardzo ważne, bo tylko równe ilości obu allei w heterozygocie dają prawo do rozrózniania pomiędzy kilkoma genotypami w mieszaninie DNA np. z miejsca zbrodni. Analiza statystyczna polega na skorygowaniu częstości alleli w próbce z częstością populacyjną i po dokonaniu takiej korekty wyliczeniu prawdopodobieństwa, żedany układ polimorficzny może trafić się losowo. Na zakończenie Nie jestem genetykiem sądowym, dlatego temat potraktowany jest w sposób czysto akademicki. Dla pragnących zgłębić temat przygotowano bardzo wiele materiałów, dostępnych za darmo w sieci. Godnym polecenia źródłem informacji jest baza STRbase oraz znajdujące się w jej trzewiach liczne prezentacje ppt i pdf. Polecam zajrzeć: http://www.cstl.nist.gov/strbase/training.htm
