KRONIKARZ Prof. dr hab. Andrzej Krzysztof Tarkowski
advertisement
Prof. dr hab. Andrzej Krzysztof Tarkowski “Omne virum ex ovo: tak, ale..” wykład laureata Jego Magnificencjo, Panie Rektorze! Ich Magnificencje! Wysoki Senacie! Panie Dziekanie Wydziału Wojskowo-Lekarskiego! Mój Promotorze, Panie Profesorze Hieronimie Bartel! Drodzy Koledzy z mojego Macierzystego Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego Szanowni Państwo! Jestem głęboko zaszczycony decyzją Wysokiego Senatu Uniwersytetu Medycznego w Łodzi przyznania mi tytułu doktora honoris causa tej Uczelni. Jestem biologiem, ale specjalność, jaką od 50 lat się zajmuję – embriologia – jest jednym z przedmiotów wykładanych zawsze w uczelniach medycznych. Poznanie rozwoju embrionalnego człowieka jest trudne i dawniej musiało polegać jedynie na opisywaniu dość przypadkowo uzyskiwanego materiału, to znaczy płodów dotkniętych różnego rodzaju wadami rozwojowymi i w wyniku tych wad poronionych, lub – znacznie rzadziej - płodów normalnych, ale poronionych w wyniku patologicznie przebiegającej ciąży lub sztucznego jej przerwania. Współczesne techniki badawcze są naturalnie znacznie bardziej wyrafinowane niż klasyczna anatomia rozwojowa i histologia; np. ultrasonografia pozwala śledzić rozwój płodu w łonie matki i wykrywać niektóre wady rozwojowe, co w pewnych przypadkach pozwala na ich skorygowanie jeszcze przed urodzeniem. Najwcześniejsze etapy rozwoju, od zapłodnienia do zagnieżdżenia się zarodka w tkankach macicy, zostały ostatnio dobrze poznane dzięki rozwojowi technik wspomaganego rozrodu. Naturalnie nie jest możliwe jakiekolwiek eksperymentowanie na zarodkach ludzkich, a tylko eksperyment pozwala na wyjście poza opis zjawisk i procesów i wyjaśnienie ich przyczyn oraz mechanizmów leżących u ich podłoża. W tym miejscu badania embriologiczne prowadzone na zwierzętach stają się ważnym źródłem informacji, z którego należy w sposób krytyczny korzystać, pamiętając zarówno o podobieństwie podstawowych procesów rozwojowych człowieka i innych ssaków, jak i o istotnych różnicach gatunkowych. Dlatego związki uniwersyteckiego biologa-embriologa z kolegami z uczelni medycznej są łatwiejsze i bardziej naturalne niż w wielu innych specjalnościach. W konkretnym przypadku tej Uczelni te związki sięgają połowy lat sześćdziesiątych, kiedy mój dzisiejszy Promotor, Pan Profesor Hieronim Bartel, jako bardzo młody jeszcze człowiek przyjeżdżał na seminaria do naszego Zakładu Embriologii na Uniwersytecie Warszawskim. Tyle tytułem wstępu. W moim dzisiejszym wykładzie chciałbym Państwu powiedzieć o niektórych badaniach, których korzenie tkwią w embriologii eksperymentalnej ssaków, ale które obecnie często wspomagane są technikami genetyki molekularnej. Te badania budzą coraz większe zainteresowanie, ale jednocześnie i zaniepokojenie społeczeństwa, ze względu na potencjalną możliwość prowadzenia ich na zarodkach ludzkich. Ponieważ niewątpliwym bohaterem tych badań jest komórka jajowa, dlatego dzisiejszemu wykładowi nadałem tytuł: Omne vivum ex ovo: tak, ale……. William Harvey, angielski lekarz i badacz w dziele „Exercitationes de generatione animalium”, 72 KRONIKARZ ogłoszonym w 1651 roku, wypowiedział pogląd na temat powstawania organizmów tkankowych, znany najczęściej pod postacią zwięzłej łacińskiej sentencji „ Omne vivum ex ovo”. To twierdzenie okazało się prawdziwe, chociaż w stosunku do ssaków, a więc i do człowieka, Harvey nie był w stanie go udowodnić, ponieważ nie widział nigdy komórki jajowej tych organizmów. Gdy organizmy tkankowe rozmnażają się płciowo, mogą uzyskać potomstwo tylko wykorzystując do tego celu komórkę jajową, tzn. jajo. Najczęściej w procesie rozmnażania płciowego uczestniczy również męska komórka płciowa – plemnik, ale istnieją organizmy, które w pewnych okresach rozmnażają się bez udziału plemnika - mówimy wówczas o partenogenezie lub dzieworództwie. Powstały w ten sposób organizm wyposażony jest tylko w geny matczyne. W tych wyjątkowych przypadkach, teza Harveya jest jak najbardziej słuszna: to komórka jajowa, a nie plemnik, jest konieczna, aby powstał osobnik nowej generacji. W dzisiejszym wykładzie będę mówić wyłącznie o ssakach, a dokładnie o myszy, bo na tym gatunku uprawiam embriologię eksperymentalną od 50 lat. Będę starał się pokazać, że chociaż teza Harveya pozostaje nadal prawdziwa, to w laboratorium nowe osobniki mogą powstać w sposób bardzo odbiegający od normalnego biegu rzeczy. Zasadnicza treść mojego wykładu kryje się, zatem, za małym słówkiem „ALE”. Na wstępie chciałbym przypomnieć, że w naturze nowe osobniki ssaków nie mogą powstać na drodze partenogenezy. Do niedawna nie można ich było również uzyskać eksperymentalnie. A więc w zasadzie nie, ale …. Powrócę do tego ‘ale’ za chwilę. Badania zapoczątkowane na przełomie lat 60- i 70-tych, niezależnie w Zakładzie Embriologii Uniwersytetu Warszawskiego i w Zakładzie Zoologii Uniwersytetu Oksfordzkiego, wykazały, że zarodki myszy powstałe w wyniku sztucznej partenogenezy, rozwijają się początkowo normalnie, ale w stadium, w którym zaczynają się kształtować zawiązki przyszłych narządów, obumierają. Te badania, oraz pewne inne manipulacje genetyczne przeprowadzane na komórce jajowej, wykazały niezbicie, że normalny rozwój myszy możliwy jest tylko wtedy, gdy w genomie zarodka współwystępują geny pochodzące zarówno od matki jak i od ojca. Samo podwojenie liczby chromosomów matczynych, bądź ojcowskich, do normalnej liczby diploidalnej, nie zapewnia normalnego rozwoju. Te i inne obserwacje doprowadziły do wykrycia zjawiska „imprintingu” genetycznego, czyli odmiennego napiętnowania pewnych genów podczas powstawania jaj i plemników. To napiętnowanie wyraża się później, tzn. podczas rozwoju embrionalnego, aktywnością lub brakiem aktywności tych genów. Przypuszcza się, że takich genów ulegających „napiętnowaniu” podczas powstawania komórek płciowych jest kilkadziesiąt. Ale okazało się, zresztą nie po raz pierwszy, że słynne Orwellowskie zdanie w jego książce “Folwark zwierzęcy”„wszystkie zwierzęta są równe, ale niektóre zwierzęta są równiejsze od innych”, jest ogólnie prawdziwe, zarówno w społecznościach ludzkich, jak i w świecie genów. Stwierdzono bowiem, że niektóre z napiętnowanych genów są ważniejsze od innych. W ubiegłym roku, zespół badaczy japońskich pod kierunkiem Tomohiro Kono uzyskał mysz, która rozwinęła się z komórki jajowej, do której wprowadzono genetycznie zmodyfikowany genom pochodzący z drugiego oocytu, który jeszcze nie rozpoczął wzrostu i w którym nie doszło jeszcze do napiętnowania określonej grupy genów. Modyfikacje polegały na unieczynnieniu jednego genu (H19) i uaktywnieniu drugiego matczynego genu (Igf2 – kodującego insulinopodobny czynnik wzrostu II), który normalnie w zarodku nie funkcjonuje, ale który w postaci funkcjonalnej znajduje się w genomie ojcowskim wprowadzanym przez plemnik. Chociaż eksperymentatorzy nie regulowali w żaden sposób charakteru napiętnowania innych genów z tej grupy, zmiana aktywności tylko dwóch z nich wystarczyła, aby skonstruowany w ten sposób zarodek rozwinął się w normalną i płodną mysz. Tak więc, jeśli dokona się odpowiednich modyfikacji w jednym z dwóch żeńskich genomów haploidalnych, to partenogeneza u ssaków staje się możliwa. Panowie, płeć męska staje się coraz mniej potrzebna. Kilka słów chciałbym teraz poświęcić faktowi, że w zapłodnionej komórce jajowej, czyli w zygocie, tkwią ogromne możliwości rozwojowe, znacznie przekraczające jej zdolność rozwiKRONIKARZ 73 nięcia się w jednego osobnika, co jest najczęściej realizowane. O tych zwykle nie wykorzystywanych możliwościach świadczy, dobrze wszystkim znane, zjawisko bliźniąt jednojajowych u człowieka. Częstość występowania jednojajowych trojaczków, czworaczków, a nawet pięcioraczków, jest nieporównanie rzadsza, ale świadczy o tym, że natura potrafi dokonywać niebywałych eksperymentów, których my, embriologowie pracujący na zwierzętach, nie potrafimy jeszcze powtórzyć. W pracy, którą przesłaliśmy kilka tygodni temu do druku, udało się nam uzyskać mysie trojaczki, które uzyskaliśmy zresztą w inny sposób niż to się dzieje w naturze: zarodek zbudowany z 8 komórek, rozdzieliliśmy na pojedyncze komórki i każdą z nich obudowaliśmy komórkami pochodzącymi z zarodka tetraploidalnego, a więc mającego dwukrotnie większą liczbę chromosomów niż normalny zarodek. Same zarodki tetraploidalne giną w czasie ciąży, ale jeśli zespoli się je z zarodkiem diploidalnym (lub choćby z jedna komórką embrionalną, jak w naszym doświadczeniu) to komórki tetraploidalne tworzą błony płodowe (i świetnie w nich funkcjonują), a sam płód powstaje z komórki diploidalnej. Zastosowana metoda opiera się na naszych dawnych badaniach z lat 70-dziesiątych, które dotyczyły eksperymentalnego otrzymywania zarodków tetraploidalnych i zarodków mozaikowych diploidalno<->tetraploidalnych. Wykazaliśmy wówczas, że w takich zarodkach mozaikowych, komórki tetraploidalne są stopniowo eliminowane z ciała zarodka, ale pozostają w błonach płodowych. Tezę Harveya można zatem rozszerzyć: nowy osobnik może powstać nawet tylko z części jaja. Czy ta część może być mniejsza niż 1/8, tego jeszcze nie wiemy. Niezależnie od sposobu ich powstania, bliźnięta jednojajowe (i naturalnie także trojaczki, czworaczki, czy pięcioraczki) stanowią klon, czyli grupę osobników identycznych pod względem genetycznym, ponieważ wyposażone są w identyczny genom jądrowy, a co więcej, również w identyczny genom mitochondrialny. Z ludzkimi klonami człowiek styka się zatem od początku swego istnienia, i budzą one ogólną sympatię i przyjazne zainteresowanie. Ta sympatia nie obejmuje jednak eksperymentalnego uzyskiwania ludzkich klonów, czyli genetycznego powielania dorosłych osób. O przeprowadzaniu tego typu eksperymentów na zwierzętach, opinia publiczna dowiedziała się właściwie dopiero po urodzeniu się owcy Dolly. Takie doświadczenia rozpoczęto naturalnie znacznie wcześniej, np. w naszym Zakładzie już w latach siedemdziesiątych, a obecnie prowadzi się je w wielu laboratoriach na świecie na kilku gatunkach ssaków laboratoryjnych i gospodarskich. Zaangażowani w te prace embriologowie i genetycy dobrze znają zarówno trudności związane z zabiegiem klonowania, jak i konsekwencje takiego niezwykłego pochodzenia, jakie obserwuje się u wielu sklonowanych osobników. Dlatego należą oni do osób najbardziej zdecydowanie wypowiadających się przeciwko podejmowaniu prób reprodukcyjnego klonowania człowieka. Istota tej procedury polega na usunięciu z niezapłodnionej komórki jajowej jej jądra komórkowego i wprowadzenie do niej diploidalnego jądra pochodzącego z komórki embrionalnej lub komórki pobranej z jakiejś tkanki dorosłego osobnika. Tak zoperowana komórka jajowa musi być sztucznie pobudzona do rozwoju, ponieważ w procedurze klonowania plemnik nie występuje. Osobnik powstały w wyniku takiego zabiegu rozwija się z jaja, ale nie jest to w pełni takie jajo, z którego normalnie rozwija się w wyniku zapłodnienia nowy osobnik. Komórka jajowa oczekująca na wniknięcie plemnika jest bryłką cytoplazmy otoczonej błoną komórkową i zawierającą haploidalną grupę chromosomów powstałą w wyniku skomplikowanego procesu mejozy. Mówiłem już wcześniej, że pewna liczba genów znajdujących się w tych chromosomach uzyskała szczególne piętno, od którego będzie zależeć, czy ulegną one, czy też nie ulegną ekspresji w zarodku powstałym po zapłodnieniu. W zabiegu klonowania te chromosomy zostają usunięte i wykorzystana zostaje wyłącznie cytoplazmatyczna część komórki jajowej. Nie jest więc to już w pełnym tego słowa znaczenia jajo, ovum, które miał na myśli Harvey. Ale jest to w pewnym sensie ważniejsza część komórki jajowej. Jej jądro może zostać zastąpione przez inne jądro komórkowe, ale cytoplazma żadnej innej komórki nie może zastąpić cytoplazmy jaja. Jajo jest komórką zupełnie wyjątkową, ponieważ dzięki swojej organizacji strukturalnej 74 KRONIKARZ oraz obecności i określonemu rozmieszczeniu w cytoplazmie różnych składników, umożliwia rozpoczęcie rozwoju embrionalnego, to znaczy uporządkowanego w czasie i przestrzeni ciągu przekształceń prowadzących ostatecznie do powstania osobnika nowej generacji. Jajo jest najważniejszą komórką organizmów tkankowych, mówiąc nieco poetycznie jest „królową-matką” wszystkich komórek. W przypadku klonowania osobnik powstaje z obcego jądra i cytoplazmatycznej części komórki jajowej, a więc słuszność tezy Harveya przynajmniej częściowo zostaje zachowana. Ale teraz przechodzę do omówienia jeszcze bardziej niezwykłej sytuacji: nowy osobnik może powstać z zarodkowych komórek macierzystych. Czym są te komórki? Aby odpowiedzieć na to pytanie konieczna jest znajomość kilku faktów dotyczących wczesnego rozwoju embrionalnego ssaków. Zapłodniona komórka jajowa, tzw. zygota, dzieli się na potomne komórki: 2, 4, 8, 16 itd. W pewnym momencie, w takiej bryłce złożonej z kilkudziesięciu komórek pojawia się jamka i zarodek przyjmuje postać pęcherzyka, który składa się z jednowarstwowej ścianki i podwieszonej na jednym biegunie i skierowanej do światła jamki grupy komórek. Taki zarodek nazywamy blastocystą: jego ścianki utworzą w przyszłości kosmówkę i łożysko, natomiast właściwy zarodek – przyszły płód i osobnik - powstanie z części komórek podwieszonych na jednym biegunie blastocysty, czyli z tzw. węzła zarodkowego. W tym stadium zarodek zagnieżdża się w macicy. Jeśli umieścimy go jednak w hodowli tkankowej, w warunkach uniemożliwiających, a w każdym razie utrudniających różnicowanie komórkowe, to komórki węzła zarodkowego kontynuują podziały komórkowe i tworzą populację niezróżnicowanych komórek, które nie wykształcają normalnych struktur embrionalnych – to są właśnie zarodkowe komórki macierzyste. Komórki te można wielokrotnie pasażować w hodowli tkankowej, można je zamrażać w temperaturze ciekłego azotu, i po dowolnym czasie odmrozić i dalej namnażać. Mają one zdolność różnicowania się we wszystkie typy komórek występujące w ciele dorosłego osobnika. Budzą one tak wielkie zainteresowanie, ponieważ teoretycznie mogłyby zostać wykorzystane w medycynie regeneracyjnej do naprawy wszelkich tkanek, które z takich lub innych powodów uległy zanikowi lub nie funkcjonują prawidłowo. Jest tylko jeden szkopuł, a może nawet dwa. Aby nie ulec zniszczeniu przez układ odpornościowy biorcy, komórki te powinny być genetycznie podobne do komórek biorcy, przynajmniej pod względem genów zgodności tkankowej. Być może w przyszłości będzie możliwe odpowiednie transformowanie genetyczne takich komórek pod kątem określonego biorcy. Chwilowo jednak najprostszym rozwiązaniem, ale wcale niełatwym, wydaje się uzyskanie zarodka metodą klonowania z użyciem jądra komórkowego pochodzącego od potencjalnego biorcy i w sposób, który omówiłem przed chwilą, wyhodowanie z niego zarodkowych komórek macierzystych. Trzeba jeszcze opanować metody sterowania różnicowaniem komórkowym in vitro tak, aby do biorcy zostały przeszczepione wyłącznie zróżnicowane komórki określonego typu i aby nie znalazły się wśród nich niezróżnicowane komórki macierzyste, które mogłyby w organizmie biorcy ulec niekontrolowanemu różnicowaniu w inne tkanki. Drugi poważny szkopuł, który dotyczy naturalnie tylko zarodkowych komórek macierzystych człowieka, a nie myszy i innych zwierząt, to konieczność skonstruowania zarodka „na zamówienie”, z pełną świadomością, że zostanie on użyty do otrzymania komórek macierzystych i to w sposób, który uniemożliwi mu dalszy rozwój embrionalny, zakończony powstaniem nowej istoty ludzkiej. Jest to szkopuł natury filozoficznej i etycznej, który sygnalizuję, ale któremu w tym wykładzie nie zamierzam poświęcać uwagi, ograniczając się do wątku biologicznego. To wszystko, co przed chwilą powiedziałem, było jedynie dygresją, która była konieczna do wyjaśnienia pochodzenia i właściwości zarodkowych komórek macierzystych. W tym wykładzie interesuje nas inne pytanie: czy z zarodkowych komórek macierzystych można uzyskać nowego osobnika – dla pełnej jasności mysz, a nie człowieka. Odpowiedź na to pytanie jest twierdząca: tak można. Kilkanaście albo kilka komórek (a znany jest przypadek, że nawet tylko jedną komórkę), trzeba wszczepić do jamki pęcherzykowatego zarodka, czyli blastocysty, ale zarodek ten KRONIKARZ 75 musi być tetraploidalny. Mówiłem już wcześniej o podobnym doświadczeniu. W tak skonstruowanym zarodku chimerowym diploidalno<->tetraploidalnym komórki tetraploidalne utworzą błony płodowe, a płód powstanie z diploidalnych zarodkowych komórek macierzystych. Czy w tym przypadku teza Harveya przestaje już być prawdziwa? I tak i nie. Nowy osobnik powstał, co prawda z zarodkowych komórek macierzystych, ale jego powstanie nie byłoby możliwe bez komórek jajowych, a co więcej, nie jednej, ale aż dwóch. Z pierwszej powstaje drogą klonowania zarodek, z którego następnie otrzymuje się zarodkowe komórki macierzyste. Z drugiej rozwija się po zapłodnieniu zarodek, który zostanie poddany zabiegowi tetraploidyzacji i do którego zostaną następnie wszczepione zarodkowe komórki macierzyste. Nie, nie ma ucieczki od komórki jajowej i nie można jej zastąpić żadną inną komórką. Jest to naprawdę wyjątkowa komórka, która podobnie jak osobniki, a szczególnie osoby, w których te komórki powstają, zasługuje na poświęcanie jej szczególnej uwagi. Panowie, chapeaux bas! Prof. Andrzej Krzysztof Tarkowski 76 KRONIKARZ
