DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA

DIAGNOSTYKA
MOLEKULARNA
METODY MOLEKULARNE
 PCR
 Hybrydyzacja
 FISH
 Sekwencjonowanie
ŁAŃCUCHOWA REAKCJA
POLIMERAZY
Polimerase Chain Reaction (PCR)
 Pozwala na powielenie dowolnej sekwencji
DNA o długości od kilkuset do kilku tysięcy
nukleotydów
 Polega na przeprowadzeniu wielu cykli
syntezy kwasu nukleinowego
z wykorzystaniem starterów flankujących
określony odcinek DNA
MECHANIZM REAKCJI
CZYNNIKI:
 Matryca DNA
 Startery (primery)
 dNTP (trójfosforany deoksynukleotydów)
 Polimeraza DNA
IZOLACJA
1. Przygotowanie próbek krwi, skóry itd.
2. Dezintegracja komórek – TRIZOL,
Chloroform
3. Odwirowanie zanieczyszczeń
4. Zamrożenie (- 800 C)
STARTERY
 Starterem nazywany jest oligonukleotyd
zbudowany z 6 do 40 zasad nukleotydowych,
którego sekwencja jest komplementarna z
badaną matrycą DNA lub RNA. Startery o
długości ponad 18 nukleotydów w sposób
wybiórczy mogą hybrydyzować z sekwencją
komplementarną, jeśli nawet pojedyncze kopie
matrycy zmieszane są z milionami innych
cząsteczek DNA. Koniec 3' przyłączonego
startera wyznacza początek replikacji DNA.
CYKL PCR
1. Denaturacja DNA (92-960 C)
2. Przyłączanie starterów do
matrycy (37-720 C)
3. Polimeryzacja DNA (720 C)
DENATURACJA (> 900 C)
PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW
(37-720 C)
WYDŁUŻANIE ŁAŃCUCHÓW
(720 C)
POWIELONA SEKWENCJA DNA
LICZBA KOPII SEKWENCJI DNA
PODCZAS REAKCJI PCR
Cykle
1
2
3
4
5
6
20
30
Liczba łańcuchów DNA
2
4
8
16
32
64
1,048,576
1,073,741,824
PROFIL TERMICZNY PCR
100
90
DENATURACJA
(ok. 1 minuty)
DENATURACJA
(ok. 1 minuty)
80
70
POLIMERYZACJA
(ok. 30 sekund)
60
50
40
30
PRZYŁĄCZANIE
STARTERÓW
(ok. 30 sekund)
20
10
0
CYKL 1
CYKL 2
METODY DIAGNOSTYCZNE
OPARTE NA PCR
 PCR
 PCR MULTIPLEKSOWY:
Równoczesna amplifikacja kilku regionów
genomu w jednej probówce stosując różne
pary starterów.
(Diagnostyka chorób genetycznych,
wykrywanie mutacji, wykrywanie
czynników zakaźnych)
 NESTED PCR:
Dodanie zestawu nowych (bardziej
swoistych) starterów po przeprowadzeniu
wstępnej reakcji PCR.
(Kontrola swoistości reakcji, stworzenie
sondy molekularnej z produktu PCR)
 Real Time PCR:
Analiza ilościowa badanego fragmentu
genomu z wykorzystaniem barwników
fluorescencyjnych (np. SYBR Green).
Po każdym cyklu barwnik łączy się z 2niciowym produktem, dzięki czemu
możliwe jest określenie jego ilości (w
czasie rzeczywistym).
 PCR-RFLP
Produkt PCR jest poddawany procesowi
cięcia enzymami restrykcyjnymi, w wyniku
czego otrzymuje się fragmenty DNA różnej
długości, które następnie rozdziela się
elektroforetycznie.
Już zmiana pojedynczego nukleotydu w
sekwencji rozpoznawanej przez enzym
(restryktazę) spowoduje, że nie dokona on
rozcięcia DNA -> Inny rozkład prążków w
żelu .
 RT-PCR
Umożliwia przeprowadzenie PCR-u na
RNA:
1 etap to odwrotna transkrypcja
(przepisanie informacji z RNA na DNA,
dzięki enzymowi: odwrotna transkryptaza)
2 etap to standardowy PCR
ODWROTNA TRANSKRYPCJA (RT-PCR)
Stała temperatura
(370 C) w czasie 30 min.
Wyizolowane
RNA
Stabilizator
(DTT)
Odwrotna
transkryptaza
Mieszanina
RT-PCR
Bufor
z jonami
(np. Mg)
Nukleotydy
(dNTP)
Nazwa i pochodzenie
enzymu
Tth Polymerase
<- Thermus thermophilus
MMuLV
Reverse Transcriptase
<- Moloney Murine Leucemia
Jon
aktywujący
Mn++
Uwagi
Termostabilna, z jonami Mg
wykazuje aktywność
polimerazy DNA
Mg++
najpowszechniej stosowana
odwrotna Transkryptaza
Virus
AMV Reverse Transcriptase
<- Avian Myeloblastosis Virus
Cth Polymerase Klenow
<- Fragment
Carbohydrothermus
hydrogenoformans
Mg++
Coraz powszechniej
stosowana odwrotna
Transkryptaza
Stosowana w mieszaninie z
Taq polimerazą do
Mg++
jednostopniowej reakcji
RT-PCR
 ASYMETRYCZNY PCR:
Dodanie pary starterów z których jeden zostaje
całkowicie zużyty podczas pierwszych cykli
amplifikacji DNA.
(Produkt może być sondą molekularną w reakcji
hybrydyzacji lub matrycą w reakcji
sekwencjonowania.)
 AMPLIFIKACJA ALLELOSPECYFICZNA:
Ważna jest tu komplementarność nukleotydów
przy końcach 3` primerów, ponieważ umożliwia
ona elongację DNA przez polimerazę.
(Badanie polimorfizmu alleli, punktowych
mutacji, powiązań genetycznych, wyjaśnienie
działania substancji mutagennych, wykrywanie
genów sprzężonych z chorobami, badanie
lekooporności mikroorganizmów
ANALIZA PRODUKTÓW PCR
 ELEKTROFOREZA
Elektroforeza kwasów nukleinowych
obecnie przeprowadzana jest głównie na
żelach agarozowym i akryloamidowym
oraz w tzw. płynnych (nisko
spolimeryzowanych) żelach
akryloamidowych w kapilarach.
 JAK DZIAŁA?
DNA nałożony na żel agarozowy
zachowuje się jak ujemnie naładowana
cząsteczka o dużej masie. Wędruje
w kierunku anody (bieguna dodatniego),
a migracja jest hamowana przez sieć
agarozową proporcjonalnie do wielkości
cząsteczki DNA.
 ELEKTROFOREZA AKRYLOAMIDOWA
Jest powszechnie, chociaż niesłusznie
uważana za bardziej precyzyjną od
agarozowej oraz (słusznie) za tańszą.
Zaletami tego podłoża są niskie koszta
oraz możliwość wybarwiania
rozdzielonych frakcji DNA poprzez
srebrzenie, które daje wyraźne, widoczne
gołym okiem i trwałe obrazy.
ŻELE AKRYLOAMIDOWE
Barwienie żeli może być przeprowadzane
za pomocą bromku etydyny lub innego,
podobnego barwnika (np. SYBR Gold,
który jest o wiele czulszy lecz znacznie
droższy), natomiast w przypadku
elektroforezy kapilarnej szczególnie
popularne jest wielokolorowe barwienie
fluorescencyjne, wykorzystujące
wzbudzoną laserem fluorescencję
wbudowanych w łańcuch DNA
fluorochromów.
PODSUMOWANIE:
 PCR umożliwia kopiowanie DNA startując z b
małych ilości.
 Reakcja opiera się na cyklicznych zmianach
temperatury środowiska reakcyjnego.
 Polimeraza DNA amplifikuje (kopiuje) DNA przy
współudziale starterów.
 Wyniki otrzymujemy najczęściej z
wykorzystaniem elektroforezy.
HYBRYDYZACJA
Wykorzystuje sondy molekularne
(kwas nukleinowy o określonej
sekwencji), będące odcinkami
komplementarnymi do szukanych
fragmentów genomu.
 Technika, która pozwoliła na wierne
przeniesienie DNA z żelu na podłoże
umożliwiające wykonanie hybrydyzacji, nosi
nazwę Southern blot. Nazwa tej techniki
pochodzi od nazwiska jej wynalazcy, E.M.
Southerna, oraz od pomysłu polegającego na
wykorzystaniu zjawiska włosowatości dla
wymuszenia wędrówki DNA, podobnie jak przy
wciąganiu plamy wody przez bibułę. Biolodzy
molekularni szybko nazwali transfer
rozdzielonego elektroforetycznie RNA Northern blot, a transfer białka - Western blot.
HYBRYDYZACJA
METODĄ SOUTHERN BLOT

Mikromacierz
nylonowa
(powiększenie)
4 x 5 mm

Mikromacierz
nylonowa
8 x 12 cm
Nowoczesne
mikromacierze
Powiększenie

SONDY MOLEKULARNE
SONDY MOLEKULARNE
 HYBRYDYZACJA in situ (FISH)
Pozwala zlokalizować sekwencję kwasu
nukleinowego w komórce lub
odpowiednim rejonie chromosomu.
Znakomita większość sond
wykorzystywanych w metodzie FISH
znakowana jest bezpośrednio
fluorochromem. Najczęściej stosowanymi
fluorochromami są fluoresceina (FITC),
rodamina, czerwień teksańska (Texas
Red) i Aqua (DEAC).

Obraz chromosomów
komórek linii raka

prostaty
Metoda M-FISH
Hybrydyzacja
in situ multipleksowa
Hybrydyzacja in situ genu Pax3
(zarodek myszy)
Hybrydyzacja in situ gadzich
komórek wątroby (wykrywanie
adenowirusów)
SEKWENCJONOWANIE
Polega na określeniu sekwencji nukleotydów
w łańcuchu DNA
Metoda chemiczna
– chemiczne
rozszczepianie
kolejnych
nukleotydów
badanego
fragmentu DNA.
Metoda enzymatyczna (Sangera) –
synteza komplementarnej nici DNA na
matrycy wykorzystująca system
znakowania trójfosforanów czterech
dideoksynukleotydów fluorochromami w
czterech różnych kolorach oraz PCR, są
3 warianty:
1. Dye Primer Sequencing - przeprowadza się cztery
niezależne reakcje PCR z czterema porcjami primera,
każda porcja znakowana jest fluorochromem w innym
kolorze. Produkty czterech reakcji miesza się i analizuje
wspólnie.
2. Cycle Sequencing - startuje się z bardzo małą ilością
DNA, przeprowadza reakcję PCR, a po każdej denaturacji
termicznej uzyskuje się coraz dłuższy łańcuch
zakończony znakowanym nukleotydem.
3. Dye Terminator Sequencing - używa się mieszanki nie
znakowanych trójfosforanów nukleotydów i znakowanych
trójfosforanów dideoksynukleotydów. Była stosowana
przez konkurujące zespoły naukowe które z sukcesem
zakończyły sekwencjonowanie genomu człowieka.
Schemat automatycznego sekwencjonowania DNA
Starter komplementarny do matrycy DNA
3’
5’
GCCTAGGGTTTGCGCTAC
3’
CGGATCCCAAACGCGATGCAGGCATGCAATGACC
dATP
dGTP
dTTP
dCTP
5’
ddATP
ddGTP
ddTTP
ddCTP
Terminatory
znakowane
fluorescencyjnie
Wydłużanie startera przy użyciu polimerazy DNA
Rozdział produktów reakcji w
automatycznym sekwenatorze

GTCCGTACGTTACTGddG
GTCCGTACGTTACTddG
GTCCGTACGTTACddT
GTCCGTACGTTAddC
GTCCGTACGTTddA
GTCCGTACGTddT
GTCCGTACGddT
GTCCGTACddG
GTCCGTAddC
GTCCGTddA
GTCCGddT
GTCCddG
GTCddC
GTddC
GddT
ddG
Metoda
Sangera
Typowe obrazy wyświetlane
przez sekwencjonometr
-=*=-