mechanizm podziału i starzenia
advertisement
MIKROBIOLOGIA drożdże Cykl rozwoju komórki drożdżowej mechanizm podziału i starzenia dr inż. Aleksander Poreda, dr inż. Piotr Antkiewicz Uniwersytet Rolniczy w Krakowie Anna Borla, Bożena Stefaniak Koło Naukowe Technologów Fermentacji i Mikrobiologów, UR Kraków Już pod koniec lat 60. amerykański naukowiec Leland Hartwell zaczął wykorzystywać możliwości metod genetyki do badań nad cyklem rozwoju komórki. Hartwell analizował drożdże Saccharymyces cerevisiae, a dzięki serii pomysłowych eksperymentów w latach 1970-71 udało mu się wyizolować komórki, w których geny zarządzające procesami rozwoju były zmienione (zmutowane). W ten sposób uczony odkrył ponad 100 genów, uczestniczących bezpośrednio w procesach regulacji rozwoju komórki, które nazwał genami CDC (cell division cycle - cykl podziału komórki). Jeden z nich, określony przez Hartwella jako CDC28, decyduje o pierwszym „kroku” rozpoczynającym proces podziału, nazywanym również „START”. Około 30 lat później, w roku 2001, Zgromadzenie Nagrody Nobla w szwedzkim Instytucie Karolińskim postanowiło, że Leland Hartwell otrzyma z dwoma innymi naukowcami (Tim Hunt i Paul Nurse) Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny i fizjologii za odkrycie „najważniejszych regulatorów cyklu komórkowego”. W uzasadnieniu stwierdzono, że nagrodzeni dokonali ważnych odkryć, dotyczących mechanizmów regulujących cykl rozwoju komórki. Ich odkrycie dotyczy wszystkich organizmów eukariotycznych drożdży, roślin, zwierząt, a także człowieka. „Stwierdzili oni, że zaburzenia regulacji cyklu komórkowego mogą prowadzić do wystąpienia w chromosomach defektów spotykanych w komórkach rakowych. W przyszłości ich dokonania mają otworzyć nowe możliwości leczenia nowotworów” – można przeczytać w oficjalnym komunikacie Zgromadzenia Nagrody Nobla. Agro Przemysł 3/2008 Cykl życiowy komórki drożdżowej Kultura drożdżowa zawiera komórki, znajdujące się w określonym stadium cyklu życiowego, który obejmuje serię wydarzeń umożliwiających rozmnażanie wegetatywne nazywane podziałem komórki, które polega na przygotowaniu, wytworzeniu, i uwolnieniu komórki potomnej. Z punktu widzenia browarnika efektywność tego procesu jest krytyczna dla uzyskania odpowiedniej ilości biomasy i przeprowadzania wydajnej fermentacji. W przemyśle piwowarskim odpowiedni przyrost biomasy ważny jest również ze względu na fakt wielokrotnego wykorzystania gęstwy drożdżowej do prowadzenia kolejnych fermentacji. Cykl życiowy komórki można podzielić na pięć faz: G0, G1, S, G2, i M (rys. 1). Pierwsza faza (G1), poprzedzająca rozpoczęcie podziału chromosomalnego DNA, stanowi fazę wzrostu, podczas której komórka musi się odpowiednio powiększyć, zanim rozpocznie się przejście do kolejnych faz cyklu, komórka musi osiągnąć określony, minimalny rozmiar. Komórki potomne, które jeszcze nie uległy podziałowi są mniejsze niż komórki-matki, w związku z czym czas trwania fazy G1 w ich przypadku jest dłuższy. Różnica w czasie trwania fazy G1 między komórkami potomnymi a ich komórkami-matkami nazywana jest „asymetrią matki-córki”, dzięki czemu komórki potomne można rozpoznać na podstawie zarówno ich rozmiaru, jak i szybkości rozmnażania. Rys. 1. Cykl życiowy komórki drożdżowej (na podstawie Smart, 1999) 47 MIKROBIOLOGIA drożdże Po osiągnięciu przez komórkę określonej wielkości rozpoczyna się następny etap (S). Podczas fazy S następuje synteza DNA - podwojenie ilości materiału genetycznego (replikacja DNA), które prowadzi do powstania kopii każdego chromosomu , natomiast w fazie mitozy (M) dochodzi do rozdzielenia chromosomów i podziału całej komórki na dwie komórki potomne, które dziedziczą identyczny garnitur chromosomów. Po fazie M następuje podział komórki, przy czym rozpoczęcie kolejnego cyklu rozmnażania nie jest uzależnione od całkowitego oddzielenia się komórki potomnej. Niepełne oddzielanie się komórki potomnej od komórki-matki, może skutkować tworzeniem się łańcucha, charakterystycznego dla niektórych fenotypów wybranych szczepów drożdży browarniczych. G1 i G2 to fazy wzrostu (ang. growth phase), charakteryzujące się różną długością trwania, umożliwiające wytworzenie organelli oraz prowadzenie procesów życiowych takich jak wzrost i rozwój. W fazie (G 2) komórka „upewnia się”, że replikacja DNA została zakończona i przygotowuje się do podziału. Po podziale, komórka potomna znajduje się w fazie G1. Natomiast warto wiedzieć, że nie wszystkie komórki, które znajdą się w pierwszej fazie - G1, automatycznie przechodzą do następnych etapów. Niektóre osiągają stan spoczynku (G0) – na przykład na skutek niesprzyjających warunków środowiskowych (w tym przypadku po ponownym nastaniu sprzyjających warunków wzrostu mogą znowu powrócić do stanu G1 i kontynuować cykl podziału). Wejście komórki w stan G0 może być również spowodowane przeprowadzeniem wszystkich „zaprogramowanych” dla danej komórki podziałów, czyli naturalnie wyczerpaną zdolnością do dalszej reprodukcji – w tym przypadku jest to przejście nieodwracalne. Długość czasu potrzebnego na odbycie pełnego cyklu rozwoju jest różna dla różnych typów komórek. Większość komórek ssaków potrzebuje na to od 10 do 30 godzin, natomiast drożdże wymagają ok. 2h na przeprowadzenie cyklu podziału. komórkowej – cała synteza ściany następuje od razu w komórce potomnej. Na tym etapie mamy do czynienia ze wzrostem wzdłuż dłuższej osi pączka (etap II). Po osiągnięciu rozmiaru ok. 2/3 komórki-matki, pączek zaczyna wzrastać we wszystkich kierunkach, a materiał ściany komórkowej jest rozkładany równomiernie na całej powierzchni pączka (III). Podczas odłączania pączka następuje synteza ściany komórkowej od wewnętrznej strony komórki-matki, w miejscu oddzielania się pączka (etap IV). Linia przerywana wskazuje obecność chityny, która w komórce potomnej syntezowana jest głównie dopiero po cytokinezie. dostępności składników odżywczych i prawidłowego zakończenia poprzedniego cyklu. Na podstawie wyników swoich prac Hartwell sformułował pojęcie „punktu kontrolnego”, tzn. zatrzymania cyklu komórkowego w sytuacji, gdy DNA zostało uszkodzone. Dzięki temu mechanizmowi komórka zyskuje czas na naprawę łańcucha DNA przed wejściem w następną fazę cyklu, która następuje dopiero po potwierdzeniu bezbłędnego zakończenia poprzedniego etapu. Ważnym dla sukcesu całego procesu podziału jest uzyskanie przez komórkę potomną prawidłowej liczby chromosomów. W organizmach wyższych wszystkie rodzaje Rys. 2. Biosynteza ściany komórkowej podczas podziału komórki (na podstawie Smits i in., 2001) Regulacja cyklu komórki Pod koniec fazy G1, przed zainicjowa- Drożdże Saccharomyces cerevisiae regulują swój cykl życiowy przy pomocy złożonego systemu sieci genów. Ponad sto genów tego systemu odkrył Leland Hartwell, nazywając je cdc (ang. cell division cycle) – geny cyklu podziału komórki. Podczas etapu G1 znaczącą rolę odgrywa gen cdc28, decydujący o rozpoczęciu całego ciągu przemian, z uwagi na jego rolę nazywa się go również genem START. Po przejściu przez etap START, zewnętrzne czynniki środowiskowe, takie jak stres czy brak składników odżywczych nie są już w stanie powstrzymać procesu podziału. Podczas fazy logarytmicznego wzrostu liczba komórek które przeszły przez ten etap jest porównywalna do liczby pozostałych komórek. Niemożność przejścia przez punkt START skutkuje ograniczeniem podziału komórek i wejściem kultury w stacjonarną fazę wzrostu, nazwaną G0. Przejście do fazy G0 może być wywoływane, między innymi, komórek rakowych charakteryzują się właśnie nieprawidłową liczbą chromosomów. Także wiele wad wrodzonych związanych jest z niezachowaniem określonej dla danego organizmu liczby chromosomów. Paul Nurse, podobnie jak Hartwell, badał cykl rozwoju komórki przy użyciu metod genetycznych. W swoich eksperymentach wykorzystywał komórki drożdży Schizzosaccharomyces pombe. W połowie lat 70. Nurse odkrył w komórkach S. pombe gen cdc2 , a następnie opisał złożoną rolę, jaką produkt tego genu odgrywa w procesie regulacji cyklu komórkowego (np. przejście z fazy G2 do M, ale także - analogicznie jak gen cdc28 odkryty przez Hartwella – z G1 do S). W ten sposób ustalono, że cdc2 reguluje różne fazy cyklu komórkowego. W 1987 r. Nurse odkrył odpowiadający mu gen w organizmie człowieka, nazwany później CDK1 (ang. cyclin-dependent kinase - kinaza zależna od cykliny 1). Gen niem nowego cyklu podziału na wewnętrznej powierzchni komórki pojawia się oczko chitynowe, wskazujące na miejsce powstawania pączka (rys. 2, etap I). Podczas wzrostu pączka w komórce-matce nie jest gromadzony materiał budulcowy ściany przez niekorzystne warunki otoczenia, np. wyczerpanie składników odżywczych. Szybkość rozmnażania jest determinowana przez wzrost pojedynczej komórki. Zapoczątkowanie nowego cyklu podziału jest zależne od rozmiaru komórki, jej wieku, CDK1 koduje białko należące do klasy tzw. kinaz zależnych od cykliny. Nurse wykazał, że aktywacja tych białek jest związana z procesami odwracalnej fosforylacji (przyłączania grup fosforanowych do cząsteczki białka lub ich odłączania). Biosynteza ściany komórkowej podczas cyklu komórkowego 48 3/2008 Agro Przemysł MIKROBIOLOGIA drożdże Liczba przeprowadzonych podziałów Średnica komórki [µm] Powierzchnia komórki [µm2] Objętość komórki [µm3] 0 6,4 133,9 153,6 2 7,4 172,1 214,3 4 8,2 212,7 294,0 6 8,7 239,1 348,9 8 9,0 257,4 390,1 Tab. 1. Zmiany w komórkach drożdżowych związane z procesem starzenia Pierwszą cyklinę odkrył na początku lat 80. Tim Hunt. Cykliny to białka, które powstają i ulegają rozkładowi podczas każdego cyklu komórkowego. Nazwa odzwierciedla charakterystyczne cykliczne zmiany ich stężenia w przebiegu jednego cyklu. Wiążą się one z cząsteczkami CDK, regulując ich aktywność i wybierając te cząsteczki, które zostaną poddane fosforylacji. Cykliczny rozkład cząsteczek białek to mechanizm regulacyjny o ważnym ogólnym znaczeniu dla cyklu komórkowego organizmów żywych. Koordynacja poszczególnych faz rozwoju komórki ma podstawowe znaczenie dla rozwoju wszystkich organizmów eukariotycznych. Konieczne jest zachowanie prawidłowej sekwencji etapów rozwoju oraz zakończenie jednej fazy przed rozpoczęciem następnej. Wynikiem błędów koordynacji mogą być zmiany polegające na utracie całych chromosomów lub ich fragmentów, zamianie miejscami lub nierównym ich rozłożeniu w komórkach potomnych. Takie zmiany na poziomie chromosomów często spotyka się w komórkach nowotworowych. Starzenie się – genetyczna regulacja procesu Starzenie się to uniwersalna cecha, charakteryzująca wszystkie organizmy eukariotyczne. Mechanizm starzenia się i zamierania drożdży nie jest do końca poznany. Najwcześniejsze hipotezy odnosiły się do zależności między wstrzymaniem podziału komórki a stosunkiem powierzchni do objętości. Wykazywano, że wraz z postępem wieku komórka drożdżowa rośnie, a po osiągnięciu krytycznego rozmiaru rozpoczyna się proces starzenia. Niektórzy naukowcy wykazali, że zbyt duża liczba blizn pączkowych może ograniczać powierzchnię do występowania nowych pączków, a także wymianę związków odżywczych z otoczeniem. Te badania nie zostały jednak potwierdzone przez inne ośrodki badawcze, w których udowodniono, że wzrost stężenia chityny (głównego składnika blizn) w drożdżach mutowanych genetycznie nie miał wpływu na ich długość Agro Przemysł 3/2008 życia. Można więc uznać, że rozmiar komórki oraz liczba blizn, jako takie nie stanowią głównej przyczyny procesu starzenia, ale są ubocznymi skutkami postępu cyklu życiowego komórki. Oprócz tego następuje wiele innych zmian towarzyszących procesowi starzenia (tab. 1). Proces starzenia związany jest z liczbą podziałów danej komórki, a jego postęp może być mierzony liczbą blizn na powierzchni komórki, wywołanych oddzieleniem się pączka. W ostatnich latach wzrasta liczba zwolenników teorii o genetycznej kontroli procesu starzenia komórek drożdżowych. Sugeruje się, że starzenie komórki zachodzi poprzez genetyczną inhibicję tworzenia białek i enzymów niezbędnych w metabolizmie, takich jak enzymy naprawiające DNA czy też antyoksydanty. Możliwe również, że dochodzi do aktywacji genów dających białka bezpośrednio ograniczające syntezę DNA. Dotychczas zidentyfikowano już kilka genów (dokładny opis w Powell i in., 2000), z których wymienić należy LAG1 i LAG2 (ang. Longevity Assurance Gene), których wysoka ekspresja znacznie wydłuża życie komórki, natomiast ograniczenie ich ekspresji, ma skutek odwrotny. Zmiany fizjologiczne związane ze starzeniem W konsekwencji starzenia się w komórkach drożdży dochodzi do pewnych modyfikacji. Mogą one mieć charakter fizjologiczny, genetyczny, metaboliczny i morfologiczny. Zmiany fizjologiczne, kojarzone ze starzeniem są szczególnie dostrzegalne na powierzchni komórki i obejmują w szczególności strukturalne modyfikacje ściany komórkowej, które mogą wskazywać na wiek komórki. Ściana komórki jest wysoce dynamiczną strukturą, w której, w miarę wzrostu i rozwoju, może dochodzić do permanentnych zmian, zarówno jeśli chodzi o jej właściwości jak i określone funkcje. Zachodzące równolegle ze starzeniem komórki modyfikacje ściany komórkowej, obejmują wzrost rozmiaru, marszczenie powierzchni komórki w wyniku spadku turgoru i zmianę w składzie chemicznym ściany komórkowej. Ściana komórkowa składa się z glukanu, mannanu oraz małej ilości protein, lipidów i chityny. Chityna, drugorzędny składnik ściany komórkowej, jest w głównej mierze ulokowany po stronie wyłaniającego się pączka i jest produkowana w okresie bezpośrednio poprzedzającym, a także w trakcie trwania podziału komórkowego. Komórki S. cerevisiae mogą przed śmiercią ulegać podziałowi około 30-50 razy, w konsekwencji czego, poziom chityny wzrasta stale przez cały okres życia. Po cytokinezie na powierzchni komórki-matki powstaje blizna pączkowa (fot. 1), która składa się prawie wyłącznie z kompleksów chitynowo - glukanowych wzmocnionych przez warstwę glukanowo – mannanową. Komórki potomne utrzymują mniej wystającą strukturę, znaną jako blizna porodowa (birth-scar). Wykazano, że blizna ta zawiera mało lub w ogóle nie zawiera chityny, ale dokładna jej struktura nie jest jeszcze poznana. Ilość blizn pączkowych na powierzchni komórki jest funkcją podziałów, dlatego ich policzenie umożliwia ustalanie przeciętnego wieku komórek w populacji. Fot. 1 Komórki drożdży – oddzielanie się komórki potomnej i widoczne blizny pączkowe na powierzchni komórki-matki Śmierć komórki Śmierć komórki może nastąpić na dwa odrębne sposoby: zejściem nekrotycznym (martwica) lub zaprogramowaną - śmiercią naturalną. Nekrozę definiujemy jako nagromadzenie nienaprawialnych zniszczeń wewnątrzkomórkowych składników komórki, wpływających na jej integralność, prowadzących do śmierci lub autolizy komórki. Tego typu zniszczenia następują jako efekt nadmiernego - jednokrotnego oddziaływania czynników stresowych, czy też powtarzalnego oddziaływania łagodnych czynników stresowych. Natomiast zejście naturalne jest wynikiem kontrolowanych genetycznie przemian, prowadzących ze stanu młodości do starości, związanych z przeprowadzeniem „zaprogramowanej” liczby podziałów danej komórki (rys. 3). 49 MIKROBIOLOGIA drożdże Rys. 3 Model ilustrujący przejście ze stanu dziewiczej komórki potomnej do stanu niezdolności do dalszego podziału Starzenie się drożdży piwowarskich Drożdże Saccharomyces cerevisiae posiadają ograniczoną długość życia, determinowaną przez zdolność do rozmnażania. Każda komórka w populacji posiada zdolność do przeprowadzenia określonej, ograniczonej liczby podziałów. Wykazano, że zarówno drożdże dolnej jak i górnej fermentacji charakteryzują się ograniczoną, poprzez liczbę podziałów, długością życia, która zależy od szczepu, a mieści się w granicach 10-30 podziałów. Po określeniu średniej długości życia, mierzonej możliwą liczbą podziałów komórki danego szczepu, można poczynić pewne założenia co do technologicznej przydatności danego szczepu. Na przykład szczepy o niskiej liczbie Hayflicka nie nadają się zbytnio do systemów ciągłych lub immobilizowanych. W każdym z wymienionych typów technologii następuje wprawdzie Cecha/parametr Rozmiar komórki Kształt komórki Liczba blizn pączkowych Stężenie chityny w ścianie komórkowej Rozmiar wakuoli Poziom rRNA Synteza białek Aktywność rybosomów Czas trwania cyklu – generacji komórki Marszczenie powierzchni Spadek turgoru Liza komórek podział komórek, jednak komórki potomne mają tendencję do bycia wypłukiwanymi z reaktora. Z uwagi na fakt, że duża część młodych komórek jest ciągle usuwana, pozostała populacja staje się coraz starsza. W odniesieniu do drożdży browarniczych główną zmianą w fizjologii komórek, związaną ze starzeniem, jest wzrost rozmiarów (tab. 2). W związku z szybszą sedymentacją komórek większych (starszych), może dochodzić do sytuacji rozwarstwienia wiekowego i usuwania poszczególnych frakcji wiekowych podczas kolejnych obciągów gęstwy ze stożka tankofermentora. Z uwagi na fakt różnicy w ekspresji poszczególnych genów w zależności od wieku komórki, właściwe zbalansowanie wiekowe gęstwy pobieranej do przeprowadzenia kolejnej fermentacji gwarantować będzie optymalny przebieg procesu. Natomiast nieTyp zmiany Wzrost Zmieniony Wzrost Wzrost Wzrost Wzrost Ograniczona Ograniczona Wzrost Wzrost - Tab. 2 Zmiana rozmiarów komórek drożdżowych jako funkcja wieku (średnia z pomiaru 30 komórek) 50 odpowiednie przesunięcie ciężaru w stronę komórek zbyt młodych lub zbyt starych, może wpływać na kilka parametrów metabolicznych, docelowo negatywnie oddziaływując zarówno na wydajność fermentacji jak i jakość produktu finalnego. Podsumowując, należy stwierdzić, że starzenie się komórek drożdżowych szczepów browarniczych może wpływać na przebieg procesu fermentacji, a odpowiednie zarządzanie gęstwą, a w szczególności dobór parametrów jej odbierania z CKT pozwala na wybór profilu wiekowego populacji używanej do kolejnych rzutów fermentacyjnych. Tej kwestii zostanie poświęcony oddzielny artykuł. Literatura 1. Górnicz M., Stankiewicz M., Medyczny Nobel 2001, Gazeta Lekarska, 11, 2001, 2. Hartwell L.H., Saccharomyces cerevisiae cell cycle, Bacteriology Reviews, 38, 164-198, 1974. 3. Lew D.J., Reed S.I., A cell cycle checkpoint monitors cell morphoogenesis in budding yeast, Current Opinions in Genetic Dev, 129, 739-740, 1995. 4. Mortimer R.K., Johnston J.R., Life span of individual yeast cells, Nature, 183, 1751-1752, 1959. 5. Powell C.D., Quain D.E., Smart K.A., Chitin scar breaks in aged Saccharomyces cerevisiae, Microbiology, 149, 3129-3137, 2003. 6. Powell C.D., Van Zandycke S.M., Quain D.E., Smart K.A., Replicative ageing and senescence in Saccharomyces cerevisiae and the impact on brewing fermentations, Microbiology, 146, 1023-1034, 2000. 7. Smart K.A., Ageing In brewing yeast, Brewers,Guardian, 128, 19-24, 1999. 8. Smits G.J., Ende H., Klis F.M., Differential regulation of cell wall biogenesis during growth and development in yeast, Microbiology, 147, 781-794, 2001. 3/2008 Agro Przemysł
