Nowe spojrzenie na dotychczas potwierdzone i poszukiwanie nowych, opartych o geno/metabolomikę markerów cukrzycy typu MODY OPIS PROJEKTU Cukrzyca nie jest pojedynczą chorobą, ale grupą wielu zaburzeń metabolicznych, których wspólną cechą jest przewlekle podwyższony poziom glukozy. Ostatni podział zaproponowany przez WHO w 1999 roku dzieli cukrzycę według etiologii. Współcześnie leczenie cukrzycy u poszczególnych pacjentów może być dobrane na podstawie właściwie przeprowadzonej diagnostyki różnicowej. Obejmuje ona często badania genetyczne. Przedmiotem projektu „Nowe spojrzenie na dotychczas potwierdzone i poszukiwanie nowych, opartych o geno/metabolomikę markerów cukrzycy typu MODYjest głównie cukrzyca MODY (maturity onset diabetes of the young). Cukrzyca monogenowa, w tym MODY, jest przykładem obszaru efektywnej interakcji między kliniczną genetyką molekularną a praktyką diabetologiczną. Taka interakcja może prowadzić do poprawy opieki nad pacjentem, zmiany decyzji terapeutycznych, do poprawy wyrównania metabolicznego i jakości życia oraz zmniejszenia częstości przewlekłych powikłań. Ocenia się, że w Europie cukrzyca monogenowa może dotyczyć około 1-2% wszystkich pacjentów, co w liczbach bezwzględnych wynosi około 500 000 ludzi na kontynencie. W Polsce liczba ta może więc wynosić około 40 000. Zdecydowana większość przypadków łączy się z MODY, która jest autosomalną dominującą formą cukrzycy o wczesnym początku. Nie stanowi ona jednolitego wariantu choroby, lecz wykazuje heterogenność pod względem etiologicznym i klinicznym. Do końca 2008 roku opisano 6 podtypów MODY uwarunkowanych mutacjami w różnych genach. Najczęstsze formy tej cukrzycy to MODY2 związana z mutacjami w glukokinazie oraz MODY3, za którą odpowiada gen HNF-1. Forma MODY1 (HNF-4) jest trzecią co do liczebności. W sumie MODY1, -2 i -3 odpowiadają za ponad 90% wszystkich przypadków MODY. Niestety problemy organizacyjne i finansowe powodują, że zdecydowana większość wspomnianych pacjentów nie jest właściwie zdiagnozowana, a co za tym idzie nie otrzymuje optymalnej terapii. Jedną z przyczyn jest niewystarczająca świadomość znaczenia diagnostyki różnicowej wśród lekarzy pierwszego kontaktu i specjalistów diabetologii. Pomimo, iż cukrzyca typu MODY jest przedmiotem intensywnego zainteresowania klinicystów, ciągle nie wiemy wszystkiego na temat biologii tej formy cukrzycy. Nie wiem np. czym tłumaczyć istotne różnice w przebiegu klinicznym choroby u nosicieli tej same mutacji (wiek diagnozy, dawka leku potrzebna do utrzymania zadowalającego wyrównania metabolicznego, BMI). Różnice te mogą być spowodowane obecnością w genach innych niż odpowiedzialne za rozwój cukrzycy typu MODY, na przykład w genach modyfikujących ryzyko rozwoju cukrzycy typu 2. Problem ten był w przeszłości przedmiotem prac badawczych prowadzonych przez Kierownika Projektu. Niestety badania te prowadzone przed erą sekwencjonowania nowej generacji (New Generation Sequencing) nie przyniosły oczekiwanych rezltatow. Dzisiaj uczelnia nasza dysponuje najnowocześniejszym sprzętem do sekwencjonowania nowej generacji i projekt taki, oparty o oryginalny pomysł, ma szanse realizacji. Być może różnic te związane są z czynnikami wpływającymi na wrażliwość na insulinę chorych z cukrzycą typu MODY. Jednym z elementów modyfikujących stopień wrażliwości na insulinę może być subkliniczny stan zapalny generowany przez bakteryjną florę bakteryjną. Zarówno cukrzyca jak i inne choroby metaboliczne zawiązane z zaburzeniami odżywiania. Za proces przyswajania składników odżywczych jak i za to w jaki sposób przebiega proces trawienia pokarmu w dużym stopniu odpowiedzialna jest flora bakteryjna i grzybicza przewodu pokarmowego. Ma ona wpływ na tempo rozkładu złożonych węglowodanów na cukry proste co jest niezwykle istotne dla utrzymania prawidłowej glikemii i całego metabolizmu lipidow. W cukrzycy typu 1, choć jej patogeneza jest właściwie wyjaśniona, postulowane są czynniki zewnętrze, które mogą indukować rozpoczęcie procesu patologicznego, w tym właśnie flora przewodu pokarmowego. W ostatnich latach w skutek coraz większego przyrostu wiedzy na temat funkcjonowania przewodu pokarmowego człowieka, a w szczególności roli jaką odgrywa w nim tzw. jelitowa flora mikroorganizmów która go zasiedla (komensalna flora jelitowa), pojawiają się informacje o istotnym wpływie tych drobnoustrojów na funkcjonowanie całego organizmu oraz na jego stan zdrowia. Komensalna flora przewodu pokarmowego odgrywa istotną rolę w procesie trawienia i przyswajania składników pokarmowych oraz wykazuje działanie ochronne przed inwazją mikroorganizmów patogennych poprzez tworzenie oporności na kolonizację i oddziaływanie na system immunologiczny organizmu gospodarza. Liczba komórek bakteryjnych zasiedlających ludzkie przewód pokarmowy wzrasta pod względem jakościowym jak i ilościowym począwszy od żołądka a skończywszy na jelicie grubym (okrężnicy). W całym jelicie grubym (okrężnica) populacja bakterii wynosi około 1014, czyli 100 trylionów - w jednym mililitrze treści jelitowej znajduje się ok. 1011 cfu/ml. W skład mikroflory okrężnicy wchodzą głównie bakterie beztlenowe (Clostridium, Eubacterium, Bacteroides; Bifidobacterium) oraz w mniejszych liczbach, przedstawiciele bakterii tlenowych i względnie beztlenowych (Enterobacteriaceae; Streptococcus; Staphylococcus; Lactobacillus). W literaturze fachowej pojawiają się doniesienia na temat wpływu flory przewodu pokarmowego na rozwój otyłości i cukrzycy typu 2 zarówno u ludzi jak i w modelach zwierzęcych tych chorób. Wydaje się, iż jednym z istotnych elementów oddziaływania flory bakteryjnej na gospodarkę węglowodanową u człowieka jest generowanie subklinicznego stanu zapalnego i w ten sposób wpływanie na wrażliwość na insulinę. Nie wydaje się, aby struktura bakteryjnej flory jelitowej miała istotne znaczenie dla samego faktu pojawienia się cukrzycy monogenowej, ale struktura tej flory może np. modyfikować przebieg kliniczny cukrzycy. Porównanie struktury bakteryjnej flory jelitowej u chorych z HNF1A MODY, cukrzycy typu 2 i osób zdrowych może wskazać na elementy jelitowej flory bakteryjnej swoiste dla chorych z cukrzycą monogenową, co w przyszłości może stać się potencjalnym celem interwencji terapeutycznej. Jedną z charakterystycznych cech klinicznych cukrzycy typu HNF1A jest obniżenie progu nerkowego dla glukozy. Co ciekawe, jedna z nowych grup leków zarejestrowanych w ostatnim czasie do leczenia cukrzycy typu 2 - tzw. Flozyny, działają właśnie poprzez obniżenie progu nerkowego dla glukozy. Można się spodziewać, iż reakcja pacjentów z HNF1A MODY i cukrzycą typu 2 na jednorazowe, diagnostyczne podanie podanie flozyny może być bardzo różna i może być podstawą stworzenia testu diagnostycznego różnicującego cukrzycę HNF1A od cukrzycy typu 2. 2 Jednym z elementów realizacji grantu ma być wreszcie nowe spojrzenie na sprawdzone dotąd biomarkery cukrzycy typu MODY. Należą do nich przede wszystkim 1.5 anhydroglucitol i hsCRP. Biomarkery te, analizowane osobo, miały umiarkowana wartość diagnostyczna, w ramach realizacji niniejszego projektu planowane jest dokonanie jednej analizy z uwzględnieniem obu tych biomerkerów jednocześnie. Główne założenia i cele realizacji Grantu 1. Testowanie nowych genetycznych i nie-genetycznych markerów pozwalających na diagnostykę różnicową w obrębie monogenowych form cukrzycy i odróżnianie form mono- od wielogenowych. Identyfikacja nowych, tanich, możliwych do zastosowania na szeroką skalę testów diagnostycznych pozwoli na efektywną diagnostykę różnicową typu cukrzycy. Testy o charakterze tak genetycznym jak i nie-genetycznym stosowane będą zarówno dla odróżniania wielo- od monogenowych form cukrzycy oraz dla diagnostyki różnicowej typu cukrzycy monogenowej. W zależności od czułości i swoistości zastosowanego testu na ich podstawie albo będzie stawiana diagnoza i będzie wdrażane stosowne leczenie albo też pacjenci będą kierowani do dalszych badań genetycznych dla ostatecznego potwierdzenia diagnozy. W ramach niniejszej analizy planowana jest z jednej strony łączna ocena 1.5 anhydroglucitolu i hsCRP jako jednego testu różnicującego HNF1A MODY od cukrzycy typu 2. Z drugiej strony planowana jest ocena stopnia glikozurii u chorych z cukrzycą typu 2 vs pacjenci z HNF1A MODY po jednorazowym podaniu dapaliflozyny, także jako prostego testu pomagającego w różnicowaniu cukrzycy typu HNF1A i cukrzycy typu 2. 2. Poszerzenie wiedzy na temat biologii cukrzycy monogenowej. Zakładana w ramach realizacji grantu analiza jakościowa i ilościowa flory bakteryjnej stolca pacjentów z cukrzycą monogenową, porównanie jej z florą bakteryjną osób zdrowych oraz chorych z cukrzycą typu 1 może wnieść nowe informacje na temat pozahormonalnych efektów mutacji w genach prowadzących do rozwoju monogenowych form cukrzycy. 3.Określenie czynników wpływających na przebieg naturalny cukrzycy typu HNF1A MODY. Cukrzyca monogenowa często uważana jest za mniej groźną, łagodniejszą formę choroby w stosunku do np. cukrzycy typu 1. Niemniej jednak także w cukrzycy monogenowej dochodzi do rozwoju przewlekłych powikłań choroby, które doprowadzać mogą do kalectwa albo istotnego skrócenia przeżycia. Celem realizacji grantu będzie określenie czynników ryzyka rozwoju powikłań choroby w cukrzycy monogenowej i określenie 3 skutecznych metod zapobiegania tym powikłaniom. Szczególny nacisk zostanie położony na identyfikację czynników genetycznych (innych, niż mutacja będąca w sposób bezpośredni odpowiedzialna za rozwój choroby) modyfikujących przebieg kliniczny cukrzycy typu MODY. W ramach realizacji grantu będziemy się także starać zidentyfikowac czynniki genetyczne decydujące o przebiegu klinicznym choroby, tzn. o wieku rozpoznania cukrzycy, koniecznej dawce lekow itp. W podsumowaniu należy podkreślić, iż realizacja projektu „Nowe spojrzenie na dotychczas potwierdzone i poszukiwanie nowych, opartych o geno/metabolomikę markerów cukrzycy typu MODY” ma służyć przede wszystkim poprawie wykrywalności i optymalizacji leczenia pacjentów z monogenowymi formami cukrzycy. Te formy cukrzycy nie są wprawdzie zbyt częste, ale z punktu widzenia indywidualnego pacjenta postawienie właściwej diagnozy może mieć olbrzymie znaczenie dla prewencji przewlekłych powikłań cukrzycy i jakości ich życia. Realizacja programu pozwoli na opracowanie tanich i prostych algorytmów diagnostycznych służących identyfikacji osób z cukrzycą monogenową, pozwoli na unikanie „przediagnozowywania” w diagnostyce różnicowej, tzn. obejmowania drogimi badaniami w poszukiwaniu cukrzycy monogenowej pacjentów, u których ryzyko obecności takiej formy cukrzycy jest minimalne. Z drugiej strony, ograniczone zostanie „niedodiagnozowanie”, czyli brak (głównie z uwagi na barierę cenową) diagnostyki różnicowej u osób o najwyższym ryzyku obecności cukrzycy monogenowej. W wyniki realizacjgrantu efektywna diagnostyka różnicowa typu cukrzycy powinna stać się dostępna dla wszystkich pacjentów, którzy jej wymagają. Część kliniczna: Kluczowym zadaniem części klinicznej jest zebranie próbek do badań laboratoryjnych u pacjentów spełniających kryteria wejścia do badania. Materiał do badań uzyskiwany będzie z jednokrotnego pobrania około 20 ml krwi. Próbki te mają kluczowe znaczenie dla oceny wartości markerów biochemicznych i genetycznych. Katedra i Klinika Chorób Metabolicznych UJ-CM jest w gronie ośrodków odpowiedzialnych za przeprowadzenie tej części. Przy zbieraniu próbek do wstępnej oceny jednostka będzie gromadzić charakterystykę kliniczną oraz surowicę i osocze. Kohorta pacjentów obejmować będzie osoby z cukrzycą uwarunkowaną mutacjami genu HNF-1, glukokinazy, cukrzycą typu 1 i 2 oraz grupa porównawcza (bez cukrzycy). Planowane jest także włączenie do badania pacjentów z cukrzyca typu HNF4A MODY Te grupy będą stanowić podstawę prowadzonych badań naukowych. Zidentyfikowane wstępnie biomarkery będą oceniane („walidowane”) w warunkach klinicznych. Klinicyści prowadzący badanie muszą zbierać jednolite dane według jednoznacznie określonych kryteriów. 4 1. Planowane jest jednorazowe pobranie materiału u około 200 pacjentów z cukrzycą monogenową, 100 z cukrzycą typu 1 i 100 z cukrzyca typu 2. W uzyskanym w ten sposób osoczu zostaną oznaczone stężenia 1.5 anhydroglucitolu i hsCRP. Z pobranej od pacjentów z HNF1A MODY krwi zostanie także wyizolowane DNA do badań genetycznych (w przypadku, gdyby materiał genetyczny wcześniej nie był już dostępny). Za pomoca technologii opartej o sekwencjonowanie nowej generacji podejmiemy próbę identyfikacji czynników genetycznych modyfikujących przebieg cukrzycy u tych chorych/. 2. Celem przedstawianego do oceny projektu będzie ocena mikrobiologiczna flory bakteryjnej u chorych z cukrzycą typu HNF1A MODY i porównanie jej z florą bakteryjną osób z cukrzycą typu 1 i 2 (o podobnym stopniu kontroli metabolicznej) i osób zdrowych. Materiałami poddawanymi badaniu mikrobiologicznemu będą próbki kału pobierane od wszystkich pacjentów włączonych do badania. Próbki kału będą poddawane jakościowej jak i ilościowej ocenie mikrobiologicznej z wykorzystaniem metod klasycznego posiewu mikrobiologicznego oraz biologii molekularnej. Badania mikrobiologiczne zostaną przeprowadzone w Katedrze Mikrobiologii UJ CM oraz w ramach projektu OMICRON. Pacjenci zostaną zakwalifikowani do udziału w projekcie w Katedrze i Klinice Chorób Metabolicznych UJ CM, gdzie będą pobierane próbki kału. Badana grupa chorych : 20 pacjentów z cukrzyca monogenową, 20 chorych z cukrzyca typu 1, 20 pacjentów z cukrzyca typu 2, 20 osób zdrowych. Od każdego pacjenta jednorazowo zostanie pobrana próbka kału, która będzie następnie poddana przedstawionym powyżej analizom. 3. Zastosowanie Dapagliflozyny jako testu diagnostycznego w cukrzycy typu HNF1A. Badanie zostanie przeprowadzone u 10 pacjentów z potwierdzoną wcześniej na podstawie badania genetycznego cukrzycą typu HNF1A MODY i 10 pacjentów z cukrzycą typu 2. W przypadku identyfikacji w ramach innego z projektów realizowanych w Klinice Chorób Metabolicznych pacjentów z HNF4A, 10 takich chorych także zostanie poddanych analizie. U chorych tych zostaną wykonane następujące oznaczenia biochemiczne: -Ocena cukromoczu dobowego: przed, w dniu podania leku w 3 i w 7 dniu stosowania dapaliflozyny (wraz z oceną objętości moczu). - Ocena stosunku glukozy do kreatyniny w moczu porannym przed podaniam dapagliflozyny i w dzien po jej podaniu - Porównanie opisanych powyżej parametrów dla grupy badanej i grupy kontrolnej. Wybranie parametru najlepiej dyskryminującego grupę badaną od grupy kontrolnej, z priorytetem dla testów najprostszych. Podsumowanie Realizacja nieniejszego projektu może przyczynić się do lepszego poznania biologii cukrzycy monogenowej , rozwinięcia naszych możliwości w kierunku prognozowania jej przebiegu, a przede wszystkim wczesnej i trafnej diagnozy. 5 Piśmiennictwo 1. Małecki MT: Postacie graniczne choroby: cukrzyca LADA i MODY. W „Cukrzyca” pod red. J. Sieradzkiego, ViaMedica, Gdańsk, 2006. 2. McCarthy MI, Hattersley AT: Learning from molecular genetics: novel insights arising from the definition of genes for monogenic and type 2 diabetes. Diabetes, 2008; 57:2889-98. 3. Porter JR, Barrett TG: Monogenic syndromes of abnormal glucose homeostasis: clinical review and relevance to the understanding of the pathology of insulin resistance and beta cell failure. J Med Genet, 2005; 42:893-902. 4. Hattersley AT: Maturity-onset diabetes of the young: clinical heterogeneity explained by genetic heterogeneity. Diabet Med, 1998; 15: 15-24. 5. Malecki MT, Jhala US, Antonellis A, Fields L, Orban T, Saad M, Doria A, Warram JH, Montminy M, AS Krolewski: Mutations in NEUROD1 gene are associated with the development of type 2 diabetes mellitus. Nat Genet, 1999; 23:323-328. 6. Yamagata K, Furuta H, Oda N, Kaisaki PJ, Menzel S, Cox NJ, Fajans SS, Signorini S, Stoffel M, Bell GI: Mutations in the hepatocyte nuclear factor-4 gene in the maturity-onset diabetes of the young (MODY1). Nature, 1996; 384:458-460. 7. Yamagata K, Oda N, Kaisaki PJ, Menzel S, Furuta H, Vaxillaire M, Southam L, Cox RD, Lathrop GM, Boriraj VV, Chen X, Cox NJ, Oda Y, Yano H, Le Beau MM, Yamada S, Nishigori H, Takeda J, Fajans SS, Hattersley AT, Iwasaki N, Hansen T, Pedersen O, Polonsky KS, Bell GI: Mutations in the hepatocyte nuclear factor-1 gene in maturity-onset diabetes of the young (MODY3). Nature, 1996; 384:455-458. 8. Stoffers DA, Ferrer J, Clarke WL, Habener JF: Early-onset type-II diabetes mellitus (MODY4) linked to IPF1. Nat Genet, 1997; 17:138-139. 9. Horikawa Y, Iwasaki N, Hara M, Furuta H, Hinokio Y, Cockburn BN, Lindner T, Yamagata K, Ogata M, Tomonaga O, Kuroki H, Kasahara T, Iwamoto Y, Bell GI Mutation in hepatocyte nuclear factor-1 beta gene (TCF2) associated with MODY. Nat Genet, 1997; 17:384-385. 10. Froguel P, Zouali H, Vionnet N, Velho G, Vaxillaire M, Sun F, Lesage S, Stoffel M, Takeda J, Passa P: Familial hyperglycemia due to mutations in glucokinase. Definition of a subtype of diabetes mellitus. N. Engl. J. Med. 1993; 328: 697-702. 11. Iynedjian PB, Mobius G, Seitz HJ, Wollheim CB, Renold AE: Tissue-specific expression of glucokinase: identification of the gene product in liver and pancreatic islets. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1986; 83: 1998-2001. 12. Neve B, Fernandez-Zapico ME, Ashkenazi-Katalan V, Dina C, Hamid YH, Joly E, Vaillant E, Benmezroua Y, Durand E, Bakaher N, Delannoy V, Vaxillaire M, Cook T, Dallinga-Thie GM, Jansen H, Charles MA, Clément K, Galan P, Hercberg S, Helbecque N, Charpentier G, Prentki M, Hansen T, Pedersen O, Urrutia R, Melloul D, Froguel P: Role of transcription factor KLF11 and its diabetes-associated gene variants in pancreatic beta cell function. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005; 29:48074812. 13. Fernandez-Zapico ME, van Velkinburgh JC, Gutiérrez-Aguilar R, Neve B, Froguel P, Urrutia R, Stein R: MODY7 gene, KLF11, is a novel p300-dependent regulator of 6 Pdx-1 (MODY4) transcription in pancreatic islet beta cells. J Biol Chem, 2009; 25::36482-36490. 14. Borowiec M, Liew CW, Thompson R, Boonyasrisawat W, Hu J, Mlynarski WM, El Khattabi I, Kim SH, Marselli L, Rich SS, Krolewski AS, Bonner-Weir S, Sharma A, Sale M, Mychaleckyj JC, Kulkarni RN, Doria A: Mutations at the BLK locus linked to maturity onset diabetes of the young and beta-cell dysfunction. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009; 25:14460-14465. 15. Mutations in the CEL VNTR cause a syndrome of diabetes and pancreatic exocrine dysfunction. Raeder H, Johansson S, Holm PI, Haldorsen IS, Mas E, Sbarra V, Nermoen I, Eide SA, Grevle L, Bjørkhaug L, Sagen JV, Aksnes L, Søvik O, Lombardo D, Molven A, Njølstad PR: Nat Genet, 2006; 38:54-62. 16. Van Buerck L, Blutke A, Kautz S, Rathkolb B, Klaften M, Wagner S, Kemter E, Hrabé de Angelis M, Wolf E, Aigner B, Wanke R, Herbach N: Phenotypic and Pathomorphological Characterisctics of a Novel Mutant Mouse Model for MaturityOnset Diabetes of the Young Type 2 (MODY2). Am J Physiol Endocrinol Metab, 2009 Dec 1. 17. Velho G, Froguel P, Clement K, Pueyo ME, Rakotoambinina B, Zouali H, Passa P, Cohen D, Robert JJ: Primary pancreatic beta-cell secretory defect caused by mutations in glucokinase gene in kindreds of maturity onset diabetes of the young. Lancet 1992; 340: 444-448. 18. Byrne MM, Sturis J, Clement K, Vionnet N, Pueyo ME, Stoffel M, Takeda J, Passa P, Cohen D, Bell GI: Insulin secretory abnormalities in subjects with hyperglycemia due to glucokinase mutations. J Clin Invest, 1994; 93:1120-1130. 19. Bell GI, Pilkis SJ, Weber IT, Polonsky KS: Glucokinase mutations, insulin secretion, and diabetes mellitus. Annu Rev Physiol, 1996; 58:171-186. 20. Chantelot C, Frongia AP, Toni S, Meschi F, Cerutti F, Barbetti F: Study Group of Italian Society of Pediatric Endocrinologyand Diabetology (ISPED). Maturity-Onset Diabetes of the Young (MODY) in Children with Incidental Hyperglycemia. A Multicenter Italian Study on 172 families. Diabetes Care, 2009; Jun 29. 21. Codner E, Rocha A, Deng L, Martínez-Aguayo A, Godoy C, Mericq V, Chung WK: Mild fasting hyperglycemia in children: high rate of glucokinase mutations and some risk of developing type 1 diabetes mellitus. Pediatr Diabetes, 2009; Feb 27. 22. Ellard S, Bellanné-Chantelot C, Hattersley AT: European Molecular Genetics Quality Network (EMQN) MODY group. Best practice guidelines for the molecular genetic diagnosis of maturity-onset diabetes of the young. Diabetologia, 2008; 51:546-53 23. Mitchell S, Frayling T: The role of transcription factors in maturity-onset diabetes of the young. Mol Genet Metab, 2002; 77:35-43. 24. Atkinson MA, Chervonsky A Does the gut microbiota have a role in type 1 diabetes? Early evidence from humans and animal models of the disease. Diabetologia. 2012 Aug 9. 25. Cloetens L, Ulmius M, Johansson-Persson A, Akesson B, Onning G. Role of dietary beta-glucans in the prevention of the metabolic syndrome. Nutr Rev. 2012 Aug;70(8):444-58 26. Beyan H, Wen L, Leslie RD. Guts, germs, and meals: the origin of type 1 diabetes. Curr Diab Rep. 2012 Oct;12(5):456-62. 7 27. Cani PD, Osto M, Geurts L, Everard A. Involvement of gut microbiota in the development of low-grade inflammation and type 2 diabetes associated with obesity. Gut Microbes. 2012 Jul 1;3(4). 28. Abdul-Ghani MA, Norton L, DeFronzo RA. Efficacy and safety of SGLT2 inhibitors in the treatment of type 2 diabetes mellitus. Curr Diab Rep. 2012 Jun;12(3):230-8. 8