Zastosowanie osiągnięć biologii molekularnej w mikrobiologii
advertisement
ANALITYKA Zastosowanie osiągnięć biologii molekularnej w mikrobiologii żywności ROBERT PALKA owoczesne metody mikrobiologiczne są ukierunkowane przede wszystkim na szybkie i niezawodne wykrywanie bakterii chorobotwórczych w różnego typu materiałach, w tym w żywności. Głównie potrzeba szybkiej identyfikacji drobnoustrojów zapoczątkowała w latach siedemdziesiątych XX w. dynamiczny rozwój metod diagnostycznych. Postępujący rozwój metod instrumentalnych, testów diagnostycznych oraz postęp naukowy wykorzystuje się do ulepszania metod izolacji, wczesnego wykrywania, liczenia, charakterystyki i identyfikacji mikroorganizmów. Wprowadzanie szybkich testów diagnostycznych i metod instrumentalnych do mikrobiologii żywności jest opóźnione co najmniej o 10 lat w porównaniu z mikrobiologią w medycynie. Przyczyną tak dużego opóźnienia są normy obowiązujące w mikrobiologii żywności, zwłaszcza metodyki badawcze zgodne z normami ISO i wynikający z nich konserwatyzm w stosunku do modyfikacji metod klasycznych [1]. N Konieczność wprowadzenia szybkich metod do mikrobiologicznej analizy żywności wynika głównie z ustawicznie zwiększanych wymagań dotyczących bezpieczeństwa żywności, które na początku XXI w. stało się jednym z najważniejszych zagadnień zdrowia publicznego. Lata dziewięćdziesiąte ubiegłego stulecia przeszły do historii jako okres rozpowszechnienia diagnostyki molekularnej. Różnice między diagnostyką klasyczną a molekularną polegają przede wszystkim na zwiększeniu szybkości i czułości wykonywanych badań. We współczesnej diagnostyce molekularnej stosuje się analizę restrykcyjną i hybrydyzację z sondami molekularnymi oraz amplifikację DNA metodą PCR [2]. PORTAL - www.sigma-not.pl Sondy molekularne (genetyczne) Technologia sond polega na hybrydyzacji, czyli parowaniu się cząsteczki sondy molekularnej z komplementarną sekwencją DNA lub RNA poszukiwanego drobnoustroju, a następnie detekcji utworzonego hybrydu (dupleksu) o dwuniciowej strukturze. Sonda molekularna zastosowana w optymalnych warunkach rozpoznaje sekwencje różniące się zaledwie kilkoma nukleotydami i tworzy trwałe wiązania wyłącznie z komplementarną sekwencją analizowanego kwasu nukleinowego. Najczęściej stosowanymi sondami są kwasy nukleinowe DNA lub RNA o znanej sekwencji nukleotydowej, komplementarnej do sekwencji poszukiwanej. Czułość badań hybrydyzacyjnych zależy w dużym stopniu od rodzaju i sposobu znakowania sondy. W oznaczeniach systemu Gene-Trak są stosowane 6 Streszczenie. W artykule omówiono rozwój tzw. szybkich metod mikrobiologicznych, których celem jest wykrywanie mikroorganizmów m.in. w żywności. Przedstawiono najważniejsze stosowane metody biologii molekularnej, tj. PCR i jej modyfikację – tzw. Real-Time PCR, który umożliwił ilościowe oznaczanie produktu reakcji PCR. Omówiono również technikę sond molekularnych i RFLP oraz metody detekcji nieswoistej i swoistej, związanej z produktami Real-Time PCR, tzw. sondy genetyczne i sposób ich działania na przykładzie jednej z nich. Summary. The article discusses the development of the so-called quick microbiological methods, the aim of which is detecting microorganisms, e.g. in food. The article presents the most important used methods of molecular biology, that is PCR and its modification-the so-called Real-Time PCR which allowed to mark the product of PCR reaction in terms of quantity. The article also discussed the technique of molecular probes and RFLP as well as the method of specific and non-specific detection connected with Real-Time PCR products – the so-called genetic probes and the way they work, taking as a model one of them. fluorescencyjnie znakowane sondy DNA, natomiast w systemie Gene-Probe wykorzystuje się sondy DNA znakowane akrydynowym estrem. W diagnostyce bakteriologicznej w ostatnich latach coraz częściej stosuje się sondy DNA komplementarne w stosunku do unikatowej sekwencji rybosomalnego RNA (rRNA) charakterystycznej dla analizowanego drobnoustroju. Takie rozwiązanie znacznie zwiększa czułość oznaczenia, gdyż rRNA jest integralną częścią bakteryjnego rybosomu, więc występuje w komórce w dużej liczbie kopii (1000-10 000). Oznaczenie ww. metodami składa się z trzech głównych etapów: przygotowania (liza) próbki, hybrydyzacji z sondą molekularną oraz detekcji sondy. Opracowano wiele testów identyfikacyjnych wykorzystujących sondy genetyczne oraz hybrydyzację do wykrywania i identyfikacji różnych drobnoustrojów, np. test Accu Probe Listeria Monocytogenes, który jest testem identyfikującym DNA Listerii monocytogenes. Przy użyciu tego testu jest możliwa identyfikacja kolonii wymienionego drobnoustroju w ciągu 35 min od momentu przygotowania próbki. Testy działające na tych samych zasadach opracowano też dla innych drobnoustrojów niepożądanych w żywności, np. Salmonelli, Staphylococcus aureus, E. coli O:157, Campylobacter ssp. [1]. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) W większości stosowanych obecnie metod wykorzystujących sondy molekularne kontroli żywności, dla otrzymania dodatniego wyniku konieczne jest występowanie 105-106 drobnoustrojów w formie Przemys³ Spo¿ywczy 2/2007 * Skrajny nukleotyd na jednym z końców DNA, z wolną grupą hydroksylową przy trzecim atomie węgla deoksyrybozy. 7 www.sigma-not.pl Przemys³ Spo¿ywczy 2/2007 ponownego ogrzewania próbki do temp. ok. 72°C w celu przyłączania kolejnych nukleotydów, począwszy od końca 3' * starterów (polimeryzacja DNA). Taki cykl jest powtarzany 30-40 razy w tzw. termocyklerach, czyli urządzeniach szybko zmieniających temperaturę. W każdym cyklu dochodzi do podwojenia wyjściowej liczby matryc, a po 30 cyklach reakcji liczba matryc wzrasta wykładniczo do 230 = 107 374 824. W praktyce wydajność metody jest nieco mniejsza. Metoda PCR znajduje bardzo duże zastosowanie w badaniach diagnostycznych. Można je podzielić na badania bezpośrednio dotyczące człowieka oraz badania pośrednio związane z człowiekiem, np. analiza jakości żywności, choroby zwierząt czy biotechnologia. W pierwszej grupie można wyróżnić trzy najważniejsze grupy zastosowań: wykrywanie patogenów infekcyjnych (bakterii, wirusów, pasożytów); wykrywanie zmian w genomowym DNA w chorobach genetycznych i predyspozycji do chorób nowotworowych, monitorowanie i wykrywanie nowotworów oraz wykrywanie polimorficznych sekwencji DNA na potrzeby identyfikacji indywidualnej (np. badanie ojcostwa). Metodę PCR stosuje się obecnie do szybkiego wykrywania patogenów, zwłaszcza takich, których hodowla in vitro jest trudna lub długotrwała [2]. Najważniejszym zastosowaniem metody PCR w diagnostyce jest jej wykorzystanie do uzyskania zwiększonej ilości DNA przed jego dalszą analizą. Powielony tą metodą materiał genetyczny może być O PORTAL - jednostek tworzących kolonie (jtk). Taką liczbę drobnoustrojów otrzymuje się przez namnożenie w odpowiednich pożywkach. W optymalnych przypadkach czas generacji wynosi ok. 20 min, lecz w niesprzyjających warunkach może być znacznie dłuższy. Czułość metody może być również znacznie ograniczona przez towarzyszącą mikroflorę, która często ogranicza wzrost oznaczanego mikroorganizmu. Obie trudności można pokonać przez szybkie i selektywne powielenie DNA charakterystycznego dla oznaczanego drobnoustroju techniką reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR – Polymerase Chain Reaction) [1]. PCR jest to technika umożliwiająca amplifikację, czyli powielenie fragmentów DNA in vitro przy użyciu termostabilnej polimerazy DNA. Metoda ta została opracowana przez grupę naukowców z firmy Cetus Corporation z USA. Główny autor metody, Kary Mullis, otrzymał za to w 1993 r. nagrodę Nobla w dziedzinie chemii. PCR zrewolucjonizowało współczesną biologię molekularną, umożliwiając wyprodukowanie milionów kopii fragmentu DNA w zaledwie kilka godzin. Cykl reakcji PCR składa się z trzech etapów: O ogrzewania do temp. ok. 90-95°C (denaturacji) powielanego DNA w celu rozdzielenia dwóch nici kwasu dezoksyrybonukleinowego – wiązania wodorowe pękają i podwójna helisa DNA (dsDNA) rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy (nici), tzw. ssDNA, O schłodzenia próbki do temp. ok. 45-50°C, w wyniku czego następuje przyłączenie starterów (primerów) do matrycy – następuje hybrydyzacja komplementarnych oligonukleotydów z rozplecionymi nićmi DNA (renaturacja), ANALITYKA dalej analizowany innymi technikami (np. sondy molekularne, polimorfizm miejsc restrykcyjnych) [1]. Stosowane są również modyfikacje metody PCR. Jedną z najnowszych jest reakcja PCR w czasie rzeczywistym (Real-Time PCR). Metoda ta umożliwia jednoczesne powielanie i wykrywanie charakterystycznych sekwencji, co jest możliwe dzięki zastosowaniu odpowiednich barwników lub sond fluorescencyjnych. Dodatkowo ścisła zależność intensywności fluorescencji wzrastającej w miarę zachodzenia reakcji PCR jest silnie skorelowana z ilością produktu powstającego w tej reakcji. Umożliwia to przeprowadzenie pomiarów ilościowych i określenie przybliżonej ilości drobnoustrojów, wirusów czy zawartości GMO w produktach żywnościowych. Specyficzność reakcji Real-Time PCR zależy zarówno od chemicznej reakcji powielania, jak i od urządzenia stosowanego do monitorowania sygnału fluorescencji. W metodzie tej do uzyskania sygnału fluorescencji wykorzystywano początkowo różne barwniki interkalujące, np. bromek etydyny czy SYBR Greek wnikające do dwuniciowego DNA, powstającego w wyniku reakcji PCR. Metoda detekcji za pomocą wspomnianych barwników nie pozwalała jednak na rozróżnienie swoistych (poszukiwanych) i nieswoistych (przypadkowych – polimeraza powiela także inne niż poszukiwane fragmenty DNA) produktów PCR. Kolejnym krokiem było opracowanie metody TaqMan. W metodzie tej polimeraza Taq hydrolizuje podwójnie znakowaną sondę, uwalniając fluorescencję. Rok później wprowadzono metodę LightCycler, w której zastosowano dwie sondy: z barwnikiem donorowym i z barwnikiem receptorowym. Donor pochłania promieniowanie zewnętrznego źródła światła i emituje światło o długości fali wzbudzającej receptor do fluorescencji. W wyniku hybrydyzacji obydwu sond z produktem PCR dochodzi do ich zbliżenia, przeniesienia energii z donora na receptor i fluorescencji. Ze względu na dużą wiarygodność uzyskiwanych wyników, daleko posuniętą automatyzację i niewielką pracochłonność technika Real-Time PCR zdobyła wielu zwolenników. W latach 1997-2003 wykonywano bardzo dużo prac z wykorzystaniem tej techniki. Opracowano wiele nowych, bardziej złożonych metod detekcji, takich jak molecular beacon i skorpion. Sonda molekularna Molecular Beacons ma na końcu 5' ** i 3' komplementarne sekwencje utrzymujące ją w strukturze typu spinki do włosów (rys.). W formie niezhybrydyzowanej, tj. gdy struktura spinki jest zamknięta, barwniki reporterowy (fluorofor) i tłumiący (wygaszacz), umieszczone na końcach 5' i 3' znajdują się blisko siebie – fluorescencja jest tłumiona. W obecności komplementarnej matrycy sonda rozwija się i hybrydyzuje, barwniki zostają oddzielone od siebie i sonda zaczyna fluoryzować [2]. PORTAL - www.sigma-not.pl Polimorfizm miejsc restrykcyjnych (RFLP) Analizę polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP – Restriction Length Fragment Polymorphisms) powszechnie stosują m.in. genetycy w diagnostyce chorób genetycznych, np. fenyloketonurii, mukowiscydozy, hemofilii. W mikrobiologii może być ona natomiast wykorzystana do różnicowania bardzo blisko genetycznie spokrewnionych szczepów drobnoustrojów w ramach tego samego gatunku. Fluorofor Wygaszacz Fluorescencja Rys. Zasada działania sondy typu Molecular Beacons [3] Metoda ta polega na wyizolowaniu z testowanego organizmu DNA, trawieniu odpowiednio dobranymi enzymami restrykcyjnymi, tnącymi łańcuch DNA w ściśle określonych miejscach i rozdzieleniu ze względu na wielkość powstających fragmentów DNA metodą elektroforezy żelowej. Następnie rozdzielone fragmenty są przenoszone na membranę i dodawana jest chemiluminescencyjnie znakowana specyficzna sonda genetyczna. Z różnorodności sekwencji wynika obecność lub brak miejsc restrykcyjnych, a konsekwencją tego jest hybrydyzacja sondy z fragmentami o różnej wielkości. Dobrze zaprojektowane sondy pozwalają otrzymać rozkład prążków, czyli cząsteczek DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej w technice RFLP, unikalny dla danego szczepu mikroorganizmu. Opisana metoda jest zautomatyzowana. Odpowiednie urządzenie wymaga tylko wprowadzenia do niego pojedynczej kolonii analizowanego drobnoustroju. Specjalnie skonfigurowane bazy danych pozwalają precyzyjnie zidentyfikować mikroorganizm [1]. +++ Metody oparte na homologii i hybrydyzacji DNA zmieniły współczesną naukę i stworzyły ogromne możliwości zastosowania ich przede wszystkim w medycynie, nowoczesnej diagnostyce ludzi i zwierząt, ale także w badaniach żywności. Metody te mają wiele zalet (czułość, szybkość, dokładność) i mimo że wymagają odpowiedniego sprzętu oraz wykwalifikowanego personelu, należą do najnowocześniejszych rozwiązań i są stopniowo coraz powszechniej stosowane m.in. w badaniu mikrobiologicznym żywności. LITERATURA [1] Praca zbiorowa pod red. Jankiewicza M., Kędziora Z.: 2003. Metody pomiarów i kontroli jakości w przemyśle spożywczym i biotechnologii. Wydawnictwo AR, Poznań, 327, 353-354, 366-368. [2] Praca zbiorowa pod. red. Słomskiego R.: 2004. Przykłady analiz DNA. Wydawnictwo AR, Poznań, 13, 79-82, 145-148. [3] http://www.biotechnolog.pl/slownik-139.htm ** Skrajny nukleotyd na jednym z końców DNA, z wolną grupą fosforanową przy piątym atomie węgla deoksyrybozy. 8 Przemys³ Spo¿ywczy 2/2007
