Streszczenie doktoratu

STRESZCZENIE ROZPRAWY DOKTORSKIEJ
„Poziom adduktów BPDE-1-DNA oraz zmian cytogenetycznych w komórkach nabłonkowych
z jamy ustnej u dzieci narażonych środowiskowo na czynniki genotoksyczne”
mgr Ewa Błaszczyk
promotor: dr hab. n. med. Danuta Mielżyńska-Švach
Województwo śląskie jest wysoko uprzemysłowionym regionem Polski o największej
gęstości zaludnienia. Jakość powietrza atmosferycznego na tym obszarze w stosunku do
poprzednich kilkudziesięciu lat uległa znacznej poprawie. Jednak, dane monitoringowe
Wojewódzkiego Inspektoratu Ochrony Środowiska w Katowicach z ostatnich lat wskazują, że
poziom emisji zanieczyszczeń gazowych i pyłowych w dalszym ciągu należał na tym terenie do
najwyższych w kraju, a stężenia pyłu PM10, PM2,5 oraz benzo[a]pirenu przekraczały
obowiązujące poziomy dopuszczalne, zwłaszcza w sezonie zimowym.
Celem naukowym niniejszej pracy była ocena narażenia dzieci przedszkolnych na
wybrane zanieczyszczenia powietrza atmosferycznego i wewnętrznego zamieszkujących dwa
obszary woj. śląskiego: obszar miejsko-przemysłowy (miasto Dąbrowa Górnicza) i rolniczy
(gmina Janów) w oparciu o analizy wybranych zanieczyszczeń powietrza oraz markery
biologiczne w moczu, a także w komórkach nabłonkowych z jamy ustnej u dzieci.
Badania będące podstawą pracy doktorskiej zostały wykonane w ramach projektu
badawczego (nr N N404 110734) realizowanego w Instytucie Ekologii Terenów
Uprzemysłowionych w Katowicach. Próbki powietrza atmosferycznego zostały pobrane
w marcu i kwietniu 2010 roku na Stacjach Jakości Powietrza Wojewódzkiego Inspektoratu
Ochrony Środowiska (WIOŚ) w Dąbrowie Górniczej oraz w Złotym Potoku. Natomiast,
pomiary jakości powietrza wewnętrznego zostały wykonane w przedszkolach, do których
uczęszczały dzieci biorące udział w badaniach. W trakcie badań jakości powietrza pobrano
próbki moczu oraz komórek nabłonkowych z jamy ustnej od 106 dzieci w wieku
przedszkolnym, w tym 55 dzieci z miasta Dąbrowa Górnicza oraz 51 dzieci z gminy Janów
uczęszczających do przedszkoli w Złotym Potoku oraz Janowie.
Badania jakości powietrza atmosferycznego i wewnętrznego obejmowały takie
parametry jak: stężenia zanieczyszczeń gazowych – SO2 i NO2, frakcji pyłu PM2,5,
15 WWA, w tym benzo[a]pirenu (B[a]P). W pracy wyznaczono równoważniki działania
mutagennego 8 WWA i rakotwórczego 15 badanych WWA oraz obliczono procentowy udział
poszczególnych związków w całkowitym potencjale mutagennym i rakotwórczym. W oparciu
o rzeczywiste dane pomiarowe stężeń pyłu PM10 wyznaczono kierunek i ładunek napływu
mas powietrza na dwa badane obszary w okresie styczeń-kwiecień 2010. Efekt mutagenny
ekstraktów pyłu PM2,5 dla powietrza atmosferycznego i wewnętrznego zbadano przy pomocy
krótkoterminowego testu Salmonella z zastosowaniem dwóch szczepów testowych (TA98,
YG1024) w wariancie bez (-S9) oraz po aktywacji metabolicznej (+S9).
Wybór zestawu markerów biologicznych został ukierunkowany na określenie wpływu
substancji genotoksycznych, a w szczególności związków z grupy WWA obecnych
w powietrzu atmosferycznym i wewnętrznym na dwóch badanych obszarach (Dąbrowa
Górnicza i gmina Janów). W tym celu w moczu dzieci oznaczono poziom substancji
mutagennych testem Salmonella (szczep YG1024), stężenie 1-hydroksypirenu oraz kotyniny
zaliczanych jako markery narażenia. Natomiast, zastosowanie komórek nabłonkowych z jamy
ustnej do badań monitoringowych dzieci podyktowane było możliwością ich nieinwazyjnego
poboru. W materiale tym przeanalizowano poziom specyficznych adduktów 7,8-diol-9,10epoksy benzo[a]pirenu w DNA (BPDE-1-DNA) oraz niespecyficznych uszkodzeń
cytogenetycznych tj. uszkodzenia DNA (komórki z mikrojądrami i mostkami jądrowymi),
uszkodzenia cytokinezy (komórki dwujądrowe) oraz procesy apoptozy (komórki kariolityczne
i piknotyczne), jako biomarkerów wczesnych skutków biologicznych. W celu zbadania
wzajemnych korelacji pomiędzy badanymi biomarkerami zastosowano zaawansowane
metody statystyczne oraz analizę przestrzennego rozmieszczenia uzyskanych danych
biomonitoringowych za pomocą narzędzi Systemu Informacji Geograficznej (GIS).
W okresie marzec-kwiecień 2010 roku średnie stężenia SO2 i NO2 w powietrzu
atmosferycznym na obu badanych obszarach województwa śląskiego nie wykazywały
przekroczeń obowiązujących norm, natomiast stężenia pyłu PM2,5 oraz B[a]P były powyżej
wartości dopuszczalnych (wg Rozporządzenia Ministra Środowiska z dnia 24 sierpnia 2012
roku, Dz. U., Nr 0, poz. 1031, 2012r.). Istotne różnice między powietrzem atmosferycznym
na stacjach WIOŚ w Dąbrowie Górniczej i Złotym Potoku zaobserwowano tylko dla stężeń
NO2, natomiast nie zanotowano ich dla SO2, pyłu PM2,5, 15 badanych WWA oraz ich sumy.
Pomiędzy Dąbrową Górniczą, a gminą Janów nie stwierdzono także różnic pod względem
wartości współczynników działania mutagennego, jak i rakotwórczego wybranych WWA
występujących we frakcji pyłu PM2,5 pobranej z powietrza atmosferycznego.
Brak istotnych różnic w jakości powietrza atmosferycznego między badanymi
obszarami potwierdziły prawie identyczne sumaryczne ładunki pyłu PM10, jakie napłynęły na
stację WIOŚ w Dąbrowie Górniczej oraz w Złotym Potoku w okresie styczeń-kwiecień
2010 roku. Chociaż kierunki, z jakich te ładunki napłynęły były odmienne, to w obu
przypadkach strumienie tego zanieczyszczenia pochodziły z sąsiadujących terenów
przemysłowych. W przypadku Dąbrowy Górniczej zanieczyszczenie to napłynęło
z uprzemysłowionego miasta Zawiercie (kierunek północno-wschodni), a na stację w Złotym
Potoku z Górnośląskiego Okręgu Przemysłowego (kierunek południowo-zachodni).
Pył PM2,5 pobrany na dwóch stacjach pomiarowych WIOŚ zawierał substancje
mutagenne działające na oba szczepy testowe (TA98 i YG1024). Zarówno w Dąbrowie
Górniczej, jak i gminie Janów więcej było substancji wykrywanych szczepem YG1024
i głównie były to związki działające pośrednio na DNA. Efekt mutagenny ekstraktów pyłu
PM2,5 zawartego w powietrzu atmosferycznym był porównywalny na obu obszarach, bez
względu na zastosowany szczep i wariant aktywacji.
Nie zaobserwowano także różnic w stężeniach zanieczyszczeń gazowych, pyłu PM2,5,
15 badanych WWA, w tym B[a]P oraz ich sumy, występujących w powietrzu wewnętrznym
przedszkoli usytuowanych na terenie Dąbrowy Górniczej oraz gminy Janów. Stwierdzono
również brak różnic pod względem współczynników działania mutagennego i rakotwórczego
wybranych WWA, oznaczonych we frakcji pyłu PM2,5 pobranej z powietrza wewnętrznego
w przedszkolach w Dąbrowie Górniczej i w gminie Janów. Poziom substancji mutagennych
w próbkach pyłu PM2,5 pobranych z powietrza wewnętrznego, działających bezpośrednio
i pośrednio na oba zastosowane szczepy, był porównywalny na dwóch badanych obszarach.
We frakcji PM2,5 pobranej w pomieszczeniach przedszkoli w Dąbrowie Górniczej oraz
gminie Janów więcej było substancji mutagennych działających na szczep YG1024 po
aktywacji metabolicznej.
Analizując różnice między powietrzem atmosferycznym, a wewnętrznym stwierdzono
występowanie wyższych stężeń SO2 i NO2 na obu obszarach w powietrzu zewnętrznym
w porównaniu z powietrzem pomieszczeń przedszkolnych, przy czym w Dąbrowie Górniczej
były to różnice statystycznie istotne. Minimalne różnice w stężeniach pyłu PM2,5, 15 WWA,
w tym B[a]P oraz ich sumy, a także współczynnikach działania mutagennego i rakotwórczego
wykazano między powietrzem atmosferycznym i wewnętrznym, zarówno w Dąbrowie
Górniczej, jak i gminie Janów. Natomiast, efekt mutagenny próbek pyłu PM2,5 pobranych
w pomieszczeniach przedszkolnych, badany zarówno szczepem TA98, jak i YG1024 był
dwukrotnie niższy niż w próbkach powietrza atmosferycznego na obu badanych obszarach.
W badaniach z zakresu monitoringu biologicznego nie stwierdzono istotnych różnic
między efektem mutagennym moczu wykrywanym szczepem YG1024, zarówno bez jak i po
aktywacji metabolicznej u dzieci z Dąbrowy Górniczej oraz gminy Janów, ale na obydwu
obszarach istotnie więcej w moczu dzieci było substancji mutagennych działających w sposób
pośredni. Statystycznie wyższe stężenie 1-OHP w moczu wykryto u dzieci z gminy Janów
w porównaniu do dzieci z Dąbrowy Górniczej, a wartości średnie były wyższe niż
wyznaczona wartość referencyjna dla dzieci i ludzi niepalących. Stężenia kotyniny w moczu
badanych dzieci z terenu miejskiego i wiejskiego były na podobnym poziomie.
W komórkach nabłonkowych z jamy ustnej u dzieci z gminy Janów stwierdzono
istotnie wyższy poziom adduktów BPDE-1-DNA w porównaniu do poziomu tego biomarkera
w grupie z Dąbrowy Górniczej. Analiza z wykorzystaniem narzędzi GIS wykazała
podwyższony poziom adduktów BPDE-1-DNA u dzieci z miejscowości Złoty Potok (gmina
Janów) w porównaniu z pozostałymi dziećmi mieszkającymi na tym terenie.
Częstość występowania komórek nabłonkowych z uszkodzeniami DNA była wyższa,
chociaż statystycznie nieistotna, w grupie dzieci zamieszkujących Dąbrowę Górniczą.
Zarówno u dzieci z Dąbrowy Górniczej, jak gminy Janów częstość występowania komórek
z mikrojądrami w materiale z jamy ustnej była poniżej lub mieściła się w zakresie od 0,30 do
1,70 na 1000 komórek zróżnicowanych, będącym poziomem referencyjnym dla populacji
nienarażonej na czynniki genotoksyczne. Również u dzieci z terenu miejskiego wykryto
istotnie wyższą częstość komórek świadczących o uszkodzeniach cytokinezy oraz
o zachodzeniu procesów apoptozy w porównaniu do dzieci z gminy Janów.
Analiza głównych składowych (PCA) dla wszystkich badanych dzieci wykazała
występowanie związku pomiędzy biomarkerami narażenia wykrywanymi w moczu, przy
czym był on najsilniejszy pomiędzy bezpośrednim i pośrednim efektem mutagennym moczu
(YG1024±S9). W komórkach nabłonkowych z jamy ustnej badanych dzieci również
stwierdzono ścisłe zależności między zmianami cytogenetycznymi, tj. uszkodzeniami DNA,
cytokinezą i apoptozą. Natomiast, poziom adduktów BPDE-1-DNA oraz zmian
cytogenetycznych w materiale z jamy ustnej nie był zależny od efektu mutagennego moczu,
a także od wydalanego z moczem 1-hydroksypirenu oraz kotyniny. W niniejszych badaniach
częstość zmian w komórkach nabłonkowych z jamy ustnej nie była bezpośrednio związana
z poziomem i rodzajem substancji wydalanych z moczem, co prawdopodobnie wynika
z odmiennych procesów biotransformacji, a także dróg lub dawek narażenia.
Wyniki uzyskane w niniejszych badaniach wskazują, że jakość powietrza
atmosferycznego, jak i wewnątrz przedszkoli nie miała bezpośredniego wpływu na wykazaną
zmienność biomarkerów oznaczonych w komórkach nabłonkowych z jamy ustnej i moczu
u dzieci z Dąbrowy Górniczej oraz gminy Janów. Statystycznie wyższy poziom 1-OHP
w moczu oraz adduktów BPDE-1-DNA w komórkach nabłonkowych u dzieci z gminy Janów
prawdopodobnie był wynikiem lokalnego narażenia na związki WWA z innych źródeł niż
badane, jakimi mogła być chociażby żywność lub sposób jej przygotowania (grillowanie,
smażenie, wędzenie), a także jakość powietrza w domach dzieci. Natomiast, istotnie wyższa
częstość występowania uszkodzeń cytogenetycznych, takich jak cytokineza i apoptoza
w komórkach nabłonkowych u dzieci z Dąbrowy Górniczej przypuszczalnie była
spowodowana narażeniem na inne substancje genotoksyczne niż WWA lub zmiennością
osobniczą. Zatem, poziom adduktów oraz zmiany cytogenetyczne wykrywane w komórkach
nabłonkowych z jamy ustnej są przydatnymi biomarkerami wczesnych skutków
biologicznych, gdyż materiał do badań pobierany jest w nieinwazyjny sposób, a otrzymane
wyniki mogą zostać porównane z wyznaczonym zakresem referencyjnym. Należy jednak
podkreślić, że podwyższony poziom tych uszkodzeń wykrywany jest zwykle przy dużym
narażeniu na czynniki szkodliwe.