Biologia komórki roślinnej
advertisement
Biologia komórki roślinnej WYKŁAD I pierwsze były komórki prokaryotyczne 1 mld 400 mln lat temu powstały komórki eukaryotyczne mykoplazmy – najprostsze Metabolizm organella cytoplazma PROCARYOTA 1-10 m Anaeroby, aeroby Niewiele: nukleoid, tylakoidy, mezosomy, rybosomy 70s Brak cytoszkieletu, brak ruchu, brak endo i egzocytozy DNA Koliste w cytoplazmie tylko egzony RNA i białka Podział komórki Transkrypcja i translacja w cytoplazmie Podział prosty komórki i nukleoidu Organizacja komórkowa jednokomórkowce EUCARYOTA 10-1000m Aeroby Jądro, mitochondria, plastydy, ER, AG, rybosomy 80s Cytoszkielet: mikrotubule, różne ruchy cytoplazmy, endo i egzocytoza Bardzo długie, liniowe, introny i egzony, histony, otoczka jądrowa Transkrypcja w jądrze, translacja w cytoplazmie Chromosomy, podziały: mitoza i mejoza, wrzeciono podziałowe: kariokinetyczne i cytokinetyczne Głównie wielokomórkowce, różne typy tkanek, 60 bilionów komórek PROCARYOTA mała mykoplazma – 1,6 par zasad DNA x 10 do 6 pałeczka okrężnicy E.coli – 4 par zasad DNA x 10 do 6 duża cyjanobakteria – 16 par zasad DNA x 10 do 6 EUCARYOTA mitochondrium drożdży piekarniczych– 2-3 par zasad DNA x 10 do 6 drożdże piekarnicze – 12-20 par zasad DNA x 10 do 6 pierwotniaki – 55-320 000 par zasad DNA x 10 do 6 komórki ssaków – 2 800 – 5 300 par zasad DNA x 10 do 6 FUNKCJE BIOLOGICZNE CZĄSTECZEK DNA mRNA – przekazywanie informacji, określa kolejność łączenia aminokwasów w biosyntezie białka rRNa : 1. udział w strukturze rybosomu 2. aktywność transferazy peptydylowej 3. translokacja peptydylo – tRNA tRNA – cząsteczki adaptorowe przenoszące aminokwasy w biosyntezie białek i innych szlakach metabolicznych U1, U2, U4/ U6, U5 snRNA – wycinanie intronów U3snRNA – dojrzewanie rRNA U7 snRNA – obróbka końca 3’mRNA histonowego U11 snRNA – obróbka i poliadenylacja 3’ końca pre-mRNA M1 RNA – komponent katalitycznej RN-azy P biorącej udział w obróbce tRNA RNA telomerazy – matryca do syntezy telomerów 1 7s RNA – składnik kompleksu rozpoznający sygnał w procesie translokacji białek prze błony primery RNA – cząsteczka RNA inicjująca replikacje DNA? Mic F – prokariotyczny RNA zdolny do regulacji wydajności translacji TFIIIR – czynnik regulujący transkrypcje Pol III u owadów KALMODULINA: 4 miejsca wiązania wapnia kinaza lekkiego łańcucha miozyny fosfodiesteraza cyklicznych nukleotydów pompa wapniowa ( Ca2+-Mg2+-ATP-aza) rozp..... mikrotubul fosforylacja błon uwalnianie neuromediatorów kinaza DNA kinaza fosforylazy Ca2+ zależna kinaza białkowa Cyklaza guanylanowa Inne UBIKWITYNA 1. procesy w cytosolu: ubikwitynozależna proteoliza glikoliza glikogenoliza glukoneogeneza cykl pentozofosforanowy synteza kwasów tłuszczowych synteza nukleotydów kataboilizm pirymidyn biosynteza porfiryn cykl mocznikowy synteza aminokwasów Ca 10 do –7 mola w komórce ( niewielkie stężenie w komórce) 2. filamenty pośrednie 3. mikrotubule 4. filamenty aktynowe - przyłączanie dimerów tubuliny wymaga dostarczenia energii ułożenie mikrotubul w czasie mitozy, cyklu komórkowego ruch cytoplazmy transport cząsteczek z komórki i do komórki przez plasmodesmy dyneina, kinezyna WYKŁAD II BŁONY KOMÓRKOWE białka integralne, peryferyczne w błonie glikoproteiny, glikoproteidy, fosforowe połączenia ( asymetryczność błony ) błony są zorganizowanymi warstwowymi układami makromolekularnymi nadają komórkom indywidualność przez oddzielenie od środowiska i pełnią funkcje niezbędne do życia są wysoce selektywnymi barierami przepuszczalności, zawierają kanały, przenośniki i pompy w komórkach eukariotycznych tworzy odrębne przedziały – kompartmenty wspólne cechy 1. grubość błon 6-10 nm 2. zbudowane głównie z białek i lipidów w stosunku 1:4 do 4:1 oraz cukrowców 3. lipidy mają reszty hydrofobowe i hydrofilowe 4. mają specyficzne białka 2 5. 6. 7. są asymetryczne są strukturami płynnymi spolaryzowane elektrycznie Rodzaje transportu uniport symport antyport Uorganizowanie błon: plazmalemma u roślin (błona ) RE gładkie i szorstkie – tu błony pełnią różne funkcje Szorstkie : 1. przemiana białek odcięcie odcinka sygnałowego N – glikozylacja peptydów Modyfikacja łańcuchów oligosacharydowych peptydów Gładkie 2. przemiana lipidów synteza triglicerydów fosfolipidów sfingolipidów cholesterolu modyfikacje kwasów tłuszczowych np. synteza kwasów tłuszczowych 3. utlenianie – redukcja hydroksylacje węglowodorów utlenianie nienasyconych kwasów tłuszczowych np. oksydazy mikrosomowe 4. transport do wnętrza siateczki Ca2+ np. ATP-aza Glukozy 5. odtruwanie utlenianie przyłączenie glikuronianu przyłączanie siarczanu przyłączanie grup metylowych acetylacja np. acetylazy, transferaza metylowa, siarczanowa, oksydazy mikrosomowe APARAT GOLGIEGO z cystern odrywają się z RE z diktiosomu, cześć trans i cis pęcherzyki odrywają się od cystern diktiosomu ap.Golgiego zajmuje się przemianą białek i cukrowców procesy wydzielnicze transport w stronę RE oraz w stronę „do przodu” otoczka pęcherzyka : z klatryną, koronko podobne okrycie, COP1 pęcherzyki okryte klatryna ( białko na powierzchni, białka receptorowe w błonie- „adresowane „ gdzie jest kierowany w miejsce docelowe) Przedział Bliższy cis Typowe barwienie lub metoda histochemiczna Wyczernianie OsO4 Reakcja na G6Pazę (glukozo-6- fosfatazę) Inne enzymy obecne w przedziale Oksydazy NADH : NADPH zależne Mannozydaza 1 Fosfotransferaza Nacetyloglukozamin ylowa Powinowactwo Najważniejsze procesy zachodzące w do lektyn danym przedziale Konkawalina A ( ConA) - usuwanie zewnętrznych reszt mannozowych z oligosacharydów przyłączanie kwasów tłuszczowych do seryny przyłączanie acetyloglukozaminofosfor. Do enzymów lizosomalnych 3 - Środkowy - Reakcja na NADPazę przyłączanie Nacetlogalaktozaminy w procesie Oglikozylacji Transferaza Nacetylo Niektóre enzymy w lizosomach : lipaza – nukleazy fosfolipaza – fosfatazy sfingomielinaza – sulfatazy enzymy działają na białka ( katepsyny ) enzymy działają na łańcuchy cukrowe ( galaktozydazy ) enzymy działają na glikozaminoglikany ( glukoronidaza, lizozym) SKŁAD SOKU KOMÓRKOWEGO jony K+, Na+, Ca+, Mg2+, Cl-, SO4 2-, PO4 2-, PO4 3-, NO3aminokwasy kwasy organiczne : jabłkowy, cytrynowy, szczawiowy, winowy cukry : sacharoza, glukoza, fruktoza białka zapasowe i obronne : prolaminy, leguminy, fitohemeglutyniny, inhibitory proteaz, chitynaza, peptydy wiążące metale ENZYM Chitynaza ..... pirofosfataza LIZOSOM(zw) ---- WAKUOLA(rośl) + + + żywice fenolowe antocyjaniny bergenina glikozydy kumaroilowe glikozydy flawonolowe terpenoidy: saponiny Oligosacharydy gentianoza gentiobioza stachyoza Zw. azotowe ( bez alkaloidów ) glukozynolany Alkaloidy atropina nikotyna Metabolity wtórne berberyna betaina morfina dopamina kodeina 4 - papaweryna poliaminy winolina tebaina białka obronne chitynaza fitohemaglutynina Mechanizmy pobieranie związków obronnych, sygnałowych i ksenobiotyków: fuzja błony tonoplastu z błoną pęcherzyka retikularnego dyfuzja prosta (metabolity wtórne) aktywny / pasywny transport ( jony, aminokwasy, kwasy organiczne, cukry) Mechanizmy gromadzenia wbrew gradientowi stężeń transport aktywny ( pompa ATP-azowa, H+-ATP-aza) transport aktywny II rzędu ( gradienty protonowe generowane przez H+- ATPazę, H+-Ppazę-), siła protonomotoryczna [ antyport protonowy] Mechanizmy wychwytywania przyłączenie wtórnych metabolitów do polifosforanów przyłączenie wtórnych metabolitów do białek krystalizacja ( szczawian wapnia ) tworzenie kompleksów alkaloidów z kwasem mekonowym czy chelidonowym ONTOGENEZA I RÓŻNICOWANIE SIĘ WAKUOLI Wakuole lityczne powstają z sieci trans diktiosomy AG 1. prowakuolarne rurki z częściowo okrytego retikulum otaczają część cytoplazmy, która ulega wytrawieniu dają początek wakuoli 2. z rurek gładkiego ER Wakuola a wzrost objętości komórki Auksyna – aktywowana (H+ATPazy) – wypływ H+ ( 3 możliwości): 1. hiperpolaryzacja – pobranie K+ - obniżenie potencjału wodnego w komórce 2. alkalizacja cytoplazmy 3. zakwaszenie ściany komórkowej – rozluźnienie ściany – spadek turgoru – obniżenie potencjału wodnego w komórce Gromadzenie ksenobiotyków w wakuoli wtórnych metabolitów innych roślin lub patogenów związki chemiczne stosowane w rolnictwie lub pochodzące z produkcji przemysłowej Rośliny metabolizują ksenobiotyki w postaci glikozydów, następnie acylowanie lub przyłączanie glutationu i cycsteiny ogólnie zwiększona rozpuszczalność w wodzie. Mogą też być wydzielane na zewnątrz błony i gromadzone w apoplascie. Prawdopodobieństwo udziału wakuoli w procesach biosyntetycznych biosynteza etylenu cukrowców ( fruktany, stachyoza) przekształcanie metabolitów wtórnych wakuole mogą być organami spichrzowym ( ziarna aleuronowe ) –odwodniona wakuola spichrzowa WYKŁAD III 5 MITOCHONDRIA mogą występować w komórce bardzo często w dużej liczbie lub jest ich niewiele ( kom eukariotyczne ) – ich liczba jest zmienna struktura może być różna, błona wewnętrzna może mieć bardzo regularny układ, lub błona wewnętrzna może mieć strukturę skondensowaną rybosomy 70s błona zewnętrzna o prostej budowie błona wewnętrzna – złożona budowa procesy : oddychanie komórkowe, biosynteza białek żeby było oddychanie to wcześniej w cytoplazmie glikoliza liczba powstających cząsteczek ATP jest mała ( z jednej glukozy – 2 cząsteczki ATP) produktem końcowym gklikolizy jest pirogronian – on trafia do mitochondrium ( ważna jest tutaj błona zewnętrzna i wewnętrzna oraz matriks) błona zewnętrzna – bardziej przepuszczalna związana z transportem bardzo wielu cząsteczek błona wewnętrzna – bardziej wybiórcza, na niej przenośniki elektronów, cytochromów, oksydaza cytochromu, syntaza ATP ( z nią związany jest przepływ elektronów ) matriks – tu enzymy cyklu Krebsa, cząsteczka DNA, rybosomy 70s, jest tu proces replikacji DNA, transkrypcji i translacji. Tu również białka związane z skokiem termicznym i enzymy związane z utlenianiem kwasów tłuszczowych. Przestrzeń ...(perymitoch) - tu kinazy Łańcuch oddechowy – kończy oddychanie Genom mitochondrialny drożdży ma więcej intronów niż człowieka Proces biosyntezy białek w mitochondriach Struktura genomu jest kolista W matriks może odbywać się replikacja i transkrypcja Część powstałego mRNA wchodzi w skład podjednostki rybosomalnej, a białka pochodzą z cytoplazmy Część białek ( np. rybosomów, polimeraza RNA) pochodzą z cytpolazmy Mitochondria mają częściową autonomie Na rybosomach proces translacji, ale żeby zaszła aminokwasy i syntazy z cytoplazmy , tRNA wytwarza na podstawie genomu mtDNA powstałe białka będą stanowiły składnik łańcucha oddechowego – będą wbudowane w wewnętrzną błonę mitochondrium (ale jest to białko złożone, musi się połączyć z innym białkiem pochodzącym z cytoplazmytzn to białko powstałe z mtDNA) proces związany i importem białek struktura mitochondrium jest złożona ale jeszcze bardziej jest złożona struktura chloroplastów CHLOROPLASTY błona wewnętrzna, zewnętrzna i stroma tylakoidy stromy i tylakoidy gran zwykle w ich pobliżu położone są peroksysomy i mitochondria peroksysomy nie mają własnych rybosomów i DNA, otoczone pojedynczą błoną pomiędzy tymi organellami ( + jądro) może nastąpić wymiana materiału genetycznego INNE PLASTYDY proplastydy leukoplasty amyloplasty lipidoplasty ( z kropelkami tłuszczu ) etioplasy = ciało prolamylarne proplastydy rozwijają się na świetle to tworzą się z nich chloroplasty a jeżeli bez światła to etioplasty chloroplasy mogą się zmieniać w etioplasty i odwrotnie chromoplasty – prosta budowa wewnętrzna, karoteny i ksantofile często w formie kryształów Budowa cząsteczki chlorofilu : pierścień porfiryczny atom Mg grupy funkcyjne ( różnią cząsteczki chlorofilu :A, B, C, D, E, F, G ) 6 - proces fotosyntezy jest związany z błoną tylakoidów gran w których są anteny fotosystemu I i II odpowiedzialne za pobieranie kwantów energii świetlnej – tworzą się związki wysokoenergetyczne transport elektronów i protonów w błonie tylakoidu kolejny etap fotosyntezy Co2 przyłącza się do wzbudzonego rybulozo-1,5-trifosforanu pod wpływem karboksylazy Tworzą się fosfogliceryniany Przekształcenie – wytwarzają się aldehydy Wytworzenie NADPH Regeneracja lub tworzy się fruktoza i glukoza ( szkielety węglowe to tworzenia innych związków organicznych) lub tworzenie związków zapasowych biosynteza białek w chloroplastach DNA Plastorybosomy ( 70s) Transkrypcja i translacja –powstanie białek które są częścią karboksylazy ( enzym do przyłączania CO2 do rybulozo-1,5 –trifosforanu też są częściowo autonomiczne W mitochondriach i plastydach jest proces biosyntezy ale tylko pewnych białek. Inne muszą być transportowane z cytoplazmy ŚCIANA KOMÓRKOWA zewnętrzny wytwór protoplastu podlega bardzo dużym zmianom skład : polisacharydy, lipidy, substancje aromatyczne, białka lignina może być traktowana jako cześć sygnałowa, a nie tylko substancja utwierdzająca ścianę związki fenolowe – też cząsteczki sygnałowe uczestniczy w funkcjonalnej specjalizacji komórki w przypadku naczyń, podczas rozwoju komórki protoplast obumiera, a dojrzałą komórkę stanowi ściana komórkowa jest dynamicznym komponentem matriks zew-kom, która zmienia się w czasie życia komórki skład chemiczny : węglowodany : 11 cukrów i wiele połączeń 5x10 do 9 celuloza – główny składnik . 15-30%, związki aromatyczne funkcje wynikają nie tylko ze specjalizacji strukturalnej ściany ale także obecności cząsteczek sygnałowych, które pełnią ważne funkcje w komunikacji kom / kom i jądro / kom. Polisacharydy : celuloza, hemicelulozy, pektyny Związki fenolowe : ligniny, kwasy fenolowe Białka : obronne, hydrolazy, transportujące, strukturalne Lignina – inkrustuje ścianę komórkową, w ścianach młodych koleoptyli wpływa na zmianę morfogenezy tych komórek Typy ścian komórkowych : 1. u roślin okrytonasiennych 2. u jednoliściennych 1. 2. - przewaga ksyloglukanów związki z duża ilością reszt arabinozy białka bogate w hydroksyproline, prolinę i glicynę lektyny arabinogalaktonowe syntaza caluloza na plazmielemie decyduje o syntezie celulozy i jej układzie w ścianie komórkowej w ścianie są plamodesmy są pierwotne i wtórne przez nie odbywa się transport angażujący dużo różnych białek, związany z transportem kwasów nukleinowych, cząsteczek wirusa do niej dochodzą mikrotubule, po których mogą się przemieszczać białko motoryczne kinezyna i dyneina. Do nich przyłączają się kolejne białka z czynnikiem MP i VNA 7 - mRNA z czynnikiem białkowym PTF jest transportowane dużo substancji obronnych WYKŁAD IV PEROKSYSOMY enzymy przyczyniające się do syntazy i rozpadu nadtlenku wodoru ( katalazy i peroksydazy ) wytworzenie bursztynianu, który potem w mitochondriach bierze udział w cyklu Krebsa wymiana związków związanych z fotooddychaniem odbywa się tu pierwotne oddychanie otoczone pojedynczą błoną brak rybosomów i własnego DNA ściśle związane metaboliczne z mitochondriami i chloiroplastami podobne pochodzenie do mitochondriów i plastydów import białek jeśli powstanie Ag powierzchniowe – ich ekspresja lokalizacja jonów wapnia, precypitaty Ca przy plasmodesmach, inkluzje w chloroplastach, pojawienie struktur białkowo- tubularnych JADRO KOMÓRKOWE diploidalna forma lub poliploidalna ( do kilku tysięcy n) przyjmuje różne kształty zawiera jąderko, chromatynę, sok jądrowy, otoczka jądrowa jest porowata, są to kompleksy odpowiednio rozmieszczone w otoczce 8 obwodowych białek +1 - wydostawanie się mRNA rybosomów jądro – struktura nitkowata ( chromocentryczna ) HISTONY; BIAŁKA CHROMATYNY DNA – długa, liniowa cząsteczka 2m DNA, 2nm średnicy Upakowanie DNA – nukleosom, solenoid, pętle, minipasma, chromosomy Transkrypcja a histony rdzeniowe połączenie DNA z histonami ogranicza dostęp białkowych regulatorów transkrypcji, do ich promotorów ( są czynniki zdolne do zmiany struktury nukleosomów i ułatwiają transkrypcję - białko SWJ / SWF ) To białko jest częścią polimerazy II i nadaje zdolność do reorganizacji nekleosomów inne kompleksy – nucleosome remodelling factor ( NURF) czy rożne geny wymagają różnych czynników rozluźniających nukleosom Rola histonu H1 ( in vitro represor ) wpływ na kondensacje chromatyny w zależności od stężenia NaCl H1 łączy się z DNA lawinowo H1 ma warianty sekwencyjne Ulega modyfikacjom potranslacyjnym Wczesne i późne H1 Specyficzność tkankowa ( brak H1 u drożdży ) 6-9 wariantów sekwencyjnych w komórce ulega różnym modyfikacjom wynikiem jest zmienna długość łącznikowego DNA FUNKCJA CHROMATYNY DNA w jądrze człowieka 2 m długości, jądro średnica – 3,4 do 20 m, struktura nukleosomowa bardzo ważna w zwiększaniu zachowania DNA w jądrze. Enzymy uczestniczące w replikacji DNA 1. helikaza – rozwinięcie heliksu DNA, odseparowanie nici rodzicielskiego DNA 2. prymaza DNA – synteza starterowych nici DNA 3. polimerazy DNA – synteza nowych nici DNA, alfa – replikacja nici opóźnionej DNA, beta jądrowego DNA 4. rybonukleaza 5. endonukleazy 6. ligaza 8 7. topoizomeraza JĄDERKO 1. cześć granularna( 2 podjednostki rybosomalne), włóknista 2. „wakuole” 3. centrum fibrylarne z DNA jąderkowym enzymy w jąderku – polimeraza DNA I – numatryna ( dojrzewaniem rybonukleoproteidów ) nukleoina ( udział w transkrypcji rRNA) fibrylaryna rybocharyna - jąderko ma swój cykl jąderkowy w interfazie 1-4 jąderka rozproszenie jąderka ( dezintegracja ) potem asocjacja jąderka na jedną z par chromosomów organizator jąderka NOR (w przewężeniu wtórnym ) połączenie tego organizatora jąderka pod otoczka jądrowa – białka LAMINY – umocowywanie, kondensacja składników jąderka 45s RNA ( w jąderku ) splicing – RNA uczestniczy w tworzeniu podjednostek rybosomów ( udział wielu białek, dostają się przez pory jądrowe jądra do jąderka, łączą się z RNA podjednostkami, łączą się z nimi. Przez pory małe i duże podjednostki wydostają się poza jądro i na terenie cytoplazmy składają się w podjednostki rybosomów, na terenie jąderka, synteza podjednostek ) translacja na terenie cytoplazmy na rybosomach na ziarnistym RE białka adresowane do : I. cytozolu II. peroksysomów III. chloroplastów IV. mitochondriów V. jądra - tworzenie na terenie rybosomów na RE mogą być transportowane do cystern RE, a stamtąd do AG ( tam transformacje), potem w pęcherzyku sekrecyjnym lub w pęcherzach okrytych klartyną ( do systemu wakuolarnego ), do błon, do plasmolemy białka prekursorowe rozfałdowywanie ( HSp 60 ) R* R** R*** GIP - receptory - białko wprowadzające ______________________________________________________błona zewnętrzna matriks miejsca kontaktowe proteazy sortowanie pofałdowanie ( Hsp 70 ) Hsp – białka szoku cieplnego Zasady sygnalizacji komórek sygnały mogą działać na długi lub krótki dystans 9 - każda komórka odpowiada na pewien zestaw sygnałów receptory przekazuj sygnały po wewnątrzkomórkowych szlakach sygnalizacyjnych niektóre cząsteczki sygnałowe mogą przejść przez błonę komórkowa tlenek azotu może wnikać do komórki, aktywować w nich enzymy są 3 główne klasy receptorów powierzchni komórki receptory jonotropowe zmieniają sygnały chemiczne na elektryczne wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjne działają jeśli jest seria przełączników molekularnych Receptory metabotropowe ( współpracujące z białkami G ) - stymulacja receptorów metabotropowych aktywuje podjednostki białek G pewne białka G regulują kanały jonowe też enzymy błonowe szlak cAMP może aktywować enzymy i włączać działanie genów szlak informacyjny przez fosfolipazę C prowadzi do zwiększenia wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ sygnał Ca2+_ uruchamia wiele procesów biologicznych wewnątrzkomórkowe kaskady sygnalizacyjna mogła osiągać niezwykła szybkość, wrażliwość i zdolność adaptacyjną RECEPTORY KATALITYCZNE zaaktywowane receptorowe kinazy tyrozynowe tworzą kompleks w wewnątrzkomórkowymi białkami sygnalizacyjnymi receptorowe kinazy tyrozynowe aktywują białka RAT wiążące GTP sieć kinaz białkowych integruje informacje, co umożliwia kompleksową kontrolę zachowania komórek WYKŁAD V Podział komórek- kondensacja chromatyny Zmiany w otoczce jądrowej Wrzeciono podziałowe tworzy się w miejscu jądra Wrzeciono nie może mieć biegunów U drożdży wrzeciono podziałowe wewnątrz jądra i zachowana jest otoczka jądrowa MITOZA PROFAZA A) kondensacja chromosomów – kontrolowana przez odpowiednie geny oraz białko MPF inaczej p34 aktywny MPF warunkuje także formowanie wrzeciona podziałowego i rozpad otoczki jądrowej, powoduje fosforylacje białek histonu H1 ( spiralizacja, upakowanie włókienek chromatynowych ) i H3 B) formowanie wrzeciona podziałowego Astralne ( centriola, zwierzęta ) lub nieastralne ( rośliny) Złożone z 1000 do wielu tyś mikrotubul Chromosomy przyczepiają się do wrzeciona w kinetochorach i biegną do bieguna. 1. mikrotubule kinetochorowe 2. mikrotubule innerbiegunowe ( nie łączą się z chromosomami) 3. mikrotubule wolne 4. pula białek tubuliny 5. białka motoryczne ( kinezyna i dyneina) Kinezyna popycha prążki wzdłuż układu, segregacja chromosomów i mitozie, reorganizacja cytoszkieletu, wydłużanie wrzeciona podziałowego poprzez tworzenie mostków. Dyneina bierze udział w przemieszczaniu się chromosomów w kierunku biegunów wrzeciona podziałowego. 6. Klmodulina – regulacja puli jonów Ca2+ 10 C) degradacja otoczki jądrowej i jąderka . Ustaje synteza rDNA, zmiany w białkach cytoszkieletu. METAFAZA 1. 2. 3. przemieszczanie się wrzeciona podziałowego w miejsce zajmowane przez jądro przyłączanie się chromosomów do wrzeciona podziałowego poprzez kinetochory ruch chromosomów do płaszczyzny równikowej wrzeciona (kongresja) Chromosomy przyłączają się do wrzeciona podziałowego w płaszczyźnie równikowej w taki sposób, kinetochory chromatyd siostrzanych się połączą z mikrotubulami biegnącymi do przeciwnych biegunów, co po rozpoczęciu anafazy zapewni rozdzielenie chromatyd do przeciwnych biegunów ANAFAZA Ruch chromosomów do przeciwnych biegunów zależy od wielu procesów i czynników ale nie zależy od własności wrzeciona podziałowego. Połączenia chromatyd są poza reginami centromerów. Ruch chromosomów do biegunów jest uzależniony we znacznej mierze od mikrotubul wrzeciona podziałowego. Trucizny mitotyczne Kolichicyna zatrzymuje ruch. Ruch anafazowy składa się z elementów: 1. redukcja odległości między kinetochorami i biegunami Anafaza A 2. wydłużanie odległości między biegunami ( szybkość 1-2 nm/min0 anafaza B potem jest degradacja wrzeciona podziałowego. TELOFAZA Regulacja cyklu komórkowego działanie cyklin i kinaz wytworzenie aktywnej kinazy M – czynnik MPF rozpad cyklin INTERFAZA – produkcja cyklin G1 Bardzo ważne składniki odżywcze, czynniki wzrostowe. CDK – aktywna kinaza fazy S Kinaza p34 Synteza cyklin M Cyklina Dcc 2 musi się połączyć z cyklinami ważnymi w procesie mitozy – tworzy się nieaktywny czynnik MPF – działanie kinaz MO15 MPF – 2 warstwy fosforanowe nieaktywny fosfataza gdy zadziała CD25 – aktywny MPF Metody pozwalające na obserwacje przyżyciowe mikroskopia świetlna nie zmienia komórek materiał nie utrwalony barwienia przyżyciowe Przygotowanie materiału biologicznego do badania w mikroskopie elektronowym 1. pobranie malych fragmentów 2x2 nm 2. utrwalenie np. KMnO4, OsO4 4% paraformaldehyd i 2% glutaroaldehyd. 3. Płukanie w buforach np. fosforanowy 4. Odwadnianie w rosnącym stężeniu alkoholu, acetonie, tlenku propylenu 5. Mieszanki eponowe lub inne żywice np. araldyt, lawicryl 11 6. Zatapianie w bloczkach fragmentów tkanek z oznaczeniem, polimeryzacja żywic w temp np. . 56 stopni Przygotowanie bloczków do krojenia tzw. formowanie piramidek Krojenie mikrosktrawkow Kontrastowanie skrawków octanem ołowiu. Budowa mikroskopu elektronowego kolumna : katoda i anoda wiązka elektronów trafia na preparat- wpada na ekran na którym obserwujemy preparat. Do mikroskopu świetlnego i elektronowego metody immunohistochemiczne, immunocytochemiczne czy cytochemiczne, lokalizacja danego białka w komórce. Utrwalenie chemiczne jest zabiegiem niezbędnym dla ustabilizowania białek, podstawowych składników chemicznych komórki. Ważne jest utrzymanie przestrzennej struktury cząsteczek i zachowanie właściwości chemicznych białek tj jak utrzymanie ich w takiej postaci w jakiej występują w żywej komórce Idealne utrwalenie nie jest możliwe ze względu na znaczna wrażliwość cząsteczek białek maja wpływ rożne czynniki fizyczne i związki chemiczne. Stosowanymi w technikach histologicznych , często utrwalacze które dobrze zachowują struktury są bezużyteczne w histochemii białek ponieważ powodują modyfikacje chemiczne Utrwalacze stosowane w cyto i histologii powinny spełniać warunki: 1. szybkie przenikanie w tkanki 2. nie wywołać pęcznienia białek ani ich kurczenia 3. chronić przeć wtórnymi uszkodzeniami w czasie procedur odwadniania, zatapiania w histochemii utrwalanie ma w mniejszym stopniu zmieniać strukturę i charakter chemiczny białek posługiwanie się materiałem nie utrwalonym stwarza możliwość powstawania artefaktów chemicznych i struktur wywołanych stosowanymi płynami inkubacyjnymi w reakcjach histochemicznych używanie materiału nieutrwalonego – powstanie artefaktów chemicznych i strukturalnych – wywołane przez płyny inkubacyjne w reakcjach histochemicznych metoda srebrzenia – przy jej użyciu widać chromosomy we wtórnych przewężeniach (NOR) metody immunohistochemiczne – wykrywanie i lokalizacja komórki i tkanki na zasadzie reakcji antygen – przeciwciało 1. antygen – przeciwciało ( znakowane) 2. przeciwciało – antygen ( znakowany) 3. znakowanie fluorochromi : 1. 2. 3. 4. FITC – izocyjanina fluoresceiny – zielona FIC izocjanina fluoresceiny żółta TRITC – czerwona PANSYL chlorek dansylu?? Enzymami ; peroksydaza, fosfataza zasadowa, cytochrom c, beta – galaktozydaza Białka zawierające – metale ( ferrytyna ) złoto koloidowe , srebro Metody pośrednie Z nieznakowanym przeciwciałem Białko A złoto koloidowe Biotyna WYKŁAD VI - kinaza aktywująca kinaza inhibitująca 12 Powstawanie aktywnego MPF ( czynnika promującego mitozę 0 Kinaza Cdc 2 połączy się z cykliną B kiedy poziom cyklin osiągnie progową wartość, następuje fosforylacja Cdc 2 w miejscu aktywacyjnym przez kinazę MO15 i w miejscu katalizacyjnym przez drugą kinazę. Kompleks na który działa Cdc25 fosfataza uaktywnia kompleks Cdc 2 – cykliczny czyli MPF RÓŻNICOWANIE Jako proces między wyjściowym a końcowym stanem komórek lub różnic między komórkami a różnymi częściami organizmu. Mechanizmy różnicowania to główne zagadnienie biologii rozwoju badania z zastosowaniem wielu metod. 1. różnicowanie a cykle komórkowe. Poziom DNA w kom. Merystematycznej 2C lub 4C blokada cyklu komórkowego w fazie G1 2C, w fazie G2 4C. Powszechnym zjawiskiem jest endoreplikacja i endoploidalność, rośliny okrytozalążkowe mają często komórki 8C, 16C. W komórkach wieszadełka fasoli 2048C mogą być kopie części Genuom, czyli amplifikacje. Np. endopoliploidalnośc komórek włosków, kory pierwotnej w miejscach powstawania brodawek korzeniowych, miękiszu wodonośnym, mezofilu. 2. różnicowanie a wzrost komórek 3. wzrost a kształt komórek 9wzrost szczytowy, wzrost dyfuzyjny) Auksyna – aktywowanie H+-ATP-azy w plazmolemie – wpływ H+: 1. hiperpolaryzacja – pobranie K+ 2. zakwaszenie ściany komórkowej – rozluźnienie ściany komórkowej –spadek turgoru – obniżenie potencjału wody w komórce – pobranie wody ( wzrost komórki) 3. alkaizacja cytoplazmy – synteza jabłczanów – obniżenie potencjału wody w komórce – pobranie wody ( wzrost komórek) Wzrost a kształt komórek szczytowy – włośniki łagiewka pyłkowa dyfuzyjny – równomierny, zmiana układu mikrotubul Różnicowanie a ekspresja genomu totipotencja komórek regulacja ekspresji genów 1. 2. 3. transkrypcja i procesy potranskrypcyjne translacja i procesy potranslacyjne białka towarzyszące i efektory allosteryczne ekspresja genów a sygnały ze środowiska los komórek jest funkcja jej położenia w organizmie podziały asymetryczne morfogeny kompetencja komórek receptory sygnałów i transdukcja różnicowanie komórek w układach modelowych embriogeneza starzenie się komórek programowana śmierć komórek podczas rozwoju roślin Selektywna eliminacja komórek jest warunkiem koniecznym prawidłowego przebiegu rozwoju roślin. Odgrywa ona istotną rolę w embriogenezie i homeostazie dojrzałych organów. W pewnych przypadkach degradacja protoplastu umożliwia prawidłowe funkcjonowanie martwych elementów tkanki. 13 Niektóre symptomy opisane u zwierząt zaobserwowano także podczas degradacji komórek i tkanek roślinnych. Mimo podobieństw można sądzić, że apoptoza nie jest formą śmierci komórek roślinnych ,a pojawiające się zmiany określa się jako apoptosis - like W unicestwianiu komórek roślinnych uczestniczą procesy autolizy i autografii. Śmierć komórek może mieć podłoże patologiczne lub może być elementem genetycznie zaprogramowanego programu eliminacji. Stad można wyróżnić dwie formy umierania komórek : 1.fizjologiczna 2.patologiczna 1. element genetycznego programu realizowany podczas rozwoju i morfogenezy organizmu w celu kontroli liczby komórek i usuwania uszkodzonych komórek niezdolnych do wypełniania właściwych funkcji i potencjalnie szkodliwych dla innych komórek zachodzi także podczas starzenia organizmu i w odpowiedzi na infekcje mikroorganizmami patologicznymi jako tzw. rekacja nadwrażliwości. Ta forma eliminacji nazywana jest programowana śmiercią komórki PCD U roślin PCD występuje w rożnych fazach rozwoju w pokoleniu gametofitu i sporofitu np. degradacja 3 makrospor, synergid, degradacja wieszadełka. W embriogenezie, kom. Tapetum i bielma, eliminacja zawiązków pręcików, kwiatów jednopłciowych, komórek czapeczki w korzeniu, różnicowanie komórek ksylenu, powstawanie aerenchymy. Za eliminacje komórek roślinnych wydają się odpowiedzialne autoliza i autografia , a nie heterografia jak u zwierząt. 2. - śmierć patologiczna zwana nekroza zachodzi w sposób przypadkowy zwykle w wyniku mechanicznego uszkodzenia tkanki lub silnych czynników stresowych: niedotlenienie utrata równowagi osmotycznej WYKŁAD VII - mikroskop elektronowy mikroton łamarka podstawowe metody przystosowania tkanek do mikroskopu METODA I CELE TYPY I PROCEDURY Utrwalenie: Zachowanie strukturalnej organizacji komórki, tkanki i narządu. Uniemożliwienie rozkładu przez bakterie i enzymy czyni nierozpuszczalnymi składniki tkanki zapobiegając dyfuzji, chroni przed uszkodzeniem w późniejszych etapach obróbki tkanki Utrwalenie chemiczne najczęściej wykorzystuje się utrwalacze chemiczne proste ( jednoskładnikowe ) lub złożone ( mieszaniny). Najlepsze rezultaty uzyskujemy dzięki szybkiej penetracji utrwalacza do żywej tkanki. OGRANICZENIA I MOŻLIWE ARTEFAKTY Zjawisko fluorescencji – to zdolność substancji np. fluorochromów do emisji światła po pobudzeniu kwantem promieniowania, ale o krótszej fali niż światło emitowane. Mikroskop fluorescencyjny to zmodyfikowany mikroskop świetlny wyposażony w dodatkowe układy optyczne oraz światła o odpowiednim zakresie widma i energii promieniowania. W zależności od drogi świetlnej są dwa rodzaje promieniowania fluorescencyjnego. DIA – w świetle przechodzi klasyczna droga światła i kondensator ciemnego pola 14 - EPI – w świetle odbitym światło z lampy przechodzi przez poziomy tunel w obudowie mikroskopu do tzw. lusterka dochroicznego, w którym odbija się pod kątem 45 stopni i kieruje w dół by przejść przez obiektyw i dojść do preparatu. Fluorescencja wzbudzona w preparacie powraca tą samą drogą co promieniowanie z lampy do lusterka dichroicznego, które odbije i przyczynia promieniowanie o kreślonej fali. Właściwą długość fali w mikroskopie fluorescencyjnym uzyskuje się za pomocą odpowiednich filtrów. Promieniowanie musi się znajdować w widzialnej części widma między 400 a 700 nm. DWA RODZJE FILTRÓW 1. PIERWOTNE ( eksytacyjne ) przepuszczają wiązkę światła nie wzbudzonego do wzbudzenia fluorescencji 2.WTÓRNE usuwają promienie zbędna, nie związane z inkubowaną fluorescencja fluorochromu - szerokość wiązki światła przepuszczanej przez filtr decyduje o jego rodzaju jakości im większa jest wiązka światła tym bardziej jest związana z określonym fluorochromem przykładowo przy użyciu FITC ( fluorochrom) indukcja fluorescencji ma miejsce przy 490 nm długość fali świetlnej a powstała fluorescencja znajduję się 525nm Palniki fluorescencyjne wysokociśnieniowe lampy rtęciowe lampy halogenowe źródła laserowe 15
