Autoreferat rozprawy doktorskiej mgr Aleksandry Sołygi
advertisement
Autoreferat rozprawy doktorskiej mgr Aleksandry Sołygi-Żurek „Rola wywoływanych promieniowaniem UV uszkodzeń DNA mitochondrialnego w starzeniu się skóry ludzkiej.” Promotor: prof. dr hab. Ewa Bartnik (Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski) Recenzenci: prof. dr hab. Barbara Lipińska (Katedra Biochemii, Wydział Biologii, Uniwersytet Gdański) prof. dr hab. Maria Małgorzata Sąsiadek (Katedra i Zakład Genetyki, Uniwersytet Medyczny im. Piastów Śląskich we Wrocławiu) Praca doktorska wykonana w Instytucie Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski Za podstawowy czynnik odpowiedzialny za egzogenne starzenie się skóry uważa się promieniowanie ultrafioletowe. Z procesami starzenia, a także foto-starzenia skóry, wiążą się zmiany i zaburzenia w funkcjonowaniu mitochondriów. Tak więc stan mitochondriów wydaje się znakomitym markerem starzenia, a uszkodzenia DNA mitochondrialnego stosunkowo łatwym obiektem do szybkiej analizy i oceny. Ze względu na większe narażenie na uszkodzenia oksydacyjne i większą podatność na szkodliwe działanie promieniowania ultrafioletowego, sugerowano już wykorzystanie mtDNA w ocenie stopnia foto-uszkodzeń w skórze. Uszkodzenia DNA mitochondrialnego takie jak duże delecje czy powtórzenia tandemowe rzeczywiście obserwowano w skórze z rejonów ciała eksponowanych na promieniowanie ultrafioletowe. Zmiany w mitochondrialnym DNA (mtDNA), takie jak delecje obejmujące fragmenty o wielkości kilku tysięcy par zasad, mogłyby być dobrym markerem stopnia foto-uszkodzenia skóry, o ile mogą one ulegać akumulacji w komórkach. Celem rozprawy była próba stworzenia modelu do badań in vitro procesów wiążących się z fotostarzeniem skóry, mogącego mieć zastosowanie także w poszukiwaniu nowych substancji modulujących działanie UV na komórki skóry. W tym celu przeprowadzono analizę częstości występowania dwóch dużych rearanżacji w mtDNA (delecji obszaru o wielkości 4977 pz czyli tak zwanej „powszechnej delecji” oraz delecji o wielkości 3895 pz) w próbkach skóry polskich pacjentów oraz badano związek pomiędzy występowaniem tych delecji, a ekspozycją komórek skóry na promieniowanie ultrafioletowe. Oceniano także wpływ ich obecności na przeżywalność komórek skóry i stres oksydacyjny. W trakcie przeprowadzonych badań ustalono, że obie badane delecje są uszkodzeniem stosunkowo często obserwowanym w skórze właściwej z rejonów ciała częściej eksponowanych na promieniowanie słoneczne (w obu przypadkach wykryto ich obecność u ok. 10% pacjentów). „Powszechną delecję” obserwowano też częściej wraz z wiekiem. Oba uszkodzenia zaobserwowano jednak także, w pojedynczych przypadkach, w skórze z rejonów chronionych przed słońcem. Sugeruje to, że procesy prowadzące do powstawania obu delecji mogą zachodzić również pod wpływem innych czynników, a nie tylko w wyniku narażenia na UV. Ekspozycja skóry na promienie słoneczne pozostaje jednak istotną przyczyną uszkodzeń mtDNA. Badane delecje wykrywano, poza jednym przypadkiem, jedynie w skórze właściwej i w wyprowadzonych z niej hodowlach fibroblastów, w których jednak zanikały one już w trzecim pasażu. Jednakże wykazano, że prowadzenie hodowli komórkowej w pożywce pełnej, wzbogaconej urydyną i pirogronianem, a więc pożywce stosowanej w hodowli tzw. komórek Rho0 pozbawionych mtDNA, pozwala utrzymać obie delecje znacznie dłużej bo nawet do 7 pasażu, co umożliwia już swobodne wykorzystanie komórek zawierających takie uszkodzenia w badaniach in vitro. W dalszej części pracy wykazano, że wystąpienie delecji w mtDNA fibroblastów oraz keratynocytów z linii HaCaT można zaindukować poprzez naświetlania małymi dawkami UVA, a w przypadku delecji 3895 pz także UVB. Tak zaindukowane delecje, podobnie jak w większości przypadków w skórze in vivo, obecne były jedynie w niewielkiej części cząsteczek mtDNA i nie miały wyraźnego wpływu na przeżywalność komórek, funkcjonowanie łańcucha oddechowego i poziom stresu oksydacyjnego w komórkach. Indukcja delecji w mtDNA po ekspozycji na UVA była hamowana w obecności antyoksydantów, takich jak tokoferol i Lergotioneina. Co interesujące, zastosowanie wyższych (lecz wciąż sub-letalnych) dawek UVA także hamowało powstawanie badanych uszkodzeń mtDNA. Zjawisko adaptacji komórek po stosunkowo niskich dawkach UVA jest już znane i może ono wiązać się ze stymulacją enzymów antyoksydacyjnych. Jednak przedstawione w rozprawie obserwacje dotyczące fibroblastów naświetlanych in vitro sugerują, że skumulowane dawki UVA, które są zbyt niskie aby wywołać odpowiedź adaptacyjną, mogą mieć potencjalnie niekorzystny wpływ na mitochondria i komórki skóry właściwej, indukując powstawanie delecji w mtDNA. Z uwagi na coraz szersze stosowanie promieniowania ultrafioletowego w leczeniu chorób skóry, a także w związku z niesłabnąca popularnością opalania, tym istotniejsze wydają się badania nad procesami zachodzącymi w komórkach skóry po ekspozycji na UV oraz możliwość oceny indywidualnej wrażliwości na UV. Zaburzenia funkcjonalności białka hSuv3p, składnika mitochondrialnego degradosomu RNA, istotnego także w replikacji mtDNA, wpływały natomiast na szybsze pojawianie się „powszechnej delecji” (obserwowano jej wystąpienie już po dwóch naświetlaniach standardową dawką 8 J/cm2, w porównaniu do dwunastu dawek niezbędnych dla uzyskania tego efektu w komórkach z niezmutowanym białkiem). Wyniki te wymagają dalszych analiz, jednak mogą wskazywać na możliwy mechanizm powstawania dużych delecji w genomie mitochondrialnym. Opisane w rozprawie obserwacje wskazują jednak, że możliwe jest wykorzystywanie modeli komórkowych z zaburzonym funkcjonowaniem białka Suv3p, w celu szybszego uzyskania obecności „powszechnej delecji”. Mogłoby to pozwolić na przeprowadzanie eksperymentów oceniających skuteczność substancji chroniących komórki przed UV w znacznie krótszym czasie. Jako, że „powszechna delecja” wydaje się uszkodzeniem łatwiejszym w indukcji, może ona znaleźć potencjalne zastosowanie w badaniach in vitro, na przykład przy poszukiwaniu nowych kosmetycznych substancji ochronnych. Zastosowanie obu delecji jako markerów diagnostycznych in vivo wydaje się jednak niepraktyczne, z uwagi na to, że występują przede wszystkim w głębszych warstwach skóry.
