Wykład 4

Mitochondrialny DNA jako źródło
markerów molekularnych
Po co nam mitochondrialny DNA?
•
•
•
•
•
•
16 569 bp
Różnica w zawartości G – nić ciężka (H) i
lekka (L)
37 genów – 22 tRNA, 12S i 16S rRNA, 13
genów kodujących białka (składniki
kompleksów łańcucha oddechowego)
Wysoce upakowana organizacja – nie ma
intronów, sekwencje kodujące są ułożone
jedna za drugą lub oddzielone jedynie
kilkoma nukleotydami
Dwa obszary niekodujące
– pętla D – 1 kpz (początek replikacji nici
H, promotory transkrypcji dla nici L i H)
- region 30 pz – początek replikacji nici L
W pętli D znajdują się dwa regiony
polimorficzne – Hypervariable Region I
(HVI) i Hypervariable Region II (HVII) o
długości 342 pz i 268 pz
Mateczne dziedziczenie mtDNA
Mikroiniekcja
plemników do
oocytów i ich
późniejszy
rozwój
Plemnik
przed
i
po (60 min)
mikroinjekcji
Podwójne barwienie:
DNA – SYBR Green I
Mitochondria- MitoTracker CMTMRos
Mechanizmy:
1. Rozcieńczenie ojcowskiego mtDNA –
plemnik – 100 kopii
oocyt – 105 – 108
2. Aktywna eliminacja mtDNA plemnika
towarzysząca zapłodnieniu:
(i) Stopniowe zmniejszenie liczby
mt nukleoidów podczas
spermatogenezy
(ii) Degradacja mtDNA plemnika po
zapłodnieniu, ale przed destrukcją
mitochondriów plemnika
Ryżówka japońska
Cechy mtDNA
heteroplazmia
- komórka zawiera setki mitochondriów, a każde z
nich 2-10 cząsteczek mtDNA
- genom mitochondrialny ewoluuje dużo szybciej
niż jądrowy, liczba różnic między dwoma ludzkimi
genomami mitochondrialnymi – od 10 do 66
- heteroplazmia
- Mutacje mtDNA u ludzi mogą powodować ubytek
energii w komórce, który wpływa najbardziej na:
- ośrodkowy układ nerwowy
- mięsień sercowy
- mięśnie szkieletowe
- nerki
- tkanki produkujące hormony
- ale nie płuca lub wątroba!
CTCTCCCACTTTAAAGCTAAATAAGGA
?
G
Polimorfizm ludzkiego mtDNA
Morf – wzór restrykcyjny otrzymywany za
pomocą danego enzymu restrykcyjnego
Morfy AvaII
Haplogrupa – typy mtDNA
charakteryzujące się obecnością lub
brakiem miejsc restrykcyjnych dla
jednego lub kilku enzymów
restrykcyjnych.
Do pewnego stopnia odzwierciedlają
ewolucję ludzkiego mtDNA.
W obrębie haplogrupy występują różne haplotypy
Ćwiczenia – kto należy do haplogrupy H?
Haplogrupa H – barak miejsca cięcia dla enzymu AluI w pozycji 7025 bp.
1. Amplifikacja fragmentu mtDNA o wielkości 264 bp, który zawiera
region polimorficzny.
2. Trawienie enzymem AluI i elektroforeza w żelu agarozowym.
Produkty PCR
produkty PCR/AluI
-H
264 bp
H
H -H
168
128
55
41, 40
Markery mtDNA – mutacje punktowe,
rzadziej delecje, służące
diagnozowaniu chorób
mitochondrialnych.
Choroby związane z mutacjami w mtDNA to choroby
neurodegeneracyjne
- mutacje punktowe w - genach tRNA
MERRF – padaczka, poszarpane czerwone włókna (ang. myoclonic epilepsy and ragged red
fibre)
MELAS – mitochondrialna encefalomiopatia, kwasica mleczanowa, napady udaropodobne
(ang. mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes)
- genach rRNA
AID – 12SRNA - głuchota spowodowana przez aminoglikozydy (antybiotyki:
spektromycyna, kanamycyna, neomycyna, gentamycyna) (ang. aminoglycoside-induced
deafness)
- genach kodujących białka
LHON – dziedziczna neuropatia wzrokowa Lebera (ang. Leber’s hereditary optic
neuropathy)
NARP – neuropatia obwodowa mięśni, ataksja i barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (ang.
neurogenic muscle weakness, ataxia and retinitis pigmentosa)
Zespół Leigha (ang. Leigh syndrome) – mutacje w białkach kompleksu I, zaburzenia
motoryczne, niewydolność mięśni oddechowych opóźnienie rozwoju
•
•
•
•
delecje – pomiędzy COXI a cyt b (1 – 8
kpz), dwie częste delecje (4997 pz i 7436
pz), zazwyczaj są sporadyczne rzadko
dziedziczne
CPEO – przewlekły postępujący paraliż
mięśni oka (ang. chronic progressive
external ophtalmoplegia)
Zespół Kearnsa-Sayre’a (KSS) (ang.
Kearns-Sayre syndrome) – degeneracja
siatkówki, zaburzenia pracy serca, niski
wzrost, utrata słuchu, cukrzyca,
niewydolność nerek
Zespół Pearsona (ang. Pearson’s
syndrome) – zaburzenia w produkcji
czerwonych krwinek, upośledzone działanie
trzustki
Objawy kliniczne chorób mitochondrialnych
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Miopatie
Encefalopatie
Kardiomiopatie
Oftalmoplegia (porażenie mięśni
odwodzących oka)
Zmęczenie
Ataksja (brak koordynacji ruchów)
Padaczka
Udar
Uszkodzenia nerwu wzrokowego
Głuchota
Demencja
Bóle głowy
Dystonia
Mutacje mtDNA i nowotwory
THIS SITE BEST VIEWED IN INTERNET EXPLORER 4.5 AND NETSCAPE 5.0 OR NEWER VERSIONS!
Forensic Mitochondrial DNA Analysis
When forensic cases arise where there is insufficient biological
material for nuclear DNA typing, mitochondrial DNA analysis
can provide valuable supplemental information, even from such
limited samples as half-centimeter long hair fragments or single
teeth. Because of its usefulness when limited biological material is
available, and due to its unique pattern of maternal inheritance,
mtDNA is playing a significant role in investigation and
prosecution of active criminal cases, post-conviction exoneration,
re-examination of cold cases, genealogical studies where
maternal relatedness is in question, and missing persons
investigations.
Forensic Use of Mitochondrial DNA
The Defense Department certified the use of mitochondrial DNA as a forensic tool
in identifiying long-dead or unknown servicemen. Blood samples have been collected
from more than 1,800 family members of servicemen who remain missing action.
Mitochondrial DNA is passed down through the maternal line and can be nearly
identical within the same family for up to 30 generations.
Shown below is a hypothetical pedigree indicating some of the relatives of a
serviceman who could be used for identification.
Znaczenie mtDNA w identyfikacji materiału
biologicznego
•
•
•
•
•
Kiedy wykorzystuje się analizę mtDNA w testach na potwierdzenie tożsamości:
- zdegradowany materiał biologiczny
- bardzo małe ilości materiału wyjściowego do badań
Przypadki, w których analiza mtDNA jest szczególnie przydatna
Identyfikacja osób zaginionych jeśli dostępny jest materiał genetyczny od ich
matki - dziedziczenie mateczne mtDNA
Jeśli materiałem dowodowym są włosy lub zdegradowane (nawet spalone) szczątki
szkieletu
- włosy – od fragmentów o długości 3 mm
- średnica włosa
- odległość od cebulki
Sprawy rozpatrywane ponownie po długim czasie od wydania pierwszego wyroku
Ograniczenia - analiza mtDNA nie pozwala na rozróżnienie osób spokrewnionych
w linii matki (matka i córka, brat i siostra)
Analiza mtDNA z „trudnych” źródeł
Mitotyping Technologies, State College, Pennsylvania, USA
•
Indywidualna analiza każdej próbki
•
Kompletna sekwencja regionów HV1
(15997 – 16400) i HV2 (30 – 407)
•
Pierwsze podejście – amplifikacja
fragmentów o długości ok. 250 pz
•
Drugie podejście (ang. ancient DNA
approach) – amplifikacja mniejszych
fragmentów – 80 – 140 pz z HV1
(metoda stosowana z sukcesem w analizie
szczątków szkieletowych
Neandertalczyków).
Trudność – większe zagrożenie
zanieczyszczeniem!
•
Trudności w analizie mtDNA wynikające z
obecności heteroplazmii
•
Różnorodność typów mtDNA
prawdopodobieństwo przypadkowego
wybrania dwóch identycznych prób jest
jak 1:300 – 1:400.
Identyfikacja szczątków rodziny Romanowów cd.
Tożsamość Aleksandry potwierdzono wykazując
identyczność mtDNA w odnalezionych szczątkach
i mtDNA księcia Edynburga – Filipa
Tożsamość cara Mikołaja – analiza mtDNA dwojga
krewnych w linii matecznej
Snuppy to prawdziwy klon otrzymany
metodą transferu jądra komórki somatycznej
Tai
ncDNA
mtDNA
Snuppy
=
=
ncDNA
mtDNA
WYNIKI
• Badania objęły populacje plemienne oraz kastowe
• Brak istotnej różnicy w mtDNA pomiędzy populacjami plemiennymi a
kastami, jedynie w wyższych kastach większa częstotliwość haplogrup
Euroazjatyckich.
• Różna dystrybucja markerów chromosomu Y w populacjach plemiennych i
kastach. Większe podobieństwo populacji plemiennych do niższych niż do
wyższych kast.
WNIOSKI
• Jednorodność matczynej puli genowej wskazuje na to, że od późnego
Plejstocenu inwazje Indii były dokonywane przez mężczyzn.
• Niższe kasty wywodzą się z populacji plemiennych i powstały przez
hierarchiczne podziały, które towarzyszyły migracjom w Neolicie.
• Ludność pochodzenie Indoeuropejskiego utworzyła kasty wyższe.
Era postgenomiczna czyli „ DNA barcoding”
• Idea kodu kreskowego DNA (ang. DNA barcoding) opiera się na
założeniu, że krótka, odpowiednio dobrana, sekwencja DNA może
pozwolić na ustalenie przynależności gatunkowej badanego osobnika,
ponieważ zmienność genetyczna pomiędzy gatunkami jest większa od
zmienności wewnątrzgatunkowej.
• Bazy danych kodu kreskowego DNA zawierają krótkie sekwencje DNA
pochodzące od kilku osobników z każdego z dużej liczby gatunków.
• Uzyskany dla danego osobnika kod kreskowy DNA jest porównywany z
biblioteką kodów pochodzących od osobników o znanej przynależności
gatunkowej. W ten sposób osobnik jest albo identyfikowany, albo
kierowany do analizy taksonomicznej.
Uniwersalny standard
•
•
•
Różne genywykorzystywano do biosystematyki na poziomie gatunku, ale
dąży się do tego, aby kody kreskowe DNA otrzymywać na bazie jednego,
wybranego uniwersalnego standardu.
Takim standardem stał się fragment 5’ końca mitochondrialnego genu
COI (cox1)
>95% gatunków posiada unikalny kod kreskowy uzyskany na bazie
sekwencji COI
W taksonomii kod kreskowy DNA może być użyty do
identyfikacji gatunków. Uzyskanie kodu kreskowego
wskazuje nietypowe osobniki, które następnie podlegają
analizie taksonomicznej. Kody kreskowe pozwalają na
wstępne „posortowanie” analizowanych organizmów.
W genetyce
populacyjnej kody
kreskowe daja
pierwsze, orientacyjne
pojęcie o genetycznym
zróznicowaniu danej
populacji.
W filogenetyce
molekularnej baza kodów
kreskowych pomaga w
odpowiednim doborze
gatunków do tworzenia
drzew filogenetycznych.
Można także wykorzystać
zasoby tej bazy sekwencje
i materiał biologiczny.