DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA 1. Rodzaje diagnostyki

DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA
1. Rodzaje diagnostyki molekularnej:
- diagnostyka bezpo rednia – ma zastosowanie w przypadku, gdy prawidłowy
gen jest poznany, a jego sekwencja mo e by wykorzystana jako sonda
molekularna lub starter w celu wykrycia mutacji w DNA;
- diagnostyka po rednia – stosujemy, kiedy gen zwi zany z wyst powaniem
okre lonej choroby genetycznej jest nieznany; wykorzystuj c analiz sprz e
lub analiz asocjacji mo emy wyselekcjonowa geny, w ród których znajduje
si nasz poszukiwany gen-kandydat.
2. Metody stosowane w diagnostyce molekularnej:
- hybrydyzacja z sondami molekularnymi
- metoda PCR – ła cuchowej reakcji polimerazy
•
Hybrydyzacja (renaturacja) – tworzenie podwójnej helisy mi dzy komplementarnymi
niciami DNA lub RNA, pochodz cymi z ró nych ródeł.
Techniki hybrydyzacyjne:
- hybrydyzacja punktowa – pozwala na jednoczesne wykrywanie i identyfikacje
wielu próbek na tym samym filtrze,
- hybrydyzacja typu Southern – stosowana najcz ciej, dotyczy hybrydyzacji
DNA-DNA. Ma na celu wyszukanie sekwencji DNA spo ród mieszaniny
fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi,
- hybrydyzacja Nothern – dotyczy hybrydyzacji RNA-DNA i dostarcza
informacji o ekspresji genów,
•
Amplifikacja DNA metod PCR (ła cuchowej reakcji polimerazy) – reakcja ta
odzwierciedla naturalny proces replikacji i umo liwia w warunkach in vitro szybkie
powielenie wybranych odcinków DNA lub RNA. Badana sekwencja DNA jest
powielana przy u yciu pary oligonukleotydowych starterów, z których ka dy jest
komplementarny do jednego ko ca sekwencji docelowej DNA. Startery te s
wydłu ane w kierunku przeciwnym, za pomoc termostabilnej polimerazy DNA, w
cyklu który obejmuje trzy podstawowe etapy:
- denaturacja dwuniciowej matrycy – 90-95°C,
- wi zanie starterów do jednoniciowej matrycy 50-65°C,
- synteza nici komplementarnej 68-72°C
Produkty PCR – wizualizacja nast puje poprzez rozdział elektroforetyczny. Cz steczki
DNA umieszczone w elu migruj w polu elektrycznym od ujemnie do dodatnie naładowanej
elektrody, a ich szybko zale y od wielko ci cz steczki – im mniejsze tym szybciej b d si
przesuwały w elu. Wybarwione bromkiem etydyny (mutagen interkaluj cy DNA) s
widoczne po na wietleniu wiatłem UV.
Strategia diagnostyki molekularnej:
Du e zmiany genowe :delecje, duplikacje , insercje
Delecje mog by wykryte metod Southerna lub PCR-Multiplex. W
najcz ciej stosuje si metody ilo ciowe: Q-PCR.
Przykład: dystrofia mi niowa Duchenne’a
duplikacjach
Znane mutacje w miejscu restrykcyjnym
Analiza RFLP (analiza polimorfizmu długo ci fragmentów restrykcyjnych), która mo e
wykaza odmienny układ fragmentów DNA po ci ciu okre lonym enzymem restrykcyjnym.
Przykład: fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia
Znane mutacje punktowe poza miejscem restrykcyjnym
Strategia wykrywania opiera si na metodzie ASO lub ASA, czyli wykorzystaniu znajomo ci
mutacji do skonstruowania odpowiednich sond lub starterów, które wykryj zarówno allel
prawidłowy, jak i zmutowany.
Przykład: mukowiscydoza (CF)
Nieznane mutacje
Techniki przesiewowe - identyfikacja zmian w sekwencjach oparta na porównaniu
wielokrotno ci i/lub konformacji badanych dwu- i jednoniciowych fragmentów kwasów
nukleinowych. Wspólnym elementem jest powielenie badanego fragmentu DNA technik
PCR i rozdział elektroforetyczny w elu poliakrylamidowym np. PCR-HD (heterodupleksy),
PCR-SSCP (polimorfizm konformacji fragmentów jednoniciowych), PCR-DGGE.
Przykład: zespół Marfana
Sekwencjonowanie
Najcz ciej u ywan metod jest metoda Sangera, oparta o syntez DNA przez polimeraz
DNA in vitro. Do reakcji dodaje si niewielk ilo dideoksynukleotydów, które s
wbudowywane w DNA, ale nie mog by substratem do dalszego wydłu ania nici. W ten
sposób otrzymuje si fragmenty DNA zako czone specyficznym nukleotydem. Produkty
reakcji rozdziela si elektroforetycznie, co powoduj ich segregacj pod wzgl dem wielko ci
produktów.
Analiza sprz e
Metoda stosowana w sytuacji kiedy nie znamy genu zwi zanego z wyst powaniem okre lonej
choroby genetycznej. Celem tej metody jest znalezienie sekwencji DNA (markera
genetycznego), która jest dziedziczona ł cznie z poszukiwanym przez nas genem. Analiza
sprz e wymaga pobrania materiału od wielu członków rodziny w celu ustalenia segregacji
markerów genetycznych z locus poszukiwanego genu. Aby wynik był jednoznaczny, osoba
obci ona ryzykiem przeniesienia genu warunkuj cego chorob musi by heterozygot pod
wzgl dem markera. Stosowana dla chorób jednogenowych o mendlowskim typie
dziedziczenia.
Analiza asocjacji
Polega na badaniu porównawczym rozkładu alleli ró nych polimorfizmów pomi dzy grup
chorych niespokrewnionych a grup kontroln . Analiza asocjacji wykrywa ró nice w
rozkładzie alleli – stwierdzenie bezpo redniej asocjacji identyfikuje zarówno gen, jak i
polimorfizm odpowiedzialny za zwi kszone ryzyko wyst pienia choroby. Stosowana w
chorobach uwarunkowanych wielogenowo/wieloczynnikowo.
Polskie Towarzystwo Genetyki Człowieka: www.ibb.waw.pl/∼ptg c
GeneTests www.geneclinics.org
Strategia diagnostyki genetycznej
gen znany
gen nieznany
poszukiwanie mutacji
analiza sprz e
Poszukiwanie mutacji
mutacje znane
mutacje
punktowe
mutacje nieznane
rearan acje
genowe
PCR-RFLP
PCR-ASA
ASO
metody
przesiewowe
PCR-multiplex
Q-PCR
Southern blot
PCR-HD
PCR-SSCP
PCR-DGGE
Wynik
prawidłowy
inne mutacje/
mutacje w
innych genach
wykluczenie
choroby
nieprawidłowy
potwierdzenie
rozpoznania