Temperatura przyłączania starterów
advertisement
Definicje Białka rekombinowane (ang. recombinant proteins, r-proteins) Białka, które powstały w żywych organizmach (lub liniach komórkowych) w wyniku ekspresji rekombinowanego DNA. Ukierunkowana mutageneza Rekombinowany DNA jest efektem złożenia za pomocą wybranych technik laboratoryjnych fragmentów materiału genetycznego pochodzących z różnych źródeł/organizmów. Utworzone w ten sposób sekwencje DNA nie występują naturalnie w przyrodzie. Jednak dzięki obecności odpowiednich elementów regulatorowych mogą być powielane oraz mogą ulegać ekspresji po wprowadzeniu do komórek gospodarza. (ang. site-directed/site-specific mutagenesis) Technika, umożliwiająca wprowadzenie mutacji w ściśle określonym miejscu łańcucha DNA. Aby można ją było zastosować, konieczna jest znajomość wyjściowej sekwencji nukleotydów w genie. Obecnie, ukierunkowaną mutagenezę przeprowadza się standardowo w oparciu o łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) i odpowiednio zmodyfikowane oligonukleotydy (startery). PCR Powielany fragment DNA Cykl 1 Cykl 3 powielany odcinek DNA 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ Denaturacja (95°C) 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5 ’ 3’ 3’ 5’ przyłączenie starterów (45-65°C) i wydłużanie nici DNA (72°C) Cykl 2 5 ’ 3 ’ 3 ’ 5 3 ’ ’ 5 3’ 5’ ’ 3 5 ’ 3’ 5’ ’ 3 5 ’ ’ 3 5’ ’ 3 ’ 3 ’ 3 ’5 3’ ’ 3 ’ 3 5 ’ 3’ 5’ ’ 3 5’ 3 ’ 5’ ’ 3 5 ’ ’ 3 5’ ’3 5 ’ ’ 3 5’ ’ 5 ’ 5 ’ 5 3’ 5 ’ 3’ ’ 5 3’ 5’ ’ matrycowy DNA produkt reakcji z cyklu 1 produkt reakcji z cyklu 2 produkt reakcji z cyklu 3 PCR, w praktyce wygląda to tak… Powielany fragment DNA 5’ 3’ 5’ 3’ sekwencja startera 1 (forward, left) pokrywa się 3’ z sekwencją nici sensownej (kodującej) 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ Sekwencja startera 2 (reverse, right) pokrywa się z sekwencją nici antysensownej (matrycowej) Mutageneza ukierunkowana, Overlap extension PCR OE PCR, metoda wydłużania nakładających się odcinków 5’ 3’ PCR 1 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ PCR 2 A 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ B 5’ 5’ 3’ 5’ PCR 3 C 5’ 3’ 5’ D 3’ 3’ A 3’ B 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Mutageneza ukierunkowana, Overlap extension PCR 5’ 3’ się odcinków OE PCR, metoda 3’ wydłużania nakładających 5’ 5’ 3’ PCR 1 5’ 3’ A PCR 2 3’ 5’ 3’ starter A 5’ 5’3’ 3’ 5’ 3’ 5’ produkt reakcji 1 5’ 3’ 3’ C 3’ starter D 5’ 3’ denaturacja rehybrydyzacja 5’ 3’ 5’ 5’ A produkt reakcji 2 zmieszanie 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ D starter B 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ PCR 3 reakcja 2 reakcja 1 starter C 3’ 3’ B 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ nie ulega wydłużeniu dNTP, polimeraza, starteryBB i A 3’ ulega wydłużeniu 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’5’ 5’ 3’ produkt reakcji 3 5’ Wprowadzanie modyfikacji na końcach genów Wykorzystanie zmodyfikowanych starterów do wprowadzania mutacji na 5’ i 3’ końcu genu 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ Wprowadzenie/usuwanie sekwencji Shine-Dalgarno/Kozak, kodonu STOP, kodonu START, miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Modyfikacje DNA, wprowadzanie delecji przy pomocy PCR Na początku lub na końcu genu 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ W środku genu PCR 1 – startery A i C 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ A 5’ 3’ 5’ C PCR 2 – startery D i B B 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ D 3’ 3’ PCR 3 – startery A i B 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Mutageneza ukierunkowana c.d., metoda Quik Change ® 1. Wektor z genem wyizolowany z bakterii dam+, docelowe miejsce wprowadzenia mutacji 2. Startery wprowadzające mutację są do siebie komplementarne 3. Powielanie dwóch nici wektora, wprowadzenie mutacji Stratagene 4. Trawienie bakteryjnego DNA, usunięcie nici nie zawierających mutacji Większość szczepów E. coli prowadzi metylację dam+. Endonukleaza DpnI rozpoznaje i trawi jedynie metylowaną sekwencję 5´-Gm6ATC-3´. Quik Change ® – warunki reakcji A QC PCR Etap Cykl Temperatura Czas 1 1 95°C 30 sek. 2 12–18 95°C 55°C 68°C 30 sek. 1 min 1 min/1kz DNA Etap Cykl Temperatura Czas 1 1 95°C 3 min 2 25–30 95°C 55°C 72°C 30 sek. 1 min 1 min/1kz DNA B Normalny PCR 1A – denat. 94°C/60 sek. 2A – denat. 94°C/30min/bez DNA matrycowego/test. aktywności polimerazy 3A – denat. 94°C/10 sek./z DNA matrycowym W wysokiej temperaturze DNA może ulegać depurynacji. Proporcjonalnie, dłuższe matryce będą bardziej uszkodzone niż krótkie. Przy powielaniu długich fragmentów DNA istotne jest skrócenie czasu denaturacji oraz obniżenie temperatury wydłużania. Klonowanie klasyczne wektor fragment DNA zawierający interesujący nas gen fragment DNA (wstawka) po trawieniu enzymami restrykcyjnymi BamHI i EcoRI ligacja (ligaza DNA) wektor pocięty enzymami restrykcyjnymi BamHI i EcoRI wektor po wklonowaniu wstawki – rekombinowanego DNA Enzymy restrykcyjne a metylacja DNA Enzymy restrykcyjne (endonukleazy) występują naturalnie u sinic i bakterii. Razem z komplementarnymi metylazami tworzą system restrykcji-modyfikacji, dzięki któremu mikroorganizmy bronią się przed wnikaniem obcego DNA, np. bakteriofagów. Specyficzna metylacja własnego DNA służy ochronie przed restryktazami syntetyzowanymi przez organizm – obcy DNA, niemetylowany według określonego wzoru, ulega degradacji. Enzymy restrykcyjne EcoRI EcoRV PstI Izoschizomery – enzymy pochodzące z różnych organizmów, rozpoznające te same sekwencje i tnące je w ten sam sposób, np. MspI i HpaII 5'...C^C G G...3' 3'...G G C^C...5' Neoizoschizomery – enzymy pochodzące z różnych organizmów, rozpoznające te same sekwencje, ale tnące je w różny sposób, np. SmaI 5'...C C C^G G G...3‘ i XmaI 5'...C^C C G G G...3‘ 3'...G G G^C C C...5‘ 3'...G G G C C^C...5‘ Metoda OE PCR cloning – klonowanie przy pomocy PCR Wektor, do którego chcemy wprowadzić gen Projektujemy startery, częściowo komplementarne do genu a częściowo komplementarne do wektora Tak zmodyfikowany gen wykorzystywany jest w kolejnej reakcji PCR, gdzie służy za starter Gen, który chcemy wprowadzić do wektora W wyniku reakcji PCR otrzymujemy gen, na którego końcach znajdują się sekwencje komplementarne do wektora Po zakończeniu reakcji zmetylowany wektor, który służył jako matryca zostaje pocięty za pomocą enzymu DpnI Namnożony,niezmetylowany wektor z wklonowanym genem zostaje wprowadzony do komórek gospodarza, gdzie gen może ulec ekspresji Termostabilne polimerazy DNA Pochodzenie Aktyw. 5’ – 3’ egzonukl. Aktyw. 3’ – 5’ egzonukl. Częstość błędów [1x10-6]a Wydłużanie 3’-końca Termostabilność Procesywnośćb Thermus aquaticus tak nie 22 tak 9’ w 97,5°C 50 Pwo Pyrococcus woesei nie tak 3,2 nie >2h w 100°C 20–30 Pfu 1991 Pyrococcus furiosus nie tak 2,6 nie 4h w 95°C Pyrococcus szczep GB-D nie tak 5 nie 8h w 100°C nie tak 0,44 nie Polimeraza Taq 1976 DeepVent Phusion a częstość błędów: ilość błędów/pz/cykl b ilość nukleotydów przyłączonych zanim polimeraza odłączy się od matrycy PCR – ogólne zasady projektowanie starterów Długość starterów – od 18 do 30 zasad, krótsze startery mogą się niespecyficznie wiązać z matrycą 3’ koniec startera – nie powinien zawierać więcej niż 3 zasady G i/lub C, gdyż mogą one stabilizować niespecyficzne oddziaływania starter–matryca 5’ koniec startera – jest mniej krytyczny dla specyficznego przyłączania startera do matrycy dlatego może być modyfikowany Zawartość GC – zasady GC powinny stanowić od 40 do 60 % sekwencji Hybrydyzacja – 3’ koniec starterów nie powinien tworzyć struktury spinki do włosów, startery używane w reakcji nie powinny tworzyć homo- i/lub heterodupleksów hybrydyzacja starterów na końcu 3’ Temperatura topnienia – startery używane w reakcji powinny temperaturę topnienia (różnica 2–5°C), optymalnie – nieco powyżej 60°C mieć zbliżoną Optymalizacja warunków PCR Stężenie starterów: końcowe stężenie każdego ze starterów powinno się zawierać w przedziale między 0,1 a 0,5 µM (6×1012 – 3×1013 cząsteczek). Wyższe – zwiększa prawdopodobieństwo powstania niespecyficznych produktów Stężenie matrycy DNA: ilość używanego matrycowego DNA zależy od jego pochodzenia. Zwykle stosuje się 100–250 ng genomowego i 20–50 ng plazmidowego DNA na 50 µl reakcji Stężenie nukleotydów: końcowe stężenie poszczególnych nukleotydów powinno wynosić ok. 0,2 mM (ilość, która pozwala uzyskać ok. 6–6,5 µg DNA) Ilość cykli – od 25 do 35, w zależności od pochodzenia DNA i ilości matrycy Czas wydłużania starterów – zwykle przyjmuje się regułę 60 sek/1000 zasad Optymalizacja warunków PCR Bufor – standardowy bufor zawiera 50 mM KCl i 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. Podniesienie stężenia KCl do 70–100 mM może zwiększyć wydajność syntezy fragmentów o długości <500 pz. Niektóre bufory obok jednowartościowych jonów K+ zawierają jony NH4+ (obecność jonów NH4+ minimalizuje potrzebę optymalizacji stężenia jonów Mg2+ oraz temperatury przyłączania starterów. temp °C produkt PCR niespecyficzne produkty PCR Stężenie jonów magnezu Critical Factors, for Successful PCR, Users Manual, Qiagen – im wyższe, tym większa wydajność reakcji ale także ilość produktów niespecyficznych Temperatura przyłączania starterów (annealing temperature) – im wyższa, tym bardziej specyficzny produkt reakcji Obliczanie temperatury topnienia starterów Tm = 2°C × (A + T) + 4°C × (G + C) Dla dłuższych oligonukleotydów (do 70 zasad), gdy stężenie kationów jest ≤ 0,4 M można zastosować równanie: Jednoniciowy DNA Absorbancja przy 260 nm Dla starterów liczących nie więcej niż 20 nukleotydów temperaturę topnienia (melting temperature) można wyliczyć wg empirycznej zasady Wallace’a: Częściowo rozwinięty DNA Tm=69 °C Dwuniciowy DNA Temperatura [°C] Tm = 81°C + 16,6 (log10 [K+]) + 0,41(%[G + C]) Temperatura hybrydyzacji (annealing temperature) jest na ogół o 5–10°C niższa od Tm, należy ją ustalić empirycznie. Czynniki wpływające negatywnie na PCR Wysoka zawartość zasad GC jest odpowiedzialna za powstawanie struktur drugorzędowych w obrębie DNA, co prowadzić może do zahamowania aktywności polimerazy. Glicerol, DMSO (2–10%), chlorek tetrametyloamonu (0,01–10 mM), formamid (5–20%) poprawiają wydajność tego typu reakcji PCR. Zanieczyszczenia związkami używanymi przy oczyszczaniu matrycowego DNA Do związków hamujących aktywność polimerazy należą: SDS (>0,005% w/v), fenol (>0,2% v/v), etanol (> 1% v/v), izopropanol (>1% v/v), octan sodu (>5 mM), EDTA (> 0,5 mM). Czystość starterów zależy od sposobu ich oczyszczenia po syntezie. Standardowo startery oczyszcza się stosując sączenie molekularne. Startery o długości powyżej 70 zasad powinny być oczyszczane za pomocą HPLC. Wektory plazmidowe Plazmidy ― ― ― ― ― naturalnie występujące u bakterii pozachromosomalne, koliste, dwuniciowe cząsteczki DNA, 1–200 kpz. ich replikacja przebiega niezależnie od chromosomalnego DNA posiadają mechanizmy umożliwiające zachowanie stałej liczby cząsteczek w komórce gospodarza oraz odpowiednią segregację do komórek potomnych replikacja i transkrypcja genów plazmidowych przebiega zwykle w oparciu o enzymy gospodarza w plazmidach naturalnych zawarta jest informacja decydująca o: oporności/produkcji antybiotyków, syntezie bakteriocyn, enterotoksyn, wytwarzaniu enzymów restrykcyjnych, rozkładzie złożonych związków organicznych, oporności na jony metali ciężkich, zdolności do koniugacji, itp. Wektory plazmidowe ― stworzone na potrzeby klonowania i/lub ekspresji genów ― posiadają m. in: • polilinker, MCS (multi cloning site) • ori (origin) miejsce startu replikacji • marker selekcyjny: np. gen oporności na antybiotyk • promotor − dodatkowo mogą zawierać sekwencje kodujące metki ułatwiające oczyszczanie lub sekwencje białek wykorzystywanych jako partnerzy fuzyjni Wektor do tworzenia białek fuzyjnych (Clontech) Wektor do równoległej ekspresji dwóch białek (Invitrogen)
