Szablon dla tlumaczy
advertisement
Rozdział 30 Metody biochemiczne stosowane w diagnostyce chorób żołądka Krzysztof Siemianowicz Sok żołądkowy jest wydzielany przez gruczoły ściany żołądka, wśród których wyodrębnia się gruczoły wpustowe, właściwe i odźwiernikowe. Wydzielina gruczołów wpustowych składa się głównie z mukoproteidów oraz z niewielkiej ilości elektrolitów. Gruczoły właściwe znajdujące się w dnie i w trzonie żołądka są zbudowane z komórek głównych wytwarzających pepsynogen, komórek okładzinowych produkujących kwas solny i czynnik wewnętrzny Castle’a (IF) oraz komórek szyjkowych wydzielających śluz. Oprócz wymienionych komórek w gruczołach właściwych są ponadto obecne komórki niezróżnicowane, z których regenerują się komórki gruczołowe oraz komórki wydzielnicze o nieokreślonej funkcji endokrynnej. Gruczoły odźwiernikowe są zlokalizowane w okolicy odźwiernika. Zawierają komórki śluzowe, komórki główne oraz liczne komórki serii APUD (ang. amine precursor uptake and decarboxylation), w tym komórki G wytwarzające gastrynę. Skład soku żołądkowego W warunkach fizjologicznych głównymi składnikami soku żołądkowego są: kwas solny, pepsyna, czynnik wewnętrzny Castle’a, amylaza, katepsyny, 1 chymozyna (u niemowląt), elektrolity: chlor, sód, potas, wodorowęglany oraz w niewielkich ilościach: wapń, fosforany, magnez i siarczany, substancje grupowe krwi, glikoproteiny i proteoglikany śluzu, woda. Funkcje kwasu solnego Głównym składnikiem soku żołądkowego jest kwas solny. Pełni on następujące funkcje: Aktywacja pepsynogenu do pepsyny. Komórki główne wytwarzają nieaktywny pepsynogen, który dzięki obecności jonów wodorowych jest przekształcany do aktywnej pepsyny. Proces ten początkowo ma charakter kwaśnej hydrolizy, a następnie proteolizy katalizowanej przez powstałe cząsteczki pepsyny (autokataliza). W wyniku tych procesów od pepsynogenu zostaje odłączonych kilka polipeptydów. Stworzenie optymalnego pH dla pepsyny. Optimum pH dla pepsyny wynosi 1,5 – 3,5. Przy wzroście pH powyżej 5,0 pepsyna ulega inaktywacji. Denaturacja białek pokarmowych, odszczepienie od nich składników niebiałkowych. Proces ten ułatwia trawienie białek pokarmowych przez pepsynę i enzymy proteolityczne soku trzustkowego. Niszczenie flory bakteryjnej. Niskie pH soku żołądkowego (0,9 – 1,5) niszczy większość bakterii, które mogą dostać się do przewodu pokarmowego. Jest to jeden z mechanizmów odporności nieswoistej organizmu. Ułatwienie wchłaniania żelaza i wapnia. Kwas solny powoduje przejście żelaza na +2 stopień utlenienia. Żelazo w przewodzie pokarmowym jest wchłaniane tylko w postaci jonu żelazawego. Kwas solny uwalnia żelazo i wapń z połączeń z innymi związkami, prowadząc do powstania wolnego jonu mogącego ulec wchłonięciu w jelicie. Wydzielanie kwasu solnego Kwas solny jest wydzielany przez komórki okładzinowe do światła żołądka. Przy udziale anhydrazy węglanowej w komórce okładzinowej jest syntetyzowany kwas węglowy, z którego wskutek dysocjacji powstaje jon wodorowy i wodorowęglanowy. Jon wodorowy przy udziale błonowej H+/K+ ATP-azy jest wydzielony do światła żołądka, a jon wodorowęglanowy przechodzi do krwi wymieniając się z jonem chlorkowym, który następnie jednokierunkowo przechodzi do światła żołądka. Przejście jonu wodorowego z komórki okładzinowej do światła żołądka następuje wbrew gradientowi stężeń. Komórki okładzinowe mogą wydzielać kwas solny o stężeniu nawet 170 mmol/l, który mieszając się z innymi składnikami soku żołądkowego osiąga w nim stężenie 150 mmol/l. Przy wytworzeniu kwasu solnego przez komórkę okładzinową zachodzą następujące przesunięcia jonów i związków chemicznych wpływających na gospodarkę wodnoelektrolitową i kwasowo-zasadową (ryc. 1): 2 krew CO2 światło żołądka Komórka okładzinowa H2O CO2 anhydraza węglanowa HCO3 H2 CO 3 – HCO3– + H + H ATP – aza błonowa Cl– Cl– Rycina 1. Wydzielanie kwasu solnego przez komórkę okładzinową. Krew/komórka okładzinowa: pobranie dwutlenku węgla i wymiana jonu wodorowęglanowego na jon chlorkowy. Komórka okładzinowa/sok żołądkowy: wydzielenie jonu wodorowego i jonu chlorkowego. Utrata soku żołądkowego i zawartego w nim kwasu solnego występująca np. przy uporczywych wymiotach może prowadzić do zasadowicy hipochloremicznej. Towarzysząca temu utrata jonów potasowych obecnych w soku żołądkowym może być przyczyną hipokaliemii. Regulacja wydzielania soku żołądkowego Wydzielanie kwasu solnego przez komórki okładzinowe jest regulowane przez czynniki pobudzające i hamujące. Do czynników pobudzających należą: Gastryna. Jest produkowana przez komórki G. Jest hormonem heterogennym występującym w trzech formach: mała gastryna (17 aminokwasów), duża gastryna (34 aminokwasy) i bardzo duża gastryna (powyżej 34 aminokwasów), która przypuszczalnie jest pochodzenia pozażołądkowego. Acetylocholina. Jest uwalniana z zakończeń nerwu błędnego. Histamina. Komórki okładzinowe posiadają na swojej powierzchni receptor histaminowy H2. Rola histaminy w regulacji wydzielania żołądkowego nie jest dokładnie poznana, przypuszcza się, że może być mediatorem pośredniczącym w pobudzaniu komórki okładzinowej przez gastrynę i acetylocholinę lub agonistą (stymulatorem) komórki okładzinowej, a pobudzenie to jest niezależne od 3 połączenia acetylocholiny i gastryny z ich własnymi receptorami na powierzchni komórki okładzinowej. Cholecystokinina (CCK) i ceruleina. Są to enterohormony obkurczające pęcherzyk żółciowy. Wykazują także działanie pobudzające wydzielanie soku żołądkowego, jednakże znacznie słabsze niż gastryna, sięgające 20% pobudzenia gastrynowego. Bombezyna. Jest enterohormonem. Pobudza wydzielanie żołądkowe poprzez stymulację komórek G do uwalniania gastryny. Pokarm. Pobudza wydzielanie żołądkowe w dwóch mechanizmach: Chemicznie – zawarte w pokarmach aminokwasy, peptydy, kofeina, alkohol, jony wapnia pobudzają wydzielanie kwasu solnego. Mechanicznie – wypełnienie żołądka i jego rozciągnięcie pobudza wydzielanie soku żołądkowego. Oprócz wymienionych czynników fizjologicznych wydzielanie żołądkowe w warunkach testów klinicznych może być pobudzane przez: Histalog (Betazol) – izomer histaminy lepiej od niej tolerowany. Pentagastrynę – syntetyczny analog gastryny. Hipoglikemię poinsulinową. 2-dezoksy-D-glukozę (2-DG). Czynnikiem, który może pobudzać wydzielanie żołądkowe jest także adrenalina w dużych dawkach. Do czynników hamujących wydzielanie soku żołądkowego zaliczamy: Somatostatynę. Glukagon. Sekretynę. Wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP). Metody biochemiczne w diagnostyce chorób żołądka Badanie soku żołądkowego odgrywało istotną rolę w czasach kiedy badanie endoskopowe żołądka (gastroskopia, panendoskopia) nie było powszechnie stosowane. Wprowadzenie giętkich fiberoskopów (gastroskopów) umożliwiło dokładną ocenę śluzówki żołądka, uwidocznienie owrzodzeń i innych zmian w obrębie błony śluzowej. Ta metoda diagnostyczna pozwala również na pobranie wycinków błony śluzowej żołądka ze zmian patologicznych do badania histopatologicznego oraz z niezmienionej błony śluzowej w celu wykrycia obecności bakterii Helicobacter pylori. Obecnie najczęściej stosowanymi w diagnostyce chorób żołądka metodami biochemicznymi są testy służące do stwierdzenia obecności tej bakterii. Wykrywanie obecności Helicobacter pylori Helicobacter pylori jest spiralną bakterią, która u człowieka kolonizuje błonę śluzową żołądka. Częstość jej występowania u osób dorosłych sięga powyżej 70%. Bakteria ta wywiera szkodliwy wpływ na ochronną barierę śluzową i samą śluzówkę żołądka. Endotoksyny wydzielane przez Helicobacter pylori zaburzają wbudowywanie grup siarczanowych do glikoprotein śluzu. Wydzielana przez tę 4 bakterię fosfolipaza A rozkłada fosfolipidy, które obficie występują w ochronnej warstwie śluzu. Zmiany składu śluzu żołądkowego wywołane przez H. pylori powodują, że traci on swoje własności hydrofobowe i ma gorsze właściwości ochronne. Endotoksyny produkowane przez tę bakterię pobudzają błonę śluzową żołądka do wytwarzania pepsynogenu. Powstająca z niego pepsyna ma właściwości mukolityczne powodujące zmniejszenie grubości warstwy śluzu i zmniejszenie gradientu pH jego kolejnych warstw. Łącznie ze zmianami składu śluzu prowadzi to do większego narażenia błony śluzowej żołądka na szkodliwe działanie kwasu solnego obecnego w soku żołądkowym. Obecność H. pylori w żołądku zwiększa ryzyko rozwoju choroby wrzodowej dwunastnicy, zapalenia błony śluzowej żołądka, choroby wrzodowej żołądka. Zakażenie bakterią H. pylori ma również pewne znaczenie przy rozwoju niektórych nowotworów żołądka, a zwłaszcza chłoniaków. Ostatnio zwraca się również uwagę na rolę infekcji H. pylori w rozwoju innych chorób. Coraz częściej badania w kierunku infekcji tą bakterią są wykorzystywane w dermatologii przy diagnozowaniu przyczyn chorób skóry o typie pokrzywki i atopowego zapalenia skóry. Metody wykrywania obecności Helicobacter pylori w żołądku dzielą się na dwie grupy: Metody inwazyjne polegające na pobraniu w trakcie wykonywania gastroskopii wycinka błony śluzowej żołądka i jego dalszym badaniu przy pomocy: szybkiego testu urazowego, hodowli bakteryjnej (metoda mikrobiologiczna), wykrywania materiału genetycznego bakterii (PCR), stwierdzenia obecności spiralnych bakterii w badaniu histopatologicznym. Metody nieinwazyjne, które nie wymagają wykonania gastroskopii: testy oddechowe, metody immunologiczne (badanie surowicy lub kału). Test ureazowy H. pylori posiada enzym ureazę, który jest nieobecny w komórkach człowieka. Test ureazowy polega na stwierdzeniu obecności tego enzymu. Pobrany wycinek błony śluzowej żołądka umieszcza się na krążku bibuły i zwilża 2 - 3 kroplami wody destylowanej. Bibuła zawiera mocznik i wskaźnik barwny, który w przypadku alkalizacji środowiska zmienia barwę z żółtej na czerwono-różową. Jeśli jest obecna H. pylori, to pod wpływem ureazy zachodzi reakcja: (NH2)2CO + H2O 2 NH3 + CO2 W środowisku wodnym, a takie jest w krążku bibuły, zachodzi druga reakcja: NH3 + H2O HN4+ + OHktóra powoduje alkalizację środowiska i zmianę barwy wskaźnika (ryc. 2). 5 Rycina 2. Test ureazowy GUT plus. Testy oddechowe Polegają na podaniu pacjentowi drogą doustną mocznika znakowanego izotopem węgla C14 lub C13. Jeśli w żołądku jest obecna bakteria H. pylori, to następuje rozkład mocznika, a dwutlenek węgla ze znakowanym atomem węgla ulega wchłonięciu. We krwi powstaje z niego jon wodorowęglanowy. Dostając się do płuc przechodzi w dwutlenek węgla i jest wydychany (ryc. 3). Test oddechowy polega na stwierdzeniu w wydychanym powietrzu obecności izotopu węgla pochodzącego ze znakowanego mocznika. Do wykrycia promieniotwórczego izotopu C14 stosuje się licznik scyntylacyjny. Przy zastosowaniu niepromieniotwórczego izotopu węgla C13 mamy w pełni nieinwazyjny test oddechowy. Jego obecność w wydychnym powietrzu można stwierdzić wykorzystują metody: spektrometrii masowej, spektrometrii w podczerwienii, spektrometrii laserowej. 6 *C *CO *C=O *C - izotop wêgla + 2 H2 O Ureaza 2 NH3 + H 2O + 2 *CO 2 C lub 14C 13 Rycina 2. Schemat testu oddechowego Metody immunologiczne Testy serologiczne polegają na wykryciu obecności we krwi przeciwciał IgG skierowanych przeciwko antygenom H. pylori. Ich przydatność jest ograniczona ponieważ dodatni wynik tych testów świadczy o aktualnym lub przebytym zakażeniu H. pylori. Po wyleczeniu zakażenia (eradykacji H. pylori) przeciwciała utrzymują się przez okres od kilku miesięcy do nawet dwóch lat i w tym okresie dają dodatni wynik testu. Z tego powodu metody immunologiczne nie nadają się do oceny skuteczności leczenia zakażenia H. pylori. Obecność H. pylori można również wykrywać w kale (patrz Podrozdział: Badanie kału). Badanie soku żołądkowego Sok żołądkowy do badania pozyskuje się metodą zgłębnikowania polegającą na wprowadzeniu sondy do żołądka i odessaniu soku żołądkowego. Badanie kwaśności soku żołądkowego można wykonać metodami zgłębnikowymi lub bezzgłębnikowymi. 7 Ocena właściwości fizycznych soku żołądkowego Obecnie badanie właściwości fizycznych soku żołądkowego zupełnie straciło na znaczeniu ponieważ w trakcie badania endoskopowego można zobaczyć krwawienie w obrębie żołądka oraz ustalić i zlokalizować jego przyczynę. Można również wizualnie stwierdzić obecność refluksu, czyli zarzucania żółci do żołądka. Resztki pokarmu zalegające w żołądku także można zobaczyć w trakcie tego badania. Barwa. W warunkach fizjologicznych sok żołądkowy odessany na czczo jest wodnisty, jasny i opalizujący. Żółte podbarwienie świadczy o obecności żółci, czerwona barwa o obecności świeżej krwi, brunatna o obecności nadtrawionej krwi. Obecność resztek pokarmu stwierdza się gdy sok żołądkowy nie jest pobrany na czczo, lub gdy występuje opóźnienie pasażu treści pokarmowej z żołądka do dwunastnicy. Woń. Prawidłowo sok żołądkowy ma zapach zakwaszonego chleba. Woń zjełczałego tłuszczu świadczy o obecności krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (kwasu masłowego, kapronowego). Zapach gnilny stwierdza się przy zaleganiu pokarmów i ich bakteryjnym rozkładzie. Oznaczanie pH, kwasoty wolnej i całkowitej Prawidłowo pH soku żołądkowego wynosi 0,9 – 1,5. Kwas solny w soku żołądkowym występuje w postaci wolnej i związanej. Postać związana to połączenie HCl z białkami i fosforanami. Kwas solny wchodzi w reakcje z grupami aminowymi aminokwasów dając połączenia o typie R-NH3Cl, natomiast fosforany II-rzędowe przechodzą w I-rzędowe. Reakcje te prowadzą do powstania połączeń buforowych, z których kwas solny może łatwo się odszczepiać przy spadku kwasoty soku żołądkowego. Zbuforowanie części kwasu solnego produkowanego w dużym stężeniu przez komórki okładzinowe jest jednym z mechanizmów chroniących błonę śluzową żołądka przed uszkodzeniem. Kwasota całkowita jest sumą wolnego kwasu solnego, zbuforowanego kwasu solnego oraz grup –COOH białek i kwasów organicznych. Różnica między kwasotą całkowitą a kwasotą wolną wyraża siłę buforującą soku żołądkowego, która rośnie przy większej zawartości w nim białka. Do oznaczania kwasoty wolnej używa się wskaźnika, który w trakcie miareczkowania wodorotlenkiem sodowym zmienia barwę przy pH 3–4. Badanie wydzielania kwasu solnego – test Kay’a Badania stężenia kwasu solnego w pojedynczej porcji soku żołądkowego mają znikomą wartość diagnostyczną, a ich wyniki często są niepowtarzalne i nieporównywalne. Takie badanie wnosi niewiele informacji o czynności wydzielniczej żołądka. Wad tych nie posiada test Kay’a, w którym ściśle określono warunki pobierania soku żołądkowego. Test Kay’a służy do oceny czynności wydzielniczej żołądka w warunkach podstawowych i w warunkach maksymalnego pobudzenia wydzielania żołądkowego. W teście Kay’a oznaczamy trzy parametry. Pierwszy z nich to wydzielanie podstawowe BAO (ang. Basic acid output), które występuje gdy żołądek nie jest pobudzony do wydzielania ani pokarmem, ani innymi bodźcami. Druga oznaczana wartość to wydzielanie maksymalne MAO 8 (ang. Maximal acid output) zachodzące po pobudzeniu żołądka. Wartość MAO jest wprost proporcjonalna do ilości sprawnych funkcjonalnie komórek okładzinowych. Trzecim oznaczanym parametrem jest wydzielanie szczytowe PAO (ang. Peak acid output). Przygotowanie pacjenta do testu Kay’a. Pacjent powinien pozostawać na czczo przez 12 godzin przed wykonaniem testu, a przez co najmniej 48 godzin przed tym badaniem nie brać leków wpływających na czynność wydzielniczą żołądka. Wydzielanie żołądkowe wykazuje rytm dobowy osiągając swój szczyt nad ranem. Test Kay’a wykonuje się w godzinach porannych. Odsysa się treść żołądkową. Uzyskany sok żołądkowy zostaje odrzucony lub może być wykorzystany do innych badań. Po opróżnieniu żołądka z obecnego w nim soku żołądkowego rozpoczyna się badanie jego czynności wydzielniczej. Przez godzinę co 15 minut odsysa się sok żołądkowy. Uzyskane w ten sposób 4 frakcje soku żołądkowego służą do oznaczenia wydzielania podstawowego (BAO). Jest to ilość kwasu solnego wydzielonego w żołądku w ciągu 1 godziny (mmol/godz.). Po zebraniu ostatniej frakcji BAO podaje się środek pobudzający wydzielanie kwasu solnego. W tym celu można zastosować histaminę (chlorowodorek histaminy) domięśniowo w dawce 25 g/kg masy ciała, histalog domięśniowo w dawce 1500 g/kg masy ciała lub pentagastrynę we wlewie dożylnym w dawce 6 g/kg masy ciała. Najtańsza jest histamina, lecz z uwagi na pozażołądowe działania uboczne ma szereg przeciwwskazań (astma oskrzelowa, nadciśnienie tętnicze, niewydolność krążenia, uczulenia). Aby złagodzić działania uboczne histaminy, równocześnie z nią należy podać preparat antyhistaminowy, np. fenazolinę. Preparatem lepiej tolerowanym niż histamina jest histalog. Pentagastryna będąca małocząsteczkowym syntetycznym analogiem gastryny jest najlepiej tolerowana i nie ma przeciwwskazań do jej stosowania. Wadą tego preparatu jest jego wysoka cena. Po podaniu substancji pobudzającej wydzielanie żołądkowe przez następną godzinę (druga godzina testu) zbiera się oddzielnie co 15 minut 4 następne porcje soku żołądkowego. Posłużą one do oznaczenia MAO i wyliczenia PAO. Mierzy się objętość każdej 15-minutowej frakcji i miareczkuje ją 0,1 molowym roztworem wodorotlenku sodowego wobec czerwieni fenolowej, która zmienia barwę przy pH 7,4. Wyniki MAO podaje się również jako ilość milimoli kwasu solnego wydzielonego w czasie 1 godziny (mmol/h). Wylicza się PAO, które jest sumą dwóch najwyższych sąsiadujących frakcji MAO pomnożoną przez 2. Wartości PAO są zbliżone do wartości MAO. Interpretacja testu Wartości prawidłowe: BAO do 5 mmol/h, MAO 5 – 25 mmol/h. Bardzo małe wartości BAO i MAO świadczą o zaniku błony śluzowej żołądka. Wartości MAO powyżej 25 mmol/h spotyka się w chorobie wrzodowej dwunastnicy. Test Kay’a nie ma żadnej przydatności diagnostycznej w przypadku choroby wrzodowej żołądka i nie może służyć do jej rozpoznania. 9 Obecnie test Kay’a jest wykonywany bardzo rzadko. Stwierdzenie zaniku błony śluzowej żołądka powodujące bezkwaśność soku żołądkowego opiera się obecnie głównie na badaniu histopatologicznym wycinków śluzowej żołądka pobranych w trakcie badania endoskopowego. Diagnostyka choroby wrzodowej dwunastnicy jest obecnie oparta na badaniu endoskopowym. Test Kay’a zachował jednak pewne znaczenie przy diagnostyce jednego nowotworu, mianowicie guza wydzielającego gastrynę (gastrinoma). Patologia ta jest określana mianem zespołu ZollingeraEllisona. Dla tego zespołu charakterystyczne są wysokie wartości BAO i niewielki ich wzrost po pobudzeniu (MAO). Przy podejrzeniu tego zespołu pomocne bywa obliczenie stosunku BAO/MAO, który prawidłowo nie przekracza 0,43. W rozwiniętym zespole Zollingera-Ellisona stosunek BAO/MAO przekracza 0,6. Wartość BAO/MAO 0,43 – 0,6 nasuwa podejrzenie tej choroby. Przy ocenie wydzielania żołądkowego często używane są następujące pojęcia: Achylia gastrica – brak wydzielania kwasu solnego i enzymów żołądkowych, Achlorhydria – całkowita niezdolność wydzielania kwasu solnego (bezkwaśność), Hipochlorhydria – zmniejszone wydzielanie kwasu solnego (niskie wartości MAO), Hiperchlorhydria – zwiększone wydzielanie kwasu solnego (wysokie wartości MAO). Wykrywanie patologicznych składników soku żołądkowego Kwas mlekowy. Przy braku kwasu solnego w soku żołądkowym w żołądku może rozwinąć się flora bakteryjna, głównie pałeczki kwasu mlekowego (Lactobacillus). Bakterie te produkują z węglowodanów kwasy organiczne, głównie kwas mlekowy. Obecność kwasu mlekowego wykrywa się metodą Uffelmana, w której niebieski fenolan żelazowy reagując z kwasem mlekowym daje żółty mleczan żelazowy. Silne kwasy mineralne odbarwiają odczynnik Uffelmana i nie dają żółtego zabarwienia. Bilirubina. Bilirubina jest obecna w soku żołądkowym wtedy, kiedy dochodzi do refluksu (zarzucania) żółci z dwunastnicy do żołądka. Obecność bilirubiny w treści żołądkowej można wykrywać metodą Gmelina lub metodą Rosina. Pierwsza polega na utlenieniu bilirubiny za pomocą stężonego kwasu azotowego do zielono zabarwionej biliwerdyny. W metodzie Rosina bilirubina jest utleniana do zielonej biliwerdyny za pomocą roztworu jodu. Krew. W kwaśnym środowisku soku żołądkowego hemoglobina przechodzi w hematynę, która może tworzyć charakterystyczny obraz brunatnych grudek o wyglądzie fusów od kawy, gdy krwawienie jest obfite. Obecność krwi w soku żołądkowym wykrywa się próbą benzydynową (pseudoperoksydazową). Benzydyna pod wpływem 10 żelazoporfiryn wolnych i związanych z białkami zdenaturowanymi oraz nadtlenku wodoru utlenia się do błękitu benzydynowego. W trakcie tej próby można zaobserwować wydzielanie się pęcherzyków gazu. Świadczy to o zachodzeniu drugiej rekacji. Erytrocyty oprócz hemoglobiny uwalniają do soku żołądkowego również katalazę, która rozkłada nadtlenek wodoru powodując wydzielanie się tlenu widocznego jako pęcherzyki gazu. Metody bezzgłębnikowe badania kwaśności soku żołądkowego Metody bezzgłębnikowe polegają na doustnym podaniu związków, które przy obecności kwasu solnego w soku żołądkowym uwalniają barwnik, wchłaniany następnie w jelicie. Oznaczenie wydalania z moczem tego barwnika informuje o obecności lub braku kwasu solnego w soku żołądkowym. Badanie kału Kał może być materiałem biologicznym wykorzystywanym do następujących badań: 1. Wykrywania oebcnosci krwi utajonej. 2. Oceny stopnia strawienia pokarmów. 3. Badań enzymatycznych. 4. Wykrywania obecności Helicobacter pylori. 5. Badań mikrobiologicznych. 6. Badań parazytologicznych. Wykrywanie obecności krwi utajonej Obecność krwi w stolcu można stwierdzić wizualnie. W sytuacji, gdy ilość krwi w stolcu jest zbyt mała by można ją zobaczyć mówimy o obecności krwi utajonej w stolcu (ang. Fecal occult blood - FOB). Obecnosć krwi utajonej możemy wykryć metodami biochemicznymi. Pojawienie się krwi utajonej w stolcu jest spowodowane zmianami w obrębie dolnego odcinka przewodu pokarmowego. Krew dostająca się do górnego odcinka przewodu pokarmowego ulega strawieniu i z reguły nie jest wykrywana testami na obecność krwi utajonej w stolcu. Do najczęstszych przyczyn obecności krwi utajonej w stolcu należą: rak jelita grubego polipy jelita grubego żylaki odbytu zapalenie jelita 11 szczelina odbytu Wykrywanie obecności krwi utajonej w stolcu (ang. Fecal occult blond test – FOBT) można przeprowadzić przy pomocy testu gwajakowego lub testów immunochemicznych. Test gwajkowy jest podobny do próby benzydynowej. W obecności hemu i nadtlenku wodoru kwas gwajakowy jest utleniany, co powoduje powstanie niebieskiego zabarwienia. Wadą tego testu jest możliwość wystąpienia wyników fałszywie dodatnich spowodowanych obecnością niestrawionej mioglobiny pochodzącej z mięsa i produktów mięsnych oraz obecnością chlorofilu (też posiada pierścień porfirynowy) pochodzącego z zielonych warzyw i owoców. Testy immunochemiczne polegają na wykryciu w kale antygenów białek krwi. Przeciwciała stosowane w tych testach mogą być skierowane przeciwko ludzkiej albuminie, hemoglobinie lub globinie (składnik hemoglobiny). Żadne z tych białek w warunkach prawidłowych nie pojawia się w stolcu. Do testów immunochemicznych zaliczamy testy hemaglutynacyjne i immunochromatograficzne (zasady metod zostały opisane w rozdziale „Metody immunologiczne”). Testy immunochemiczne mają przewagę na testem gwajakowym ponieważ posiadają wyższą czułość analityczną (są w stanie wykryć mniejszą ilość krwi w stolcu) oraz, co jest bardzo istotne, spożywane pokarmy nie wpływają na ich wynik, co znacznie zmniejsza ryzyko uzyskania wyniku fałszywie dodatniego. Przygotowanie pacjenta do FOBT Przygotowanie pacjenta do badania stolca na obecność krwi utajonej zależy od tego, jaką metodą będzie wykonane badanie. Jeśli ma być zastosowany test gwajakowy, to przez minimum 3 dni poprzedzające badanie (tyle średnio trwa pasaż treści jelitowej u człowieka) pacjent musu nie spożywać mięsa, produktów mięsnych, ani zielonych warzyw i owoców, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich. Wykonanie badania przy zastosowaniu testu immunochemicznego nie wymaga takiego przygotowania. Wskazania do wykonania badania na obecność krwi utajonej w stolcu obejmują: niedokrwistość mikrocytarną, niedobarwliwą obniżone stężenie żelaza w osoczu i wzrost TIBC (obniżone wysycenie transferyny) badania przesiewowe w kierunku raka jelita grubego Interpretacja wyniku Ponieważ krwawienie powodujące obecność krwi utajonej w stolcu może nie mieć charakteru ciagłego, lecz pojawiać się okresowo, to o wyniku ujemnym FOBT możemy mówić dopiero wtedy, gdy w 3 kolejno oddanych próbkach stolca (w 12 sposób naturalny, a nie pobranych w trakcie badań diagnostycznych) nie stwierdzi się obecności krwi utajonej. W przypadku uzyskania wyniku dodatniego w którymś z oznaczeń nie ma konieczności wykonywania reszty z 3 zaplanowanych oznaczeń. Badania FOBT nie wykonuje się: w próbkach stolca pobranych w trakcie badania per rectum przy obecności klinicznych objawów krwawienia do swiatła przewodu pokarmowego Badanie kału na stopień strawienia pokarmów Badania te obejmują najczęściej oznaczanie zawartości tłuszczu oraz azotu w kale. Oznaczanie zawartości tłuszczu w kale. U osób zdrowych na zwykłej diecie z kałem wydala się 2-6 g tłuszczu w ciągu doby, co stanowi 10-25% suchej masy stolca. Gdy ilość ta rośnie powyżej 30% lub powyżej 7 g/dobę, to świadczy o zaburzeniach trawienia lub wchłaniania tłuszczy. Chorzy ze stolcami tłuszczowymi często wydalają powyżej 20 g tłuszczu w ciągu doby. Do najważniejszych przyczyn wzrostu wydalania tłuszczu z kałem należą: przewlekłe zapalenie trzustki, choroba Whipple’a, amyloidoza jelitowa, żółtaczka mechaniczna, marskość wątroby, stany po resekcji jelit. Warunkiem uzyskania wyniku mającego wartość diagnostyczną jest odpowiednie przygotowanie pacjenta - w diecie musi być obecny tłuszcz. Chory przez minimum 3 dni poprzedzające badanie powinien spożywać 100 g tłuszczu na dobę. Dieta o obniżonej zawartości tłuszczu powoduje zaniżenie wyników oznaczenia zawartości tłuszczu w stolcu. Biorąc pod uwage wahania ilości stolca wydalanego w ciągu 1 dnia niektórzy autorzy proponują aby oznaczenie zawartości tłuszczu w stolcu wykonywać w kale uzyskanym w trakcie jego 72-godzinnej zbiórki. Wyniki oznaczeń w tak uzyskanym kale mają większą wartość diagnostyczną. Oznaczenie zawartości azotu w kale. Badanie to jest wykonywane rzadko. Podyższona zawartość azotu w kale świadczy o upośledzonym trawieniu białek pokarmowych, upośledzonym wchłanianiu aminokwasów lub o utracie białka krwi lub osocza do światła jelita. Badanie wymaga stosowania przez pacjenta diety o standardowej zawartości białka. Dieta ubogo białkowa może spowodować zaniżenie wyniku oznaczenia zawartości azotu w kale. Obecnie do diagnostyki zaburzeń trawienia i wchłaniania tłuszczu zaleca się badanie kału metodą NIRA (ang. Near infrared reflactance analysis) – analiza współczynnika odbicia w bliskiej podczerwieni. Metoda ta pozwala na jednoczesną ocenę zawartości w kale tłuszczu, azotu i węglowodanów. Kał jako materiał do badań enzymatycznych W latach 90-tych XX wieku wprowadzono zestawy do oznaczeń aktywności elastazy trzustkowej w kale. Badanie to może być pomocne w diagnostyce pacjentów z niewydolnością części zewnątrzwydzielniczej trzustki. Wykrywanie infekcji Helicobacter pylori 13 Kał może stanowić materiał do badania na obecność bakterii H. pylori. Badanie wykonuje się metodami immunochemicznymi. Stwierdzenei obecności bakterii w kale przemawia za czynnym zakażeniem. To badanie może być przydatne w ocenie skuteczności eradykacji H. pylori. Trzeba jednak pamiętać, że na ten sposób wykrywania infekcji H. pylori mogą wpływać czynniki zakłócające takie jak krwawienie do światła przewodu pokarmowego, niektóre leki oraz możliwość reakcji krzyżowej z innymi szczepami Helicobacter z jelit. Badanie soku dwunastniczego Sok dwunastniczy uzyskany po wprowadzeniu do dwunastnicy specjalnego cewnika może służyć do testu sekretynowego lub do badania parazytologicznego na obecność żywych pasożytów Giardia lamblia (ogoniastek jelitowy). Test sekretynowy. Sekretyna powoduje wydzielanie soku trzustkowego bogatego w wodorowęglany. Po dożylnym podaniu sekretyny (1 U/ kg m.c.) szczytowe stężenie wodoroweglanówponizej 80 mmol/l wskazuje na niewydolność części zewnątrzwydzielniczej trzustki. Badania dotyczące trawienia i wchłanianie węglowodanów Zostały przedstawione w rozdziale „Węglowodany” 14 ĆWICZENIA PRAKTYCZNE ĆWICZENIE 1. Określanie pH soku żołądkowego za pomocą uniwersalnego papierka wskaźnikowego Zasada metody Uniwersalny papierek wskaźnikowy zmienia barwę w zależności od pH środowiska, z żółtej na czerwoną gdy jest ono kwaśne lub na niebieską w przypadku odczynu zasadowego. Porównanie natężenia barwy papierka wskaźnikowego ze skalą barwną informuje o wartości pH. Materiał badany sok żołądkowy prawidłowy sok żołądkowy nadkwaśny sok żołądkowy bezkwaśny Odczynniki uniwersalny papierek wskaźnikowy Wykonanie Na papierki wskaźnikowe nanieść po 1 kropli soku żołądkowego: nadkwaśnego, niedokwaśnego, prawidłowego. Po 30 sek. porównać barwę ze skalą i określić pH. W prawidłowym soku żołądkowym pH wynosi 1 - 2, papierek uniwersalny barwi się na czerwono. ĆWICZENIE 2. Oznaczanie kwasoty soku żołądkowego za pomocą czerwieni Kongo Zasada metody Czerwień Kongo zmienia barwę z czerwonej na niebieską tylko wtedy, gdy w soku żołądkowym jest obecny wolny kwas solny (pH 3,0). Pojawienie się barwy brunatnej świadczy o obecności kwasu solnego związanego i kwasu organicznego. Brak zmiany barwy czerwonej stwierdza się w przypadku braku kwasu solnego i kwasów organicznych w soku żołądkowym. Materiał badany sok żołądkowy prawidłowy sok żołądkowy bezkwaśny 15 Odczynniki 0,1% alkoholowy roztwór czerwieni Kongo Wykonanie Do 2 ml soku żołądkowego dodać 1 kroplę czerwieni Kongo i określić barwę. ĆWICZENIE 3. Wykrywanie kwasu mlekowego w soku żołądkowym Zasada metody Niebieski fenolan żelazowy (odczynnik Uffelmana) pod wpływem kwasu mlekowego przechodzi w żółty mleczan żelazowy. Materiał badany prawidłowy sok żołądkowy sok żołądkowy z kwasem mlekowym Odczynniki odczynnik Uffelmana Wykonanie Do 2 probówek oznaczonych P i M dodać po 2 ml: soku żołądkowego prawidłowego (probówka P) i soku żołądkowego zawierającego kwas mlekowy (probówka M). Następnie dodać po 1 ml odczynnika Uffelmana i obserwować zmianę barwy. ĆWICZENIE 4. Wykrywanie żółci w treśći żołądkowej metodą Gmelina Zasada metody Stężony kwas azotowy utlenia bilirubinę do zielonej biliwerdyny. W miejscu zetknięcia się obu roztworów pojawia się tęcza barw, z której barwa zielona jest charakterystyczna dla obecności bilirubiny. Materiał badany prawidłowy sok żołądkowy sok żołądkowy z dodatkiem żółci Odczynniki 16 stężony kwas azotowy Wykonanie Do probówki wlać 1 ml stężonego kwasu azotowego, na który nawarstwić ostrożnie 2 ml soku żołądkowego zawierającego żółć i obserwować pojawienie się barwy zielonej. ĆWICZENIE 5. Wykrywanie krwi w treści żołądkowej próbą benzydynową Zasada metody Krew dostająca się do żołądka szybko przechodzi w hematynę. Benzydyna w obecności żelazoporfiryn i nadtlenku wodoru ulega utlenieniu do błękitu benzydynowego. Jest to reakcja pseudoperoksydazowa. Materiał badany krew sok żołądkowy Odczynniki roztwór benzydyny 0,1 mol/l roztwór NaOH 3% roztwór nadtlenku wodoru (woda utleniona) papierki wskaźnikowe Wykonanie Do 2 ml soku żołądkowego dodać 1 kroplę krwi. Zaobserwować zmianę barwy krwi. Zobojętnić sok żołądkowy 0,1 mol/l NaOH wobec papierka wskaźnikowego. Następnie dodać 1 ml roztworu benzydyny i kilka kropli nadtlenku wodoru i obserwować zmianę barwy. ĆWICZENIE 6. Wykrywanie obecności Helicobacter pylori przy użyciu testu ureazowego Zasada testu: Krążek bibuły zawiera mocznik i wskaźnik barwny, który zmienia kolor przy alkalizacji środowiska. Jeśli w badanym wycinku błony śluzowej żołądka jest obecna bakteria H. pylori, to pod wpływem zawartej w niej ureazy następuje rozkład mocznika i alkalizacja środowiska, co stwierdzamy obserwując zmianę barwy krążka bibuły z żółtej na czerwoną lub różową. 17 Odczynniki szybki test urazowy wycinek błony śluzowej żołądka Wykonanie Po częściowym odklejeniu naklejki na krążek bibuły nanosi się 2-3 krople wody destylowanej, a następnie wycinek błony śluzowej żołądka pobrany w trakcie badania endoskopowego. Ponownie zakleja się test i opisuje nazwiskiem pacjenta i dokładną godzina umieszczenia w nim wycinka. Odczytu dokonuje się po 5 - 10 min., a następnie po 1 – 3 godz. porównując barwę krążka bibuły ze skalą barwną umieszczoną na teście. 18
