Część praktyczna - Wydział Biologii UW

Biologia molekularna
ćwiczenia
Zakład Wirusologii
Zakład Wirusologii
Instytut Mikrobiologii
p. 440 A
tel. 55-41-419 lub 55-41-421
Prowadzący:
ćwiczenie 1 dr Monika Radlińska
ćwiczenie 2 dr Agnieszka Kwiatek
ćwiczenie 3 dr Monika Radlińska, dr Monika Adamczyk-Popławska
ćwiczenie 4 dr Monika Adamczyk-Popławska
2
ĆWICZENIE 1
Enzymy restrykcyjne i rekombinacja DNA in vitro
Część teoretyczna
Zjawisko restrykcji – modyfikacji
Zjawisko restrykcji i modyfikacji (RM) zostało po raz pierwszy opisane w latach
pięćdziesiątych zeszłego wieku (Luria i Human, 1952; Bertani i Weigle, 1953). Zaobserwowano,
że namnażanie się bakteriofagów bywa w pewnym stopniu hamowane w zależności od rodzaju
szczepu bakteryjnego podlegającego infekcji. Biochemiczne podłoże i enzymy odpowiedzialne
za to zjawisko scharakteryzowali Arber i Dussoix (1962). W 1978 r. Werner Arber, Hamilton O.
Smith i Daniel Nathans otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyna za odkrycie enzymów
restrykcyjnych, które doprowadziło do rozkwitu technologii rekombinacji DNA.
MTaza
CH3
MTaza
CH3
Chromosom
prokariotyczny
REaza
REaza
CH3
MTaza
REaza
CH3
fragmenty
zdegradowanego
fagowego DNA
MTaza
Ryc. 1.1 Zjawisko restrykcji-modyfikacji.
W systemie RM wyróżnia się dwie aktywności enzymatyczne: endonukleolityczną
(endonukleaza restrykcyjna, ang. restriction endonuclease, REaza) oraz modyfikującą
(metylotransferaza DNA, metylaza DNA, ang. methyltransferase, MTaza), które rozpoznają w
DNA tę samą, specyficzną sekwencję. MTaza modyfikuje określoną zasadę w sekwencji
rozpoznawanej. Jeśli sekwencja docelowa nie jest zmetylowana, REaza przeprowadza cięcie
endonukleolityczne DNA (Ryc. 1.1 i 1.2).
Zmodyfikowany genomowy DNA, w komórce posiadającej system RM, nie jest
substratem dla REazy z tego systemu. Natomiast obcy DNA (np. infekującego faga) zostaje
rozpoznany przez REazę i strawiony. Mechanizm obronny komórek bakteryjnych przed obcym
DNA np. bakteriofagowym jest główną postulowaną funkcją systemów RM (Arber i Dussoix,
1962). Według innej hipotezy są one samolubnymi elementami genetycznymi, których
utrzymanie w genomie jest warunkiem przetrwania - rodzaj systemu „trucizna-odtrutka”
(Kobayashi, 2001). Sugeruje się też ich udział w utrzymywaniu tożsamości gatunkowej bakterii
(Jeltsch, 2003) oraz, to, że przez indukowanie rearanżacji genomowych przyczyniają się do
zróżnicowania genetycznego (Arber, 2000).
3
↓
5’ – G AATTC – 3’
3’ – CTTAA↑G – 5’
REaza
MTaza
CH3
CH3
Ryc. 1.2 Ta sama substratowa sekwencja w DNA dla endonukleazy restrykcyjnej i metylotransferazy DNA – różne
produkty reakcji przeprowadzanych przez te enzymy.
Ze względu na różnorodność i mnogość przedstawicieli REaz oraz towarzyszących im
MTaz, systemy RM zostały podzielone na cztery typy (Roberts i wsp., 2003; Tabela 1). Do Typu
I zaliczono kompleksy białkowe złożone z trzech rodzajów podjednostek: rozpoznających
specyficzną sekwencję (S), endonukleolitycznych (R) i modyfikacyjnych (M). Enzym do cięcia
wymaga obecności ATP. Sekwencja rozpoznawana jest asymetryczna i składa się z dwóch
krótkich odcinków zasad o określonej specyficzności, przedzielonych kilkoma niespecyficznymi
parami nukleotydów (np. EcoKI AACN6GTGC). Systemy Typu II stanowi najliczniejszą grupę,
składającą się najczęściej z dwóch oddzielnych białek: monomerycznej MTazy i dimerycznej
ENazy. Sekwencja docelowa jest krótka (4 do 8 par zasad) i często palindromiczna. Systemy
Typu III RM składając się z dwóch rodzajów podjednostek: modyfikacyjnej (Mod) i
endonukleolitycznej (Res). Miejsce rozpoznawane przez te enzymy, o długości 5-6 par zasad,
jest niepalindromiczne (do cięcia wymagane są jego dwie kopie), a także ATP. Natomiast do
Typu IV zaliczono REazy, które trawią tylko zmetylowany DNA.
Tabela 1. Najważniejsze charakterystyczne cechy różnych typów enzymów restrykcyjnych i
metylaz DNA.
Cecha
Podjednostki
strukturalne
Aktywność
enzymatyczna
Kofaktory
niezbędne do cięcia
Kofaktory
niezbędne do
metylacji DNA
Rozpoznawana
sekwencja
Miejsce cięcia
Zdolność do
translokacji DNA
Typ I
Trzy
Endonukleaza
Metylotransferaza
ATPaza
ATP
AdoMet
Mg2+
ATP
AdoMet
Mg2+
Asymetryczna
dwuczęściowa
Losowe, co
najmniej 1000 pz
od sekwencji
rozpoznawanej
Tak
Typ II
Dwie
Typ III
Dwie
Endonukleaza
Endonukleaza
Metylotransferaza Metylotransferaza
ATPaza
Mg2+
ATP
Mg2+
AdoMet
AdoMet
Mg2+
Zwykle
symetryczna
W obrębie, albo
tuż obok
sekwencji
rozpoznawanej
Nie
Asymetryczna
25-27 pz od
miejsca
rozpoznawanego
Tak
Typ IV
Dwie (lub jedna)
Endonukleaza
GTPaza
GTP
AdoMet
Mg2+
Dwuczęściowa
zmetylowana
W różnych
miejscach pomiędzy
zmodyfikowanymi
zasadami
Tak
4
Typ I i III charakteryzuje brak ścisłej kontroli nad położeniem miejsca cięcia względem
rozpoznawanej sekwencji. Natomiast enzymy Typu II przecinają DNA w sekwencji
rozpoznawanej albo blisko niej. Wynikiem trawienia określonej sekwencji DNA jest
powtarzalny zestaw fragmentów o przewidywanej długości. Właściwość ta spowodowała
szerokie wykorzystanie enzymów restrykcyjnych Typu II jako narzędzi w manipulacjach DNA.
Endonukleazy restrykcyjnye typu II
Obecnie w bazie danych REBASE (http://rebase.neb.com), katalogującej enzymy
restrykcyjne, metylotransferazy DNA i pokrewne białka, znajduje się ponad 3890 ENaz Typu II
rozpoznających 305 rodzajów specyficznych sekwencji (dane z 09.2012). Komercyjnie
dostępnych jest 241 różnych specyficzności REaz. Enzymy należące do tej grupy są najczęściej
homodimerami lub tetramerami, wymagającymi tylko jonów Mg2+ jako kofaktora. Nić DNA jest
cięta wewnątrz krótkiej sekwencji rozpoznawanej lub w pewnej stałej odległości od niej. Mimo
wspólnych cech, przedstawiciele tego typu są dość różnorodną grupą endonukleaz i dlatego
wprowadzono podział na podtypy, uwzględniając przy tym budowę białek, rodzaj sekwencji
docelowej, sposób cięcia DNA i inne cechy (Tabela 2). To samo białko może należeć do różnych
podtypów, gdyż nie wykluczają się one wzajemnie (Roberts i wsp., 2003).
Tabela 2. Podział enzymów restrykcyjnych Typu II na podtypy.
Podtyp
Opis
Przykładowe
enzymy
A
niepalindromiczna sekwencja rozpoznawana; często jeden gen
koduje REazę a dwa geny kodują MTazy
FokI, HphI
B
dwuniciowe cięcia po obu stronach sekwencji docelowej
AloI, HaeIV
C
obie domeny, endonukleolityczna i metylująca, w jednym
polipeptydzie
GsuI, HaeIV
E
do cięcia potrzebne dwie kopie sekwencji docelowej, jedna cięta,
druga działa jako efektor allosteryczny
FokI, Sau3AI
F
interakcja z dwiema kopiami sekwencji rozpoznawanej i obie cięte
BspMI, Cfr10I
G
obie domeny, endonukleolityczna i metylująca, w jednym
polipeptydzie; AdoMet działa stymulująco na aktywność
AloI, Eco57I
H
podobna struktura genów do Typu I
AhdI, BcgI
M
sekwencja rozpoznawana cięta gdy zmetylowana
BisI, DpnI
P
palindromiczna sekwencja rozpoznawana
EcoRI, NgoPII
S
cięcie poza niepalindromiczną sekwencją rozpoznawaną
FokI, Eco57MI
T
heterodimery
Bpu10I, MlyI
Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych: stosowane są literowe skróty (np. HindIII, EcoRI).
Pierwsza litera oznacza rodzaj bakterii, z której wyizolowano enzym, druga i trzecia - gatunek, a
kolejna z nich pochodzi od szczepu lub typu bakterii. Następujące po niej cyfry rzymskie
odpowiadają kolejnym enzymom wyizolowanym z określonego szczepu.
HindIII - Haemophilus influenzae Rd
Mph1103I - Moraxella phenylpyruvica RFL1103
Izoschizomery – enzymy restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające tę samą
sekwencję w DNA i wprowadzające identyczny typ cięcia.
Przykład: HaeIII, BsuRI, BshFI, PhoI, BsnI - GG↓CC
CC↑GG
5
Neoschizomery - restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające identyczną sekwencję
w DNA, ale wprowadzające odmienny typ cięcia.
Przykład:
SmaI
Cfr9I
Acc65I
KpnI
CCC↓GGG
C↓CCGGG
G↓GTACC
GGTAC↓C
GGG↑CCC
GGGCC↑C
CCATG↑G
C↑CATGG
Jedna jednostka enzymu restrykcyjnego oznacza taką jego ilość, która katalizuje kompletną
hydrolizę wiązań w markerowego DNA o masie 1g w czasie 1 godziny i w temperaturze i
warunkach właściwych dla danego enzymu.
REazy pozostawiają w rozciętej cząsteczce DNA dwa rodzaje końców (Ryc. 1.3):
 tępe końce - obie nici rozcięte są naprzeciwko siebie - nukleotydy znajdujące się na
końcach są sparowane z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnej nici;
5’-GG↓CC-3’
3’-CC↑GG-5’
5’-GG–3’
3’-CC–5’
5’-CC-3’
3’-GG-5’
 lepkie końce - 3` lub 5` - jednoniciowe odcinki występujące na obu końcach przeciętej
niesymetrycznie cząsteczki (Rys. 3).
HindIII
Mph1103I
A↓AGCTT
TTCGA↑A
ATGCA↓T
T↑ACGTA
5’-A–3’
3’-TTCGA-5’
5’-AGCTT-3’
3’-A-5’
5’-ATGCA
3’-T
T-3’
ACGTA–5’
Ryc. 1.3 Enzym restrykcyjny HindIII generuje jednoniciowe wystające (lepkie) końce 5’ a
enzym Mph1103I jednoniciowe wystające (lepkie) końce 3’.
Rodzaj pozostawianych końców ma znaczenie przy manipulacjach przeprowadzanych przy
klonowaniu:
 warunkuje połączenie końców zgodnych (kompatybilnych)
 wymusza konieczność przekształcenia lepkich końców w tępe, np. przez zastosowaniu
polimerazy DNA
Sekwencja palindromiczna – sekwencja czytana w kierunku od 5’ do 3’ końca jest taka sama
jak na nici komplementarnej.
5’- AAGCTT -3’
3’- TTCGAA -5’
Czynniki wpływające na aktywność enzymu restrykcyjnego
1. Bakterie, z których izolowane są enzymy restrykcyjne bytują w różnych, często
ekstremalnych, środowiskach. Stąd wynikają różne preferencje warunków reakcji związane
np. z temperaturą inkubacji. Inne elementy, które różnią bufory wykorzystywane do
przeprowadzenia reakcji z danym enzymem to: siła jonowa (stężenie soli), główny kation
(sód lub potas) i pH. Każdy enzym restrykcyjny wymaga obecności kofaktora Mg2+!
2. Czasami w buforach do reakcji dostarczane są dodatkowe związki chemiczne, które
wspomagają działanie niektórych enzymów restrykcyjnych - np. detergent (Triton-X-100 do
6
redukcji napięcia powierzchniowego), BSA (ang. bovine serum albumin, albumina z grasicy
cielęcej) zwiększa ogólne stężenie białka.
3. Obecność zanieczyszczeń pozostałych po preparatyce izolacji DNA (EDTA, fenol, etanol,
proteinazy itd.) może inaktywować enzym restrykcyjny.
4. W wyniku zastosowania nieodpowiednich warunków reakcji może pojawić się
niespecyficzna aktywność enzymu - tzw. star activity. Czynniki sprzyjające:
 zbyt długi czas reakcji (zmiana stężenia buforu w wyniku odparowywania wody z
mieszaniny reakcyjnej)
 nieoptymalna temperatura reakcji,
 zbyt wysokie stężenie enzymu,
 nieoptymalne stężenie soli,
 nieoptymalne pH,
 obecność w mieszaninie reakcyjnej jonów Mn2+, zamiast Mg2+ (jony Mg2+ są niezbędne
dla aktywności endonukleaz);
 obecność rozpuszczalników organicznych,
 zbyt wysokie stężenie glicerolu (enzymy przechowuje się w temp -20C w 50% glicerolu
jednak, aby enzym działał prawidłowo końcowe stężenie glicerolu nie powinno
przekraczać 5%).
Endonukleazy restrykcyjne są wrażliwe na obecność zmetylowanej zasady w obrębie
sekwencji DNA przez nie rozpoznawanej, co wyraża się nie rozpoznaniem jako substratu
sekwencji docelowej. Zmetylowane zasady występujące w DNA to: N6-metyloadenina, N6mA,
m6A), N4-metylocytozyna (N4mC, m4C) i 5-metylocytozyna (5mC, m5C) (Ryc. 1.4)
AdoMet
adenina
N6-metyloadenina
cytozyna
N4-metylocytozyna
5mC -metylocytozyna
Ryc. 1.4 Zmetylowane zasady w DNA oraz kofaktor grup metylowych S-adenozylometionina
(AdoMet).
7
Nieomal wszystkie szczepy Escherichia coli używane w laboratoriach zawierają, co najmniej
dwie metylotransferazy DNA:
Dam metylazę (M.Dam), która dodaje grupę metylową do adeniny w sekwencji GATC
(produkt Gm6ATC)
Dcm metylazę (M.Dcm), która modyfikuje wewnętrzną cytozynę w sekwencji CCWGG (W=A
lub T) CC(A/T)GG do Cm5C(A/T)GG
Praktyczną konsekwencją tego zjawiska jest fakt, że wiele endonukleaz nie będzie trawić DNA
zmetylowanego przez w/w metylazy DNA. Poniżej kilka przykładów.
Metylaza Dam E.coli, modyfikując w DNA adeninę w sekwencjach GATC, czyni je nie
wrażliwymi na trawienie enzymem MboI, natomiast tak zmetylowany DNA pozostanie wciąż
substratem dla enzymu Sau3AI.
Metylaza Dcm E.coli, modyfikując w DNA drugą cytozynę w sekwencjach CCWGG, czyni je
nie wrażliwymi na trawienie enzymem EcoRII, natomiast tak zmetylowany DNA pozostanie
wciąż substratem dla enzymu MvaI.
Miejsca rozpoznawane przez niektóre enzymy mogą zawierać się lub pokrywać się częściowo z
sekwencją GATC np TCGA (TaqI), ATCGA (ClaI). Gdy sekwencje te zostaną zmetylowane
przez M.Dam, staną się niewrażliwe na trawienie w/w enzymami. Podobna sytuacja ma miejsce
w przypadku nakładania się sekwencji docelowej danego enzymu z sekwencją CCWGG
modyfikowaną przez M.Dcm np AGGCCT (StuI); TGGCCA (MscI). Gdy sekwencje te zostaną
zmetylowane przez M.Dcm, staną się niewrażliwe na trawienie w/w enzymami.
nnTGATCAnn
nnACTAGTnn
nnAGGCCTggnn
nnTCCGGAccnn
nnTCGAtcnn
nnAGCTagnn
nnATCGATcnn
nnTAGCTAgnn
nnTGGCCAggnn
nnACCGGTccnn
Jeśli (nieoczekiwanie) DNA nie został pocięty przez użyty przez Ciebie enzym restrykcyjny
lub trawienie jest tylko częściowe, sprawdź, czy ten enzym nie jest wrażliwy na metylację!
8
Inaktywacja enzymów restrykcyjnych po reakcji enzymatycznej
Nieodwracalna:
 inaktywacja termiczna (zwykle w temperaturze 65C lub 80C);
 denaturacja białek poprzez dodanie mieszaniny fenol:chloroform lub każdego z nich
oddzielnie (po odbiałczeniu preparatu należy poddać go precypitacji);
 denaturacja białek poprzez dodanie HCl
Odwracalna:
 dodanie EDTA do stężenia końcowego 12,5 mM (następuje wymiareczkowanie jonów
Mg2+)
Połączenie fragmentów DNA w reakcja ligacji
Ligacja jest przeprowadzana przez enzymy ligazy, które łączą dwa fragmenty DNA poprzez
wytworzenie wiązania kowalencyjnego - fosfodiestrowego między końcem hydroksylowym 3'
jednego nukleotydu a końcem 5' z grupą fosforanową drugiego nukleotydu przy wykorzystaniu
energii z hydrolizy ATP (adenozynotrifosforanu). np ligaza faga T4 lub NAD+ np ligaza E.coli.
Dezaktywację ligazy przeprowadza się w temperaturze 65oC przez 20 minut.
Analiza zrekombinowaneo DNA - elektroforeza
Elektroforeza – jest techniką, w której wymusza się ruch cząsteczek za pomocą pola
elektrycznego. W przypadku DNA służy do identyfikacji, rozdziału i izolacji.
Cząsteczki kwasów nukleinowych posiadają ładunek negatywny wynikający z ich szkieletu
fosforanowego i migrują w kierunku anody (+).
Agaroza - polisacharyd będący polimerem pochodnych galaktozy otrzymywany z glonów.
Agaroza zawieszona w wodzie w temperaturze pokojowej tworzy koloid - żel. Służy do
rozdziału nawet bardzo dużych cząsteczek, ale posiada relatywnie małą rozdzielczość. Typowe
stężenia do rozdziału DNA to 0,5-2%. W standardowych warunkach poprzez użycie różnych
stężeń agarozy mogą być rozdzielone fragmenty DNA między 50 a 20000 pz (Tabela 3).
Tabela 3. Zależność pomiędzy stężeniem żelu agarozowego a zakresem długości rozdzielanego
liniowego DNA.
Stężenie agarozy (%)
Zakres długości rozdzielanego liniowego DNA (kpz)
0,3
5 - 60
0,6
1 - 20
0,7
0,8 - 10
0,9
0,5 - 7
1,2
0,4 - 6
1,5
0,2 - 3
2,0
0,1 - 2
Elektroforeza w żelach agarozowych prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a
rozdział elektroforetyczny prowadzony jest w buforze:
TBE1 (90 mM Tris-base, 90 mM kwas borowy, 2 mM EDTA, pH 8) lub
TAE1 (40 mM Tris-base, 40 mM lodowy kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 8.
Akryloamid - polimer z grupy poliakrylanów otrzymywany przez polimeryzację akryloamidu.
Ma niską zdolność rozdziału (fragmenty DNA do ok. 500 pz), ale bardzo wysoką rozdzielczość.
Do uwidaczniania DNA po lub w trakcie elektroforezy stosowany jest rutynowo bromek
etydyny (EtBr), który interkaluje pomiędzy sąsiednie pary dwuniciowego DNA (powinowactwo
EtBr do jednoniciowego DNA jest znacznie słabsze). Obecność związku interkalującego w żelu
agarozowym zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną DNA o około 15%. EtBr to bardzo silny
9
mutagen prawdopodobnie także karcynogen i teratogen! Dzięki właściwościom
fluorescencyjnym EtBr możliwa jest wizualizacja DNA w świetle UV (300 nm). Innym
odczynnikiem stosowanym do wizualizacji DNA jest np. SYBR Green, którego czułość jest 25
większa niż EtBr.
Z reguły nakładając próbkę DNA na żel agarozowy mieszamy ją uprzednio z tzw.
barwnikiem do nakładania na żel, lub krótko barwnikiem (ang. loading dye). Przyczyn jego
użycia jest kilka:
 próbka DNA, która ma kolor jest wygodna w nakładaniu (łatwość wizualizacji),
 glicerol (lub sacharoza, ficoll 400) będący składnikiem tego barwnika zwiększa gęstość
próbki i zapewnia, że znajdzie się ona na dnie dołka,
 negatywnie naładowany barwnik migruje przez żel w tym samym kierunku co DNA i
stąd ułatwia śledzenie postępu rozdziału elektroforetycznego (Tabela 4).
Najpopularniejsze barwniki:
 błękit bromofenolowy (ang. bromophenol blue)
 cyjanian ksylenu (ang. xylene cyanol)
 orange G
Różnią się kolorem, tempem migracji w danym żelu (stężenie agarozy, rodzaj buforu).
Tabela 4. Przykładowe „tempo” migracji w żelu z buforem1TAE.
Stężenie agarozy %
Xylene cyanol
0,3
24800
0,5
11000
0,75
10200
1
6100
1,25
3560
1,5
2800
1,75
1800
2
1300
Bromophenol blue
2900
1650
1000
500
370
300
200
70
Literatura:
Arber W. Genetic variation: molecular mechanisms and impact on microbial evolution. FEMS Microbiol Rev. 2000.
24:1-7
Arber W, Dussoix D. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. I. Host controlled modification of
bacteriophage lambda. J Mol Biol. 1962. 5:18-36
Bertani G, Weigle JJ. Host controlled variation in bacterial viruses. J Bacteriol. 1953. 65:113-21
Ishikawa, K., Fukuda, E., Kobayashi, I. Conflicts targeting epigenetic systems and their resolution by cell death:
novel concepts for methyl-specific and other restriction systems. 2010. DNA Res. 17: 325-342
Jeltsch A. Maintenance of species identity and controlling speciation of bacteria: a new function for
restriction/modification systems? Gene. 2003. 317:3-6
Luria SE, Human ML. A nonhereditary, host-induced variation of bacterial viruses. J Bacteriol. 1952. 64:557-69
Kobayashi I.Behavior of restriction-modification systems as selfish mobile elements and their impact on genome
evolution. Nucleic Acids Res. 2001. 29:3742-56
Orlowski, J., Bujnicki, J.M. Structural and evolutionary classification of Type II restriction enzymes based on
theoretical and experimental analyses. 2008. Nucleic Acids Res. 36: 3552-3569
Roberts RJ et. al. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their
genes. Nucleic Acids Res. 2003. 31:1805-12
10
Część eksperymentalna
Materiały:
 DNA faga  (stężenie 0,3 g/l)
 enzymy restrykcyjne HindIII (10 U/l), Mph1103I (10 U/l)
 bufor do trawienia enzymami restrykcyjnymi (10  stężony): 10 mM TrisCl (pH 8,5 w
37C), 10 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1mg/ml BSA
 bufor TBE (10  stężony): 1M Tris, 0,9 M kwas borowy, 0,01 M EDTA
 bufor do nakładania na żel (6  stężony): 15% glicerol, 0,25% błękit bromofenolowy,
0,25% xylene cyanol FF
 bromek etydyny 10 mg/ml
 ATP 10 mM.
Wykonanie:
Mapę restrykcyjną faga  z zaznaczonymi pozycjami miejsc dla enzymów Mph1103I oraz
HindIII prezentuje Ryc. 1.5. Kolejne etapy prowadzonego eksperymentu zostały przedstawione
w formie schematu (Ryc. 1.6).
1. Nastawienie trawienia DNA faga  enzymem HindIII
Wykonanie: zmieszać 12,5 l mieszaniny H (zawiera bufor i enzym HindIII) z 12,5 l
mieszaniny 1 (zawiera DNA faga ). Inkubacja w temperaturze 37C, 10 min.
Skład mieszaniny reakcyjnej (trawienie enzymem HindIII):
 2,5 l buforu do trawienia
 2,5 l (0,9 g) DNA faga
 19,5 l H2O
 0,5 l enzymu restrykcyjnego HindIII
2. Nastawienie trawienia DNA faga  enzymem Mph1103I
Wykonanie: zmieszać 5l mieszaniny M (zawiera bufor i enzym Mph1103I) z 5l mieszaniny 2
(zawiera DNA faga ). Inkubacja w temperaturze 37C, 40 min.
Skład mieszaniny reakcyjnej (trawienie enzymem Mph1103I):
 1 l buforu do trawienia
 0,5 l (0,15 g) DNA faga 
 8,3 l H2O
 0,2 l enzymu restrykcyjnego Mph1103I
3. Inaktywacja termiczna enzymu restrykcyjnego HindIII
Inkubacja próbki w temperaturze 65C, 20 min.
4. Przygotowanie reakcji ligacji
 pobrać 20 l pociętego enzymem HindIII DNA faga  (4/5 reakcji trawienia z pkt.1)
 dodać 10 l mieszaniny ligacyjnej
Reakcję inkubować w temperaturze pokojowej 15 min.
Skład mieszaniny ligacyjnej: bufor do trawienia – 1 l, 10 mM ATP - 1 l, H2O – 7,7 l,
ligaza – 0,3 l.
11
5. Inaktywacja termiczna ligazy
Inkubacja próbek w temperaturze 65C, 20 min.
6. Trawienie mieszaniny ligacyjnej (z pkt. 4) enzymem restrykcyjnym HindIII i Mph1103I
(oddzielnie).
Wykonanie:
 zmieszać 10 l reakcji ligacji z pk.4 z 5l mieszaniny z enzymem HindIII
 zmieszać 10 l reakcji ligacji z pk.4 z 5l mieszaniny z enzymem Mph1103I
Inkubacja próbek w temperaturze 37oC, 10 min.
Skład mieszaniny reakcyjnej:
 10 l reakcji ligacji
 0,5 l buforu do trawienia
 4,2 l H2O
 0,3 l enzymu restrykcyjnego HindIII lub Mph1103I
7. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym
 przygotowanie żelu agarozowego (0,7% w buforze 1  TBE)
 przygotowanie próbek DNA do naniesienia na żel (pobrać 10 l mieszaniny reakcyjnej i
dodać 2 l barwnika; nanieść na żel)
 rozwijać elektroforezę przez 1 h, a następnie barwić żel w roztworze bromku etydyny
 wizualizacja żelu w świetle UV (dł. fal 300 nm)
Próbki na żel:
N.C = Nie trawiony DNA faga 
L = Próbka z ligacją (zligowane fragmenty DNA faga  po cięciu enzymem HindIII)
LH = HindIII  lig = Próbka z ligacją strawiona enzymem HindIII
H = HindIII  = Próbka strawionego DNA faga  enzymem HindIII (z pkt. 1)
M = Mph1103I  = Próbka strawionego DNA faga  enzymem Mph1103I (z pkt. 1)
LM = Mph1103I  lig = Próbka z ligacją strawiona enzymem Mph1103I
Ryc. 1.5 Mapa restrykcyjna faga  z zaznaczonymi pozycjami miejsc dla enzymów Mph1103I
oraz HindIII.
12
Trawienie enzymem Mph1103I
10 μl
M
Trawienie DNA enzymem HindIII
25 μl
Dezaktywacja termiczna
65oC 20 min
5 μl
zachować
20 μl
+10 μl
=30 μl
H
10 μl
zachować
L
Ligacja
Dezaktywacja termiczna
65oC 20 min
20 μl
10 μl
+5 μl HindIII
nc
L
H LH
m
M LM
LH
10 μl
+5 μl Mph1103
LM
Próbki DNA na żel
Ryc. 1.6 Schemat doświadczeń przeprowadzanych w trakcie ćwiczenia 1. m - marker wielkości;
nc - nie cięty DNA faga ; L – produkty ligacji fragmentów DNA po cięciu HindIII; H - DNA faga 
strawiony enzymem HindIII; LH - produkty ligacji fragmentów DNA (po cięciu HindIII) strawione
enzymem HindIII; M - DNA faga  strawiony enzymem Mph1103I; LM - produkty ligacji
fragmentów DNA (po cięciu HindIII) strawione enzymem Mph1103I.
13
N.C
L.
HindIII
H LigH
NdeI
M 
Lig
BamHI
Eco130I

Lig

Lig
BglII
MphI1103I

Lig

Lig
Ryc. 1.7 Obraz rozdziału DNA w żelu agarozowym 0,7%.
N.C – nie cięty DNA faga ; L – produkty ligacji fragmentów DNA po cięciu HindIII;
 - DNA faga  strawiony określonym enzymem (nazwa użytego enzymu znajduje się nad
symbolem ); Lig - produkty ligacji fragmentów DNA po cięciu HindIII (patrz tor L), które
strawiono określonym enzymem (nazwa użytego enzymu znajduje się nad symbolem ).
Zwróć uwagę, że wzór restrykcyjny zrekombinowanego DNA faga  (tory L) jest inny niż
wzór restrykcyjny natywnych cząsteczek DNA faga . (tory ). Wyjątkiem jest trawienie
enzymem HindIII (tor LigH), który wygenerował substratowe fragmenty restrykcyjne do
ligacji (tor H).
M – marker wielkości
14
Przygotowanie do Ćwiczenia 2
1. Nastawienie trawienie DNA wektora pUC19
Wykonanie: zmieszać 10 l mieszaniny HindIII_pUC (zawiera bufor i enzym HindIII) z 10 l
mieszaniny pUC (zawiera DNA wektora pUC19). Inkubacja w temperaturze 37C, 60 min.
Skład mieszaniny reakcyjnej (objętość końcowa 20 l):
 2 l buforu
 1 l DNA pUC19 (stężenie 50 ng/l)
 0,2 l enzymu HindIII
 16,8 l H2O
2. Nastawienie trawienia DNA bakteriofaga 
Wykonanie: zmieszać 10 l mieszaniny HindIII_ (zawiera bufor i enzym HindIII) z 10 l
mieszaniny  (zawiera DNA faga ). Inkubacja w temperaturze 37C, 60 min.
Skład mieszaniny reakcyjnej (objętość końcowa 20 l):
 1 l buforu
 2 l DNA faga  (stężenie 0,3 g/l)
 0,3 l enzymu HindIII
 16,8 l H2O
15
ĆWICZENIE 2
Enzymy służące do modyfikacji DNA
Część teoretyczna
Obecnie stosuje się wiele różnorodnych, komercyjnie dostępnych enzymów służących do
modyfikacji i rekombinacji DNA. Są to m.in.: enzymy restrykcyjne (ćwiczenie 1), alkaliczna
fosfataza (AP, ang. alkaline phosphatase), kinaza polinukleotydowa, ligaza DNA, polimeraza
DNA I, fragment Klenowa, nukleaza S1, odwrotna transkryptaza, terminalna transferaza, RNaza,
DNaza, egzonukleazy (I, III), endonukleazy (IV, V), polimeraza DNA (Taq, Pfu),
topoizomeraza.
Alkaliczna fosfataza (EC 3.1.3.1) jest hydrolitycznym enzymem odpowiedzialnym za
usuwanie reszt 5’ fosforanowych z DNA, RNA oraz nukleotydów. Wszystkie alkaliczne
fosfatazy są metaloenzymami (Zn(II)). Proces usuwania grup fosforanowych nazywany jest
defosforylacją i przebiega z wytworzeniem produktu pośredniego zawierającego ufosforylowaną
serynę. Enzym ten wykazuje najwyższą aktywność w środowisku alkalicznym – stąd jego
nazwa. Możemy wyróżnić kilka rodzajów alkalicznej fosfatazy, pochodzących z różnych źródeł,
które odróżnia między innymi możliwość inaktywacji:
 bakteryjna alkaliczna fosfataza (BAP – bacterial alkaline phosphatase) – wykazuje
najwyższą aktywność i jest najbardziej trwała (najtrudniej ją inaktywować po
zakończeniu reakcji defosforylacji). BAP jest wydzielana w postaci monomeru
(Mr = 47 kDa) do przestrzeni peryplazmatycznej Escherichia coli, gdzie dimeryzuje i
staje się katalitycznie aktywna. W obojętnym lub alkalicznym pH, dimer BAP zawiera
do 6 jonów Zn2+, z których dwa są niezbędne dla aktywności enzymu. Tylko jedno z
dwóch miejsc katalitycznych dimeru jest aktywne przy niskim stężeniu sztucznego
substratu, podczas gdy oba stają się aktywne przy wysokim stężeniu.
 alkaliczna fosfataza z jelita cielęcego (CIAP - calf intestinal alkaline phosphatase) –
najczęściej używana w laboratoriach biologii molekularnej. Wykazuje niewiele niższą
aktywność w stosunku do BAP, a można ją efektywnie inaktywować termicznie lub
poprzez trawienie proteolityczne. CIAP jest glikoproteiną zbudowaną z dwóch 514aminokwasowych monomerów. Aktywność enzymu zależy od stężenia jonów Mg2+ i
Zn2+. Zn2+ wiąże się w centrum katalitycznym i jest wymagany do aktywności
katalitycznej. Mg2+ wiąże się do różnych miejsc enzymu i jest allosterycznym
aktywatorem.
 alkaliczna fosfataza z krewetek (SAP - shrimp alkaline phosphatase) – izolowana z
krewetek Pandalus borealis, jest stosunkowo łatwa do inaktywacji termicznej.
Przy manipulacjach DNA alkaliczna fosfataza używana jest głównie do:
 usuwania grupy 5´fosforanowej z plazmidów i wektorów bakteriofagowych, które
uprzednio zostały strawione enzymami restrykcyjnymi (Ryc. 2.1). Zapobiega to
ponownej cyrkularyzacji wektora, a tym samym wydajność klonowania jest większa
(Ryc. 2.2).
 usuwania grupy 5´fosforanowej z fragmentów DNA poprzedzającego radioaktywne
znakowanie 32P (przygotowanie DNA do radioaktywnego znakowania w reakcji z
wykorzystaniem polinukleotydowej kinazy faga T4) (Ryc. 2.1).
 usuwania grupy 5´fosforanowej z RNA, rNTPs i dNTPs.
 jako enzym reporterowy w nieradioaktywnych systemach do wykrywania i lokalizacji
kwasów nukleinowych i białek. AP jest skoniugowana z ligandem, który specyficznie
oddziałuje z cząsteczką docelową.
16
(A)
(B)
(C) 5’ pDNA lub 5’pRNA
alkaliczna fosfataza
5’ OHDNA lub 5’OHRNA
Ryc. 2.1 Usuwanie grupy 5´fosforanowej DNA/RNA. (A) struktura nukleotydu, zaznaczono
usuwaną grupę fosforanową; (B) i (C) reakcja defosforylacji.
wektor nie poddany działaniu
alkalicznej fosfatazy może ulegać
ponownej cyrkularyzacji, co
prowadzi do otrzymania dużej
ilości „pustych” wektorów
3’ OH
defosforylowany wektor nie może
ulec cyrkularyzacji, bez insertu
5’ P
3’ OH
3’ OH
5’ P
3’ OH
Ryc. 2.2 Schemat klonowania insertu (powstałego po trawieniu enzymem restrykcyjnym) do
defosforylowanego wektora.
17
Kinaza polinukleotydowa bakteriofaga T4 (T4 PNK) katalizuje przeniesienie -fosforanu z
ATP (Ryc. 4.3) na (patrz struktura nukleotydu po defosforylacji) koniec 5’ OH jedno- lub dwuniciowego DNA, RNA lub oligonukleotydów.



Ryc. 2.3 Struktura ATP (ang. adenosine triphosphate) i ADP (ang. adenosine diphosphate).
Aktywność T4 PNK wykorzystywana jest głównie w dwóch typach reakcji: reakcji
podstawienia (ang. forward reaction) i reakcji wymiany (ang. exchange reaction) (Ryc. 2.4).
W reakcji podstawienia -fosforan przenoszony jest z ATP na DNA/RNA. Docelowy nukleotyd
nie posiada reszty fosforanowej na końcu 5’ (została ona usunięta w reakcji defosforylacji lub w
takiej postaci została zsyntetyzowana chemicznie). Reakcja ta jest odwracalna. W reakcji
wymiany, nadmiar ADP powoduje, że T4 PNK najpierw przenosi 5’-fosforan z
ufosforylowanego DNA, a następnie DNA jest ponownie fosforylowany przez przeniesienie fosforanu z ATP (np. [-32P]ATP). W reakcji katalizowanej przez T4 PNK stężenie ATP
powinno wynosić 1M (reakcja podstawienia) lub 2M (reakcja wymiany). Ponadto enzym
posiada aktywność 3’ fosfatazy.
Ryc. 2.4 Aktywność enzymatyczna T4 PNK.
Oczyszczenie kinazy polinukleotydowej bakteriofaga T4 z zainfekowanych komórek
gospodarza jest niewydajne i trudne, dlatego też źródłem T4 PNK są komórki Escherichia coli
z wklonowanym genem pseT bakteriofaga T4. T4 PNK jest homotetramerem zbudowanym
z podjednostek o masie 28,9 kDa każda.
T4 PNK jest głównie wykorzystywana do:
 radioaktywnego znakowania na końcu 5’ kwasów nukleinowych (reakcja podstawienia
lub wymiany), które następnie wykorzystywane są: (i) jako sonda hybrydyzacji; (ii) do
mapowania transkryptu; (iii) jako markery do elektroforezy żelowej; (iv) jako startery
w reakcji sekwencjonowania DNA; (v) jako startery do reakcji PCR lub w innych
metodach wymagających terminalnie wyznakowanego DNA.
 5'-fosforylacji oligonukleotydowych łączników i DNA/RNA przed ligacją.
18
Termostabilne polimerazy DNA przeprowadzają zależną od matrycy syntezę DNA
w kierunku 5’→3’ (Ryc. 2.5). Proces ten polega na dodawaniu deoksyrybonukleotydów do
końca 3’ nowosyntetyzowanej nici. Do rozpoczęcia reakcji wymagany jest starter z wolną grupą
3´-OH oraz jony Mg2+. Maksymalną aktywność katalityczną enzymy te wykazują w
temperaturze 75-80C. W temp. 37C osiągają jedynie około 10% aktywności maksymalnej.
5’ DNAOH
termostabilna polimeraza DNA
5’ DNA – (pdN)n + nPPi
Mg2+
dATP, dTTP, dGTP, dCTP
Ryc. 2.5 Reakcja katalizowana przez termostabilną polimerazę DNA.
Tabela 5. Właściwości wybranych termostabilnych polimeraz DNA* (wg Sambrook, J.
i Russell, D.; 2001).
Enzym
Organizm
Optymalna
temperatura
(C)
Aktywność
egzonukleolityczna
Częstość
błędów
10-6
Stabilność
Inne uwagi
Taq
Thermus
aquaticus
75 - 80
5’→3’
20 - 100
9 min w
97,5C
produkt PCR
posiada na
końcu 3’ dA**
94 kDa
monomer
Pwo
Pyrococcus
woesei
60 - 65
3’→5’
3,2
> 120 min
w 100C
Pfu
Pyrococcus
furiosus
72 - 78
3’→5’
1,6
240 min w
95C
produkt PCR
posiada tępe
końce
90 kDa
monomer
*poszczególne wartości mogą odbiegać od podanych w tabeli i różnić się w zależności od producenta
**polimeraza DNA Taq wykazuje aktywność transferazy nukleotydowej, ale nie ma aktywności proofreading
(egzonukleolitycznej 3’5’), co powoduje dodanie dodatkowej reszt/y adeninowych na końcu 3’ produktu PCR
Dostępne są również mieszaniny kilku termostabilnych polimeraz DNA np. High Fidelity
PCR Enzyme Mix czy Long PCR Enzyme Mix. Umożliwiają one amplifikację fragmentów
DNA o wielkości: (i) do 47 kpz z wirusowym DNA jako matrycą lub (ii) do 21 kpz
z genomowym DNA jako matrycą.
Zastosowanie termostabilnych polimeraz DNA:
 amplifikacja fragmentów DNA w reakcji PCR;
 znakowanie DNA;
 sekwencjonowanie DNA;
 wbudowywanie zmodyfikowanych nukleotydów (np.
znakowanych biotyną, digoksygeniną lub fluorescencyjnie);
 mutageneza specyficzna wobec miejsca;
nukleotydów
19
Polimeraza DNA I (holoenzym) (PolI, polimeraza Kornberga) syntetyzowana przez E. coli
zbudowana jest z pojedynczego łańcucha polipeptydowego o masie cząsteczkowej 109 kDa,
kodowanego przez gen polA. Enzym ten posiada następujące aktywności: (i) polimerazy DNA
5’→3’; (ii) egzonukleazy 3’→5’; (iii) egzonukleazy 5’→3’ oraz (iv) RNazy H. Aktywność
RNazy H nie jest powszechnie wykorzystywana w biologii molekularnej. Poszczególne
aktywności katalizowane są przez odrębne domeny enzymu (Tabela 6).
Tabela 6. Domeny polimerazy DNA I kodowanej przez Escherichia coli.
Domena
Aktywność
Karboksylowa, aminokwasy 543 – 928,
~46 kDa
polimeryzacyjna 5’→3’
Centralna, aminokwasy 326 – 542,
~22 kDa*
egzonukleolityczna 3’→5’
Aminowa, aminokwasy 1-325*
egzonukleolityczna 5’→3’
*karboksylowa i centralna domena stanowią fragment Klenowa
Fragment Klenowa jest dużym fragmentem polimerazy DNA I kodowanej przez E. coli.
Posiada aktywność polimeryzacyjną 5’→3’ oraz aktywność egzonukleolityczną 3’→5’
(aktywność naprawcza). W porównaniu z PolI nie posiada aktywności egzonukleolitycznej
5’→3’. Do przeprowadzenia syntezy DNA w kierunku 5’→3’ wymagana jest obecność
jednoniciowej matrycy oraz startera. Niezbędnym kofaktorem reakcji katalizowanych przez
enzym są jony Mg2+. Fragment Klenowa jest monomerem o wielkości 76 kDa. Enzym ten
można otrzymać poprzez proteolizę polimerazy Kornberga subtylizyną lub też poprzez
sklonowanie odpowiedniego fragmentu genu polA w komórkach E. coli.
Fragment Klenowa jest wykorzystywany w biologii molekularnej m.in. do:
 wypełniania lepkich końców 5’ (Ryc. 2.6), powstałych po trawieniu enzymami
restrykcyjnymi pozostawiającymi tego typu końce. Enzym ten katalizuje w sposób
zależny od matrycy dodawanie trifosforanów nukleotydów do cofniętej reszty
hydroksylowej 3’. Synteza zachodzi w kierunku 5’→3’do momentu, aż wystający lepki
koniec zostanie całkowicie wypełniony.
5’ ...GTCCA 3’OH
3’ ...CAGGTTCGAp 5’
fragment Klenowa
dATP, dTTP,
dGTP, dCTP
Mg2+
5’ ...GTCCAAGCT 3’OH
3’ ...CAGGTTCGAp 5’
Ryc. 2.6 Wypełnianie wystających lepkich końców 5’ przez fragment Klenowa.
 wytępiania lepkich końców 3’, które powstały po trawieniu enzymami restrykcyjnymi
zostawiającymi wystające końce 3’. Jednak wytępianie lepkich końców 3’ jest
wydajniej katalizowane przez polimerazę DNA faga T4, która ma większą
aktywność
egzonukleolityczną.
W
niektórych
przypadkach
aktywność
egzonukleolityczna 3’→5’ fragmentu Klenowa jest niepotrzebna lub szkodliwa. Należy
wtedy zastosować fragment Klenowa exo-. Enzym ten zachowuje aktywność
polimeryzacyjną, nie posiada natomiast aktywności egzonukleolitycznej 3’→5’.
Fragment Klenowa exo- uzyskuje się poprzez wprowadzenie odpowiedniej mutacji
w genie kodującym fragment Klenowa.
20
Polimeraza DNA bakteriofaga T4 jest białkiem o wielkości 114 kDa kodowanym przez gen 43
colifaga T4. Otrzymywany jest z komórek E. coli niosących plazmid zawierających gen 43.
Enzym ten posiada aktywności zbliżone do aktywności fragmentu Klenowa, tj. aktywność
polimeryzacyjną 5’→3’ oraz aktywność egzonukleolityczną 3’→5’. Nie posiada aktywności
egzonukleolitycznej 5’→3’.
Polimeraza DNA bakteriofaga T4 jest wykorzystywana w biologii molekularnej m.in do:
 wytępiania lepkich końców 3’, które powstały po trawieniu enzymami restrykcyjnymi
zostawiającymi wystające końce 3’ (Ryc. 2.7). Aktywność egzonukleolityczna w
stosunku do dwuniciowego DNA blokowana jest przez aktywność polimeryzacyjną
5’→3’.
5’ ...pCpGpCpApTpCpT 3’
3’ ... GpCpGp 5’
polimeraza DNA
bakteriofaga T4
...pCpGpCOH 3’
... GpCpGp 5’
Mg2+
+
pA
+
5’
pC
+
5’
pT
Ryc. 2.7 Wytępianie lepkich końców 3’ przez polimerazę DNA bakteriofaga T4.
 wypełniania lepkich końców 5’. Aktywność polimeryzacyjna 5’→3’ wymaga obecności
matrycy, startera, jonów Mg2+ oraz dNTP.
Aktywność egzonukleolityczną 3’→5’ polimerazy DNA bakteriofaga T4 jest ok. 200
razy silniejsza niż fragmentu Klenowa. Powoduje to, że enzym ten jest wydajniejszy w
wytępianiu lepkich końców 3’.
Literatura:
Sambrook,J. and Russell,D. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York
21
Część eksperymentalna
Materiały:
 DNA faga  trawiony enzymem restrykcyjnym HindIII
 plazmid pUC19 trawiony enzymem restrykcyjnym HindIII
 enzymy: CIAP (calf intestine alkaline phosphatase), ligaza DNA faga T4, Fragment
Klenowa
 bufor do trawienia R 1×stężony (10 mM Tris-HCl pH 8,5; 10 mM MgCl2; 100 mM KCl;
0,1 mg/ml BSA)
 ATP 10 mM
 2 mM dNTP Mix
Wykonanie:
Część I
Defosforylacja wektora plazmidowego strawionego enzymem restrykcyjnym
1. Usuwanie reszt fosforanowych z DNA wektora
Próbkę pUC19 strawionego HindIII podzielić na cztery części.
 Jedną część poddać działaniu alkalicznej fosfatazy mieszając ze sobą:
 2 l DNA pUC19/HindIII
 8 µl mieszaniny reakcyjnej (bufor do trawienia R – 0,8 l, alkaliczna fosfataza
(CIAP) – 0,5 l, H2O – 6,7 l)
Inkubować w temperaturze 37C, 30 min.

Pozostałą cześć próbki pUC19/HindIII zostawić w temperaturze 4°C.
2. Termiczna inaktywacja alkalicznej fosfatazy
Próbkę z pkt. 1 inkubować 15 min w temperaturze 85C.
3. Ligacja
Przygotować równolegle dwie mieszaniny ligacyjne (Tabela 7)
Tabela 7. Przygotowanie mieszanin ligacyjnych nr 1 i nr 2 w trakcie ćwiczenia 2.
Składnik
Mieszanina ligacyjna nr 1 (wektor Mieszanina ligacyjna nr 2 (wektor
poddany działaniu CIAP)
NIE poddany działaniu CIAP)
wektor
10 µl
2 µl
(pUC19/HindIII)
4 µl
4 µl
wstawka (/HindIII)

mieszanina reakcyjna
mieszanina reakcyjna nr 1 (6 l)
mieszanina reakcyjna nr 2 (14 l)
 mieszanina reakcyjna nr 1: bufor do trawienia R (0,6 l), ATP (1 l – końcowe stężenie 0,5 mM),
ligaza DNA faga T4 (0,6 l), H2O (3,8 l)
 mieszanina reakcyjna nr 2: bufor do trawienia R (1,4 l), ATP (1 l – końcowe stężenie 0,5 mM),
ligaza DNA faga T4 (0,6 l), H2O (11 l)
Mieszaniny ligacyjne inkubować w temperaturze pokojowej 1-16 h.
22
Część II
Wytępianie wektora strawionego enzymem pozostawiającym lepkie końce 5’
1. Wytępianie wektora
 Próbkę pUC19 strawionego HindIII poddać działaniu Fragmentu Klenowa mieszając
ze sobą:
 2 l DNA pUC19/HindIII
 8 µl mieszaniny reakcyjnej (bufor do trawienia R – 0,8 l, Fragment Klenowa 0,2
l (2 u), 0,25 l dNTP Mix (stężenie końcowe 0,05 mM), H2O – 6,75 l)
Inkubować w temperaturze 37C, 15 min.
2. Termiczna inaktywacja Fragmentu Klenowa
Próbkę z pkt. 1 inkubować 15 min w temperaturze 75C.
3. Ligacja
Przygotować równolegle dwie mieszaniny ligacyjne (Tabela 8)
Tabela 8. Przygotowanie mieszanin ligacyjnych nr 3 i nr 4 w trakcie ćwiczenia 2.
Składnik
Mieszanina ligacyjna nr 3
Mieszanina ligacyjna nr 4
(wektor poddany działaniu
(wektor NIE poddany działaniu
Fragmentu Klenowa)
Fragmentu Klenowa)
wektor (pUC19/HindIII)
10 µl
2 µl

mieszanina reakcyjna
mieszanina reakcyjna nr 3
mieszanina reakcyjna nr 4 (18 l)
(10 l)
 mieszanina reakcyjna nr 3: bufor do trawienia R (1 l), ATP (1 l – końcowe stężenie 0,5 mM), ligaza
DNA faga T4 (0,6 l), H2O (7,4 l)
 mieszanina reakcyjna nr 4: bufor do trawienia R (1,8 l), ATP (1 l – końcowe stężenie 0,5 mM),
ligaza DNA faga T4 (0,6 l), H2O (14,6 l)
Mieszaniny ligacyjne inkubować w temperaturze pokojowej 1-16 h.
23
ĆWICZENIE 3
Transformacja kompetentych komórek Escherichia coli
Część teoretyczna
Transformacja komórek bakteryjnych
Transformacja komórek bakteryjnych, obok koniugacji i transdukcji, jest jednym z
mechanizmów horyzontalnego transferu genów.
Transformacja bakterii polega na pobraniu wolnego egzogennego DNA ze środowiska.
Dalszym etapem jest ustabilizowanie pobranego DNA w komórce (w formie plazmidu lub
poprzez rekombinację z chromosomem) oraz zmiana w genotypie biorcy. Zdolność komórek
bakteryjnych do pobierania DNA w procesie transformacji nazywana jest stanem kompetencji.
Niektóre gatunki bakterii są naturalnie/spontanicznie zdolne do pobrania DNA ze środowiska.
Większość tych bakterii wchodzi w stan kompetencji w określonych (najczęściej
nieprzychylnych) warunkach wzrostu, np. kompetencję komórek wzmaga wysoki poziom
cAMP. Bacillus subtilis czy Haemophilus influenzae są bakteriami fakultatywnie
kompetentnymi. Tylko Neisseria gonorrhoeae jest bakterią konstytutywnie (zawsze)
kompetentną. U niektórych bakterii warunkiem zajścia transformacji jest obecność sygnałowych
sekwencji pobierania (ang. uptake-signal sequences) w substratowym DNA i/lub obecność
receptorów na powierzchni komórki. Gęstość populacji bakteryjnej przez „wyczuwanie
liczebności” (ang. Quorum sensing) wpływa na stan kompetencji bakterii. U Streptococcus
pneumoniae kompetencja jest związana z procesem transbłonowego transportu wapnia.
Wiele bakterii w naturalnych warunkach nie ulega transformacji. Stan kompetencji może
zostać wywołany w laboratorium poprzez działania czynników chemicznych lub fizycznych w
niskiej temperaturze. Metody te są szeroko wykorzystywane w inżynierii genetycznej, np. do
klonowania genów. W ten sposób transformowana jest E. coli. Uzyskanie stanu kompetencji ma
miejsce dzięki płukaniu komórek buforami zawierającymi dwuwartościowe kationy (np. Ca2+,
Mn2+, Rb2+), które destabilizują błonę komórkową (mechanizm nie jest dobrze poznany).
Kluczowy jest stan fizjologiczny komórek bakteryjnych. Komórki muszą być młode – w
wykładniczej fazie wzrostu. Komórek w fazie stacjonarnej NIE da się wydajnie wprowadzić w
stan kompetencji! Wejście DNA do komórek, bezpośrednio z otaczającego je roztworu, ma
miejsce dzięki szokowi termicznemu. Wprowadzany DNA jest w formie dwuniciowego i
koliście zamkniętego plazmidu (zrekombinowanego plazmidu). Liniowy DNA nie utrzymuje się
w komórce i jest szybko degradowany.
Etapy transformacji chemicznej (Ryc. 3.1):
1. Komórki kompetentne muszą być stale inkubowane w lodzie.
2. Do komórek kompetentnych dodać DNA. Kontynuować inkubację w lodzie (do 30 min).
3. Przenieść próbki z łaźni lodowej do bloku grzejnego z temp. 42C (szok termiczny) 1-2
min.
4. Przenieść próbki z bloku grzejnego do łaźni lodowej na 2 min.
5. Dodać podłoże płynne (ok.1 ml) i inkubować w termostacie z temp 37C przez 30-60
min.
DNA może także zostać wprowadzony do elektrokompetentnych komórek poprzez
elektroporację. Proces ten także polega na destabilizacji błony komórkowej: silne pole
elektryczne (krótki impuls prądu elektrycznego o napięciu ok. 1,6-2,5 kV) powoduje powstanie
przejściowych porów w błonie, przez które mogą przenikać cząsteczki DNA. Komórki
elektrokompetentne uzyskuje się poprzez wielokrotne ich przemywanie ultraczystą wodą w celu
usunięcia śladów soli.
Im wyższe stężenie DNA tym wydajniejszy jest proces transformacji.
24
Uwaga: komórki kompetentne E. coli są niezwykle wrażliwe w tych warunkach, dlatego cały
proces należy przeprowadzić inkubując komórki w łaźni lodowej. Wszystkie pipetowania należy
przeprowadzać bardzo delikatnie.
Wydajność transformacji z wykorzystaniem chemokompetentnych komórek E. coli wynosi ok.
106-109 transformantów/μg DNA. Wydajność elektroporacji wynosi ok. 1010 transformantów/μg
DNA.
Do komórek bakteryjnych wnika najczęściej tylko jedna cząsteczka DNA, kotransformacja E. coli dwoma plazmidami możliwa jest tylko w przypadku dwóch różnych ori
plazmidowych (grupy zgodności).
Ryc. 3.1 Schemat transformacji chemicznej.
Plazmidy i wektory plazmidowe
Termin plazmid wprowadził Joshua Lederberg w roku 1952. Plazmid to
pozachromosomowa cząsteczka DNA, występująca autonomicznie w cytoplazmie wielu
organizmów prokariotycznych, zdolna do samodzielnej replikacji niezależnie od chromosomu
bakteryjnego. Tworzą ją dwuniciowe, najczęściej koliście zamknięte, cząsteczki DNA, rzadziej
liniowe. Najbardziej charakterystyczną cechą plazmidów jest ich fizyczna odrębność od
chromosomu gospodarza oraz zdolność do trwałego utrzymywania się w komórce i replikowania
się w niej w kontrolowany sposób. Cechą charakterystyczną każdego plazmidu jest liczba kopii
jego cząsteczek w komórce, która jest ściśle zdefiniowana im mniejszy plazmid, tym liczba kopii
jest większa. Replikacja plazmidowego DNA jest regulowana na etapie inicjacji replikacji.
Wyróżnia się rozluźnioną (ang. relaxed) i zaostrzoną/ścisłą (ang. stringent) kontrolę replikacji.
Cząsteczki plazmidów stały się podstawą konstrukcji wektorów, które, tak jak plazmidy,
posiadają zdolność do autonomicznej replikacji w danym typie komórek. Wektory plazmidowe
wykorzystywane są do klonowania genów, a czasem także do nadprodukcji białka kodowanego
przez sklonowany gen.
Elementy funkcjonalne wektora
Systemy replikacyjne zawierające – ori (ang. origin) miejsce inicjacji replikacji oraz w
większości wektorów gen rep kodujący białko inicjujące replikację. Sposób regulacji inicjacji
25
replikacji decyduje o liczbie kopii plazmidu w komórce, dlatego wyróżniamy wektory wysoko- i
niskokopijne.
Geny markerowe, czyli geny kodujące białka odpowiedzialne za łatwo wyróżnialne cechy
fenotypowe, które umożliwiają identyfikacje komórek zawierających dany wektor.
Wektor powinien zawierać co najmniej jeden marker selekcyjny (gen oporności na
antybiotyk), który pozwala na wyselekcjonowanie komórek zawierających wektor, bowiem
uniemożliwia wzrost lub uśmierca komórki, które go nie mają. Szczep użyty do transformacji
musi być wrażliwy na ten antybiotyk!
Dodatkowy marker może pozwolić na odróżnienie wektora zrekombinowanego
(zawierającego wklonowaną wstawkę) od takiego, który jest „pusty” tj. nie zligował się z
żadnym fragmentem DNA.
Unikalne miejsca restrykcyjne, które służą do wprowadzania obcego DNA. W najnowszych
wektorach taką funkcję pełni tzw. polilinker, nazywany też MCS (ang. multicloning site). jest to
syntetyczny odcinek DNA, w którym znajduje się zwykle kilkanaście miejsc rozpoznawanych
przez różne endonukleazy restrykcyjne. Polilinker jest z reguły wstawiany w obrębie drugiego
markera.
Co najmniej jeden silny promotor pozwalający na ekspresję danego genu.
Antybiotyki jako markery selekcyjne stosowane w biologii molekularnej
Antybiotyki to substancje chemiczne mające właściwości bakteriostatyczne i bakteriobójcze
produkowane przez organizmy żywe. Najszersza definicja mówi, że antybiotykami są także
związki syntetyczne, które wywierają negatywny wpływ na mikroorganizmy, a nie mają swoich
pierwowzorów wśród naturalnie produkowanych substancji
Mechanizmy oporności na antybiotyki mogą być różne, niżej wymieniono te, które są
wykorzystywane w biologii molekularnej.
Najpopularniejszymi antybiotykami wykorzystywanymi w biologii molekularnej są:
Ampicylina – antybiotyk -laktamowy hamujący biosyntezę ściany komórkowej przez wiązanie
z białkami PBP (ang. penicilin-binding proteins). Zasadniczo działa bakteriostatycznie, gdyż
zabija wyłącznie rosnące komórki, poprzez zaburzenie syntezy mureiny, co prowadzi do
rozerwania ściany komórkowej i lizy.
Mechanizm oporności na ampicylinę polega na enzymatycznej degradacji cząsteczki antybiotyku
poprzez enzym z grupy -laktamaz (np. kodowany przez gen bla).
Tetracyklina – antybiotyk poliketydowy. Działa na translację poprzez wiązanie się z miejscem
akceptorowym dla aminoacylo-tRNA w podjednostce 16S rRNA.
Mechanizm oporności na tetracyklinę polega na aktywnym usuwaniu antybiotyku z komórki
poprzez wyspecjalizowany transporter błonowy (kodowany przez gen tet).
Chloramfenikol – antybiotyk o działaniu bakteriostatycznym. Hamuje aktywność
peptydylotransferazy, wiążąc się z 23S rRNA.
Mechanizm oporności na chloramfenikol polega na enzymatycznej modyfikacji cząsteczki
antybiotyku poprzez acetylotransferazę chloramfenikolową (kodowaną przez gen cat).
Kanamycyna – antybiotyk z grupy aminoglikozydów. Działa na podjednostkę 30S rRNA,
hamując translację.
Mechanizm oporności na kanamycynę polega na enzymatycznej modyfikacji cząsteczki
antybiotyku, którą przeprowadza aminofosfotransferaza (kodowana przez gen aph).
26
Wektory komercyjne używane do klonowania
Wektory pierwszej generacji – pBR322 – długość 4361 par zasad (pz), geny oporności na dwa
antybiotyki (ampicylinę i tetracyklinę), na obszarze których znajdują się pojedyncze miejsca
restrykcyjne, system replikacyjny (pochodzi z plazmidu pMB1). Średnia liczba kopii związana
jest z białkiem Rop (kodowanym przez gen rop), który stabilizuje kompleksu RNAI-RNAII
(Ryc. 3.2).
Wektory drugiej generacji – pUC19 – mniejszy niż pBR322 (2868 pz), jeden gen oporności na
antybiotyk (ampicylinę). Ma ten sam ori replikacji co pBR322, ale zawiera punktową mutację w
RNAII i nie występuje w nim gen rop, stąd liczba kopii znacznie większa (nawet 700).
Natomiast posiada dodatkowo krótki segment DNA, na obszarze którego znajduje się też
polilinker (54 pz, miejsca restrykcyjne dla 21 enzymów restrykcyjnych). Ponadto wektor ten
zawiera elementy regulatorowe (promotor Plac, miejsce wiązania represora Lac, miejsce wiązania
białka CAP) oraz sekwencję kodującą pierwsze 146 aminokwasów -galaktozydazy (tzw.
fragment ) z genu lacZ’ E. coli (Ryc. 3.2). Polipeptyd kodowany przez ten fragment lacZ’
znalazł zastosowanie w prostym teście określającym czy obcy DNA został wstawiony w
polilinker (selekcja na tzw. białe-niebieskie, patrz ćwiczenie 4).
Ryc. 3.2 Schematy wektorów plazmidowych pBR322 i pUC19 .
Plazmidy zawierające systemy replikacyjne pMB1 i ColE1 są niezgodne (ang.
incompatible), tzn. nie mogą stabilnie występować w jednej komórce bakteryjnej, lecz są w pełni
zgodne z replikonami zawierającymi system replikacyjny p15A (pACYC177, pACYC184).
Ilość otrzymywanego DNA po izolacji: plazmid wysokokopiowy 2-5 g DNA na 1 ml hodowli,
plazmid niskokopiowy 0,2-1 g DNA na ml hodowli.
Literatura:
Tabor S, Richardson CC. A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression
of specific genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1985. 82:1074-8.
Studier FW, Moffatt BA.Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression_ of
cloned genes. J Mol Biol. 1986. 189:113-30.
Lee N, Francklyn C, Hamilton EP. Arabinose-induced binding of AraC protein to araI2 activates the araBAD
operon promoter. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987. 84:8814-8.
27
Część eksperymentalna
Materiały:
DNA: mieszaniny ligacyjne nr 1 - 4 z ćwiczenia 2
Szczep bakteryjny: E. coli Top10F´{lacIq Tn10 (Tcr)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)
Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG
Odczynniki:
 bufor TFB1 (pH 7,4; JAŁOWY!!): 30 mM octan potasu; 100 mM RbCl; 10 mM
CaCl2; 50 mM MnCl2; 15% (v/v) glicerol
 bufor TFB2 (pH 6,5; JAŁOWY!!): 10 mM MOPS; 75 mM CaCl2; 10 mM RbCl;
15% (v/v) glicerol
Uzupełnienia podłoży:
 tetracyklina – roztwór w etanolu10 mg/ml
 ampicylina – roztwór wodny 100 mg/ml
 X-gal roztwór w dimetyloformamidzie (40 mg/ml)
 roztwór wodny IPTG (1 M)
Podłoża:
 LB płynne
 LB stałe uzupełnione ampicyliną (100 g/ml), tetracykliną (10 µg/ml) X-gal (40
g/ml) i IPTG (1mM)
Wykonanie:
Przygotowanie komórek kompetentnych:
1. Do dwóch kolb zawierających po 100 ml płynnego podłoża LB dodać 0,5 ml nocnej
hodowli E. coli TOP10.
2. Inkubować 1,5 h w temperaturze 37C w wytrząsarce.
3. W dwóch eppendorfach odwirować 2 razy po 1,5 ml hodowli (1,5 min 6000 rpm w
temperaturze 4ºC).
4. Usunąć dokładnie pipetą supernatant i umieścić probówki w łaźni lodowej.
5. Zawiesić każdy osad w 1 ml buforu TFB1 (nie wyjmując probówek z lodu!!!).
6. Inkubować 15 – 20 min w łaźni lodowej.
7. Próbki odwirować (2 min 6000 rpm w temperaturze 4ºC).
8. Usunąć pipetą supernatant i zawiesić każdą próbkę w 200 l buforu TFB2 (nie wyjmując
probówek z lodu!!!).
9. Inkubować w łaźni lodowej przez 15 – 20 min.
Transformacja mieszaninami ligacyjnymi otrzymanymi w trakcie ćwiczenia 2:
Rozdzielić przygotowane komórki kompetentne do 4 probówek eppendorf po 100 l.
1. Dodać po 10 l odpowiedniej mieszaniny ligacyjnej do każdej porcji komórek
kompetentnych.
2. Utrzymywać komórki kompetentne w łaźni lodowej przez 30 min.
3. Przenieść probówki do temperatury 42ºC na 1,5 min.
4. Przenieść probówki z powrotem do łaźni lodowej na 2 min.
5. Dodać do każdej z probówek 900 l płynnego podłoża LB bez antybiotyku.
6. Mieszaniny komórek kompetentnych inkubować w temperaturze 37ºC przez 1 h.
7. Inkubowane mieszaniny wirować 6000 rpm, 1 min, pobrać pipetą automatyczną 100 l
podłoża, resztę podłoża zlać. Zawiesić komórki przez pipetowanie w pobranych 100 l
podłoża, a następnie wysiać na szalki z LB z Amp, Tet, X-gal, IPTG metodą wysiewu
powierzchniowego.
8. Inkubować szalki w temperaturze 37ºC 16-18 h.
28
ĆWICZENIE 4
Zastosowanie elementów operonu laktozowego Escherichia coli w klonowaniu
genów
Cześć teoretyczna
1. Kontrola ekspresji genów na przykładzie operonu lac Escherichia coli
Preferencyjnym źródłem węgla dla bakterii jest glukoza i w jej obecności zahamowana
jest ekspresja wielu genów kodujących białka biorące udział w katabolizmie innych cukrów, np.
laktozy, arabinozy lub maltozy.
Operon to zespół sąsiadujących genów prokariotycznych, zwykle powiązanych ze sobą
funkcjonalnie (np. genów jednego szlaku metabolicznego). Ekspresja tych genów jest
regulowana (indukowana lub hamowana) przez wspólne elementy kontroli (sekwencje
operatorowe, promotory, regulatory, efektory, itp.)
Najlepiej poznanym przykładem operonu indukowanego jest operon kodujący enzymy
niezbędne do hydrolizy laktozy u Escherichia coli. W skład operonu laktozowego1 E. coli
wchodzą trzy geny strukturalne: lacZ (β-galaktozydaza), lacY (permeaza β-galaktozydazy) i
lacA (transacetylaza β-galaktozydowa), których ekspresja jest możliwa ze wspólnego
promotora umiejscowionego przed genem lacZ (Ryc. 4.1). Ekspresja operonu laktozowego
regulowana jest na poziomie transkrypcji poprzez białko represorowe (produkt genu lacI),
które rozpoznaje sekwencję operatorową. Gen kodujący białko represorowe ulega
konstytutywnej ekspresji. Ekspresja genów strukturalnych wchodzących w skład operonu
laktozowego jest indukowana poprzez pojawienie się substratu: laktozy. Naturalnym
induktorem operonu lac u E.coli jest laktoza, a dokładniej allolaktoza, która powstaje w wyniku
aktywności -galaktozydazy lub spontanicznej izomeryzacji laktozy. Zatem -galaktozydaza
indukuje i utrzymuje ekspresję operonu lac (w tym własnego genu lacZ), jest to tzw. sprzężenie
zwrotne dodatnie.
Ryc. 4.1 Operon laktozowy E. coli.
Laktoza i allolaktoza ulegają enzymatycznemu rozłożeniu (katalizowanemu przez galaktozydazę), na dwa cukry składowe: glukozę i galaktozę (Ryc. 4.2).
1
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/majorsbiology/lacoperon.html
29
Ryc. 4.2 Hydroliza laktozy przez -galaktozydazę.
Mutacje konstytutywne, elementy działające in cis i in trans
François Jacob opracował system tzw. częściowych diploidów w celu zidentyfikowania
elementów genetycznych mających wpływ/kontrolujących ekspresję genów strukturalnych w
operonie laktozowym. W tym celu, do komórek E. coli wprowadził na plazmidzie F’ drugą
kopię operonu laktozowego (lacI ze swoim promotorem oraz geny lacZYA z promotorem i
sekwencjami operatorowymi). Jacob odkrył, że istnieją dwie klasy mutacji konstytutywnych
(tzn. takich, których występowanie pozwala na konstytutywną ekspresję genów strukturalnych
operonu laktozowego). Pierwsza klasa to mutacje dotyczące sekwencji operatorowej (mutacja
oc). Te mutanty są cis-dominujące, ponieważ kontrolują tylko operon usytuowany na tej samej
cząsteczce DNA (nie mają wpływu na operon występujący w plazmidzie). W tym przypadku
zawsze ma miejsce ekspresja aktywnej formy -galaktozydazy, ponieważ wprowadzenie dzikiej
kopii operatora nie zmienia fenotypu bakterii:
Druga klasa mutacji konstytutywnych to mutacje w genie kodującym białko represorowe
(i-). W tym przypadku, monomery represora nie mogą utworzyć aktywnego tetrameru, wiec nie
są w stanie połączyć się z dzikim operatorem. Takie mutacje są trans-recesywne, ponieważ
monomer represora nie połączy się ani z operatorem występującym w plazmidzie ani w
chromosomie, efekt tej mutacji może być „zniesiony” poprzez wprowadzenie do komórki dzikiej
kopii genu lacI (Tabela. 9.).
30
Tabela 9. Wpływ mutacji w operonie lac na fenotyp E. coli2
Genotyp
i+ o+ z+ y+ (dziki)
i+ oc z+ y+ (mutant oc)
i+ oc z+ y+ (mutant oc)
i+ o+ z+ y+ (w plazmidzie)
i+ oc z- y+ (podwójny mutant)
i+ oc z- y+ (podwójny mutant)
i+ o+ z+ y+ (w plazmidzie)
i- o+ z+ y+
i- o+ z+ y+
i+ o+ z+ y+ (w plazmidzie)
-galaktozydaza
brak laktozy
laktoza
brak
aktywna
aktywna
aktywna
Komentarz
ekspresja indukowana
ekspresja konstytutywna
aktywna
aktywna
mutacja cis-dominująca
brak
brak
brak
aktywna
mutacja cis-dominująca
aktywna
aktywna
ekspresja konstytutywna
brak
aktywna
mutacja trans-recesywna
-galaktozydaza eksprymowana,
ale nieaktywna
Trzy poziomy ekspresji genów operonu laktozowego:
Gdy w środowisku obecna jest glukoza, a brak jest laktozy, białko represorowe łączy się
z operatorem i blokuje w ten sposób polimerazę RNA, zasłaniając część sekwencji
promotorowej. Nie dochodzi wtedy do transkrypcji genów strukturalnych.
W przypadku braku glukozy i obecności laktozy, jej niewielka ilość dyfunduje do
wnętrza komórki i łączy się białkiem represorowym, zmieniając jego konformację. Białko
represorowe nie może wtedy przyłączyć się do sekwencji operatorowej i możliwa jest ekspresja
genów strukturalnych. Permeaza odpowiedzialna jest za transport laktozy do wnętrza komórki,
zaś -galaktozydaza (EC 3.2.1.32) za hydrolizę wiązań O-glikozydowych w -D-galaktozydach.
Produkt genu lacA odpowiedzialny jest za acetylację tiogalaktozydów, lecz nie odgrywa żadnej
roli w katabolizmie laktozy.
Co się dzieje gdy komórka ma do wyboru dwa źródła węgla? Dla bakterii korzystniejsze
jest wykorzystanie glukozy niż laktozy, ponieważ glukoza może być natychmiast zużyta w
metabolizmie (glikoliza), a laktoza musi zostać najpierw zhydrolizowana. Ekspresja operonu
laktozowego jest hamowana w obecności glukozy: jest to tak zwana represja kataboliczna.
W wielu operonach uczestniczących w metabolizmie cukrów sekwencje promotorowe
odbiegają od sekwencji kanonicznej i są słabo rozpoznawane przez bakteryjną polimerazę RNA.
Mechanizm represji katabolicznej pozwala na aktywację transkrypcji z takich promotorów.
Polimeraza RNA łączy się wydajniej z promotorem obecnym w operonie laktozowym w
obecności specyficznego białka zwanego CAP (ang. catabolite gene activator protein) lub CRP
(ang. cyclic AMP receptor protein), które musi być związane ze specyficznym miejscem DNA
położonym w pobliżu sekwencji promotorowej, tzw. CBS (ang. CAP binding site). Białko CAP
wiąże się z CBS, jeśli do niego przyłączą się cząsteczki cyklicznego AMP (efekt
allosteryczny). Transport glukozy (w postaci glukozofosforanu) do komórki bakteryjnej wiąże
się ze spadkiem stężenia aktywnej (fosforylowanej) formy cyklazy adenylanowej
odpowiedzialnej za syntezę cAMP z ATP.
Jeżeli w pożywce znajduje się glukoza, poziom cAMP obniża się, a konformacja białka
CAP uniemożliwia wiązanie sekwencji CBS, polimeraza RNA słabo wiąże się z promotorem i
synteza enzymów szlaku laktozowego zostaje spowolniona. W efekcie, jeśli w podłożu obecna
jest glukoza i laktoza, metabolizowana będzie w pierwszym rzędzie glukoza, aż do wyczerpania
2
Uwaga: mutacje mogą także dotyczyć promotorów i/lub genu permeazy.
31
się tego źródła węgla. Następnie zostaje uruchomiony operon laktozowy, dzięki kompleksowi
cAMP-CAP (oraz laktozie, która zmienia konformację represora LacI).
Kompleksy cAMP-CRP regulują (aktywują lub hamują) w ten sposób ekspresję genów
kodujących wiele szlaków metabolicznych oraz innych operonów, np. odpowiedzialnych za
syntezę rzęsek, produkcję antybiotyków, wirulencję itp. (regulony).
2. Operon laktozowy w biologii molekularnej
Gen lacZ wykorzystywany jest jako gen reporterowy, ponieważ aktywność galaktozydazy można łatwo wykryć, używając substratów chemicznych, które po hydrolizie
zmieniane są w barwne produkty reakcji. Struktura enzymu pozwoliła na wykorzystanie go w
wielu technikach biologii molekularnej, np. w klonowaniu genów, badaniu interakcji
białko/białko, badaniu ekspresji genów, badaniach zmienności fazowej bakterii, itp.
Substraty:
Istnieją chromogenne analogi strukturalne laktozy hydrolizowane przez -galaktozydazę
(Ryc. 4.3). Najczęściej stosowane są ONPG (o-nitrofenylo--D-galaktopiranozyd) w podłożach
płynnych oraz X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo--D-galaktopiranozyd) w podłożach stałych.
Żaden z tych związków nie indukuje jednak operonu laktozowego, do indukcji stosuje się IPTG
(izopropylo--D-tiogalaktopiranozyd). Jest to mała cząsteczka, która dyfunduje do wnętrza
komórki, ale nie jest metabolizowana przez bakterie.
X-Gal
IPTG
Ryc. 4.3 Wzory strukturalne substratów
-galaktozydazy i induktora operonu
lac
ONPG
-komplemetacja
Aktywna -galaktozydaza z E. coli działa jako oligomer, zbudowany z 4 identycznych
łańcuchów polipeptydowych, każdy o długości 1023 aminokwasów. Każdy polipeptyd może być
podzielony na 2 nieaktywne fragmenty:  (N-koniec) i  (C-koniec polipeptydu). Wykazano, że
ekspresja końców karboksylowych () pozwala na uzyskanie nieaktywnych dimerów. Aktywny
enzym, w formie tetrameru, może być otrzymany, jeżeli w komórce jednocześnie z fragmentem
 będzie syntetyzowany peptyd , kodowany przez gen lacZ’ (Ryc. 4.4).
32
Ryc.4.4
-komplemetacji:
a. dzika -galaktozydaza z E. coli
b. dimer oraz tetramer uformowany przez
peptydy α oraz .
Selekcja na „białe-niebieskie” (ang. blue-white screening)
Aby móc przeprowadzić selekcję kolonii transformantów E. coli na „białe-niebieskie” należy
mieć do dyspozycji okreslony szczep bakterii, który:
 nie może wyrażać genu lacZ, zazwyczaj zawiera mutację Δ(lac)X74 (delecja całego operonu laktozowego
wraz z otaczającym go DNA)3;
 musi syntetyzować fragment  : zazwyczaj zawiera mutację lacZΔM15 (gen lacZ z
delecją nukleotydów kodujących aminokwasy 11 do 41).
Ponadto wektor musi posiadać gen lacZ’ (Ryc. 4.5 i 4.6), kodujący fragment , zazwyczaj są to
92 kodony z końca 5’genu lacZ (Ryc. 4.6). W wektorach pUC18/19 sześć kodonów zastąpiono
w zgodnej ramce odczytu unikatowymi miejscami rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne
(MCS: ang. multicloning site).
Ryc.
4.5
α-komplemetacja
pomiędzy
fragmentami -galaktozydazy kodowanymi
przez komórki E. coli lacZΔM15 oraz gen
lacZ’, obecny w wektorze.
Wklonowanie obcego fragmentu DNA w MCS przerywa gen lacZ’ i nie dochodzi do
-komplementacji w komórkach E. coli (lacZM15). Na szalkach Petriego z X-Gal niebieskie
kolonie E. coli zawierają pusty wektor (dochodzi do -komplementacji), a kolonie białe-wektor
z klonowanym obcym fragmentem DNA.
3
Uwaga: komórki lacY nie kodują permeazy laktozowej
33
Ryc. 4.6 Mapa plazmidu pBluescript II KS+/-: sekwencja CAP, promotor Plac, operator
rozpoznawany przez represor LacI i koniec 5` genu lacZ kodujący  fragment galaktozydazy z wklonowaną sekwencją MCS (http://www.fermentas.com).
Inne elementy operonu laktozowego używane w biologii molekularnej
Promotor Plac i jego pochodne, np. promotor PlacUV5, w którym trzy mutacje punktowe
zmniejszają jego czułość w stosunku do stężenia cAMP. Promotor taki trudniej unika derepresji
w przypadku wyczerpania się glukozy w pożywce (co może mieć znaczenie w przypadku gęstej
hodowli); o takim promotorze mówi się, że „mniej przecieka”.
Represor LacI lub jego pochodna kodowana przez gen lacIq. Mutacja dotyczy
promotora genu lacI (w pozycji -35 z GCGCAA na GTGCAA: promotor jest lepiej
rozpoznawany przez bakteryjną polimerazę RNA). Mutacja lacIq1, dzięki delecji 15 pz w
regionie promotora, pozwala na otrzymanie optymalnego promotora powyżej genu lacI. Dzięki
mutacjom możliwa jest wydajniejsza ekspresja represora operonu laktozowego. Zastosowanie
represora pozwala natomiast na ściślejszą kontrolę ekspresji genów sklonowanych w plazmidzie,
który posiada sekwencję operatorową rozpoznawaną przez LacI
Systemy dwuhybrydowe:
Jest to jedna z najpowszechniej stosowanych metod identyfikacji oddziaływań między
białkami. Dostępne są bardzo różne systemy dwuhybrydowe: te przedstawione poniżej (Ryc. 4.7
i Ryc. 4.8.) wykorzystują elementy operonu laktozowego.
34
Ryc.
4.7
Bakteryjny
system
dwuhybrydowy. Badane białka są w fuzji z
fragmentami  i  -galaktozydazy; jeżeli
białka A i B oddziałują ze sobą, komplementacja
ma
miejsce
i
-galaktozydaza jest aktywna.
Ryc.
4.8
Bakteryjny
system
dwuhybrydowy.
Badane białka są w fuzji z fragmentami
T25
i
T18
cyklazy
adenylowej
odpowiedzialnej za syntezę cAMP; jeżeli
białka X i Y oddziałują ze sobą, aktywny
kompleks
cAMP-CRP
aktywuje
transkrypcję -galaktozydazy.
3. Izolacja plazmidowego DNA metodą minilizy alkalicznej
W metodzie służącej do do izolacji DNA plazmidowego z komórek bakteryjnych
wykorzystuje sie różnice w zdolności do renaturacji plazmidów oraz chromosomu bakteryjnego.
Opracowana została przez Birnboima i Doly`ego w 1979.
DNA plazmidowy izoluje się z nocnej hodowli płynnej pochodzącej, z jednej kolonii
bakteryjnej (pojedynczy klon), co zapewnia jednolitość genetyczną hodowli. Pożywka płynna
pozwala na uzyskanie dużej masy bakterii. Bakterie, które utraciły plazmid podczas podziałów,
giną (presja selekcyjna). Możliwe jest wyizolowanie DNA z kolonii bakteryjnej rosnącej na
szalce, jednakże otrzymamy wtedy bardzo mało DNA. Całonocna hodowla zawierająca około 2
109 komórek/ml, a kolonia z szalki tylko ok. 107.
Etapy procesu:
Zawieszenie komórek w roztworze I (glukoza, Tris, EDTA), który rozlużnia struktury
błony zewnętrznej bakterii przez chelatację jonów dwuwartościowych (np. Ca2+, Mg2+). oraz
hamuje DNazy. Obecność glukozy ma na celu zapewnienie odpowiedniego ciśnienia
osmotycznego, aby komórka nie pobierała wody (zapobiega przedwczesnemu pęknięciu
komórek), Tris-Cl zapewnia kontrolę pH.
Liza komórek bakteryjnych ma miejsce dzięki dodaniu silnie alkalicznego roztworu II
(NaOH/SDS). SDS (dodecylosiarczan sodu) rozpuszcza fosfolipidowe i białkowe komponenty
błon komórkowych, uwalniając zawartość komórek. W tych warunkach (alkaliczne pH)
zachodzi odwracalna denaturacja kwasów nukleinowych, a RNA ulega częściowej hydrolizie.
Preparat staje się przejrzysty i zwiększa się jego lepkość.
Oddzielenie plazmidowego DNA od białek, resztek błon i chromosomu bakteryjnego,
ma miejsce dzięki neutralizacji pH (dodanie octanu potasu w roztworze III): tylko mały kolisty
35
plazmidowy DNA renaturuje. Białka, zdenaturowany chromosomalny DNA oraz błony
komórkowe wytrącają się dzięki SDS i solom: powstaje nierozpuszczalny dodecylosiarczan
potasu (KDS) w postaci wytrąconego serowatego osadu, który jest usuwany poprzez wirowanie.
Po tym etapie, otrzymany preparat może być dodatkowo odbiałczany, np. mieszaniną
fenol/chloroform, lub oczyszczany na minikolumnach. Te czynności nie są uwzględnione w
przedstawionym niżej, przykładowym protokole.
Otrzymany, oczyszczony DNA plazmidowy można zagęszczać poprzez wytrącanie w
etanolu lub izopropanolu w obecności soli, a następnie zawiesić w odpowiednim buforze (TE lub
w H2O) z RNAzą.
Jakość wyizolowanego DNA może być sprawdzona poprzez: (i) pomiar
spektrofotometryczny (w ten sposób można określić także jakość uzyskanego DNA, czyli
stopień zanieczyszczenia białkami i/lub RNA), (ii) rozdział elektroforetyczny lub też (iii)
poddanie DNA trawieniom enzymami restrykcyjnymi. Szybkość migracji DNA w żelu
niedenaturującym zależy od gęstości żelu, wielkości fragmentów DNA oraz konformacji
kolistego DNA.
Ryc. 4.9 Obraz rozdziału elektroforetycznego (na żelu agarozowym)
plazmidowego DNA pBR322 wyizolowanego metodą minilizy
alkalicznej (Birnboim i Doly, 1979)
1. chromosomalny DNA
2. dimer pBR322
3. forma oc (ang. open circular)
4. forma ccc (ang. covalently closed circular)
5. nieodwracalnie zdenaturowana forma ccc
6. niskocząsteczkowy RNA
(Uwaga: formy oc, ccc i liniowa mają taką samą wielkość: 4361 pz)
36
1
2
3
4
5
6
Ryc. 4.10 Obraz rozdziału elektroforetycznego (na żelu
agarozowym) plazmidowego DNA pBluescript KS(+)
wyizolowanego metodą minilizy alkalicznej
1. prawidłowa izolacja pBluescript KS II (+) z E. coli
XL1-Blue
2. jak 1, ale worteksowane po roztworze III
3. jak 1, ale worteksowane po roztworze II
4. jak 1,ale do roztworu II dodano 50 μl NaOH 5 mM
5. jak 1, ale po trawieniu EcoRI (forma liniowa plazmidu)
6. marker wielkości DNA
Literatura
Birnboim, Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nucleic
Acids Res. 7, 1513-1523
Lewis M. 2005. The lac repressor. C R Biol., 328(6):521-48
Lewis, M., Chang G., i wsp., 1996. Crystal structure of the Lactose Operon Repressor and Its Complexes with DNA
and Inducer. Science 271:1247-1254
Matthews. 2005. The structure of E. coli -galactosidase. C R Biol. 328(6):549-56.
Oehler S, Amouyal M, Kolkhof P, i wsp., 1994. Quality and position of the three lac operators of E. coli define
efficiency of repression. EMBO Journal 13: 3348–3355
Sambrook, J., Fritsch, E. F. i T, M. 1989. Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor,
NY
Szeberenyi J. 2004. cAMP Regulation of the Lactose Operon. Biochemistry and Molecular Biology Education 32
(3): 198–199
Ullmann A. 2010. Jacques Monod, 1910-1976: his life, his work and his commitments. Res Microbiol. 161(2): 6873
37
Część eksperymentalna
I : Izolacja DNA metodą minilizy alkalicznej
Materiały do doświadczeń
1. Nocne hodowle szczepu E. coli Top10F’ (pUC19 ze sklonowanymi fragmentami DNA faga
HP1)
2. Roztwór I (GTE): 50 mM glukoza, 25 mM TrisCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH 8,0)
3. NaOH 5 M
4. SDS 10 %
5. Do zrobienia: Roztwór II: 0,2 M NaOH, 1% SDS.
6. Roztwór III: 3 M octan potasu, 2 M kwas octowy (stężenie reszty kwasu octowego 5 M), pH
4,8
7. Etanol 96% i 70%
8. H2O z RNazą 20 g/ml
9. Eppendorfy
10. Pipety automatyczne
11. Jałowe końcówki 10-200 l i 1 ml
12. Lód
13. Wirówka
Procedura eksperymentalna:
1. Bakterie osadzić poprzez jednokrotne odwirowanie (w tym samym eppendorfie) 1,5 ml
płynnej nocnej hodowli 6000 rpm, 1 min 4C.
2. Dokładnie pozbyć się supernatantu.
3. Osad z 3 ml hodowli dokładnie zawiesić w 100 µl jałowego, zimnego roztworu GTE.
4. Dodać 200 µl roztworu II, mieszać przez kilkukrotne DELIKATNE odwracanie probówki i
wstawić do lodu.
5. Dodawać 150 µl zimnego roztworu III, zamieszać.
6. Inkubować 5 minut w lodzie.
7. Wirować 10 min przy 13000 rpm.
8. Supernatant przenieść do nowego eppendorfa, nie pobierając białego osadu.
9. Do zebranego supernatantu dodać dwie objętości 96% etanolu, inkubować 5 min w
temperaturze pokojowej.
10. Ponownie wirować (10 min, 13000 rpm).
11. (Osad przemyć 200 µl 70% etanolu, i odwirować 1 min, 13000 rpm.
12. Usunąć resztki etanolu: pipetą automatyczną oraz papierowym ręcznikiem nie dotykając
osadu. Uwaga: w tym momencie osad łatwo się odkleja.)
13. Osad suszyć 10-15 min w 42°C.
14. DNA zawiesić w 40 µl jałowej wody z RNazą (końcowe stężenie 20 g/ml).
II: Sprawdzanie jakości wyizolowanego DNA na żelu agarozowym
Materiały do doświadczeń
1.
2.
3.
4.
5.
Agaroza
TBE (89 mM Tris, 89 mM kwas borowy, 2 mM EDTA)
Aparat do elektroforezy
Grzebienie
Loading Dye Solution (0,25 % błękit bromofenolowy, 0,25% ang. xylene cyanol, 30% (v/v)
glicerol)
6. Jałowa H2O
38
7. Marker wielkości DNA
Procedura eksperymentalna:
1. Przygotować 0,7% roztwór agarozy w 1  TBE w objętości dostosowanej do używanego
aparatu.
2. Zamieszać i zagotować w kuchence mikrofalowej.
3. Uzyskany żel ostudzić do 50C.
4. Przygotowany żel wylać do kuwety aparatu.
5. Umieścić grzebienie.
6. Po stężeniu żelu wyjąć grzebienie, a żel umieścić w aparacie wypełnionym buforem TBE.
7. W 1,5 ml probówce umieścić 10 l wyizolowanego DNA z 3 l 6  Loading Dye Solution.
8. Zwirować w celu osadzenia próbek na dnie eppendorfa.
9. Przygotowane próby nałożyć do studzienek.
10. Elektroforezę prowadzić przy napięciu 5-6 V/cm przez ok. 30 min.
11. Wykonać zdjęcie żelu.
Genotypy kilku laboratoryjnych szczepów E. coli
1. E. coli K12: dziki szczep
2. E. coli Top10: F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR nupG recA1
araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR) endA1 λ3. E. coli Top10 F’: F'[lacIq Tn10(Tcr)] mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74
deoR nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StR) endA1 λ4. XL1-Blue F'[Tn10 (Tcr) proAB+ lacIq (lacZ ΔM15]endA1 gyrA96 thi-1 recA1 relA1 lac
glnV44 hsdR17(rK- mK+)
Uwaga: Komórki lacY nie kodują permeazy laktozowej
39