Zastosowanie biotestów w badaniach środowiskowych
advertisement
ROZDZIAŁ 32 ZASTOSOWANIE BIOTESTÓW W BADANIACH ŚRODOWISKOWYCH Agnieszka Kuczyńska, Lidia Wolska, Jacek Namieśnik Katedra Chemii Analitycznej, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska, ul. Narutowicza 11/12, 80-952 Gdańsk, STRESZCZENIE Rozwój bioanalityki i biomonitoringu środowiska stanowi jedną z najważniejszych tendencji rozwojowych analityki chemicznej. Burzliwy rozwój tego działu analityki sprawia, że brak jest przynajmniej na razie jednoznacznej klasyfikacji odpowiednich technik i częste są przypadki nieporozumień terminologicznych. Przedstawiono możliwości wykorzystania testów opartych na wykorzystaniu materiału biologicznego do oceny stanu części abiotycznej środowiska. Dokonano klasyfikacji znanych typów biotestów wykorzystywanych do sumarycznej oceny stopnia skażenia poszczególnych elementów środowiska. Przedstawiono również zebrane informacje na temat wrażliwości niektórych gatunków roślin i zwierząt na substancje toksyczne obecne w środowisku. 1. WSTĘP Intensywny rozwój nowych technologii, postępująca urbanizacja i coraz bardziej konsumpcyjny styl życia człowieka wywołują niekorzystne, a często nawet nieodwracalne zmiany w środowisku. Do powietrza, wód powierzchniowych i gleb dostaje się coraz szersza gama zanieczyszczeń pochodzących głównie ze źródeł antropogennych. Jednocześnie na skutek takich procesów jak transport oraz przemiany (chemiczne, fotochemiczne i biochemiczne) dochodzi do zróżnicowania poziomu stężeń określonych zanieczyszczeń w poszczególnych elementach nieożywionej (abiotycznej) części środowiska. Stąd związki chemiczne przedostają się do roślin, organizmów zwierzęcych i ostatecznie do organizmów ludzkich. Zanieczyszczenia te mogą wywoływać różnorakie niekorzystne efekty zarówno bezpośrednio po ekspozycji, jak i w okresie późniejszym co określane jest terminem „odległe skutki toksyczne”. To wszystko sprawia, że przed analitykami stoi obowiązek możliwie wszechstronnej kontroli poziomu stężeń poszczególnych ekotoksyn zarówno w ożywionej, jak i nieożywionej części środowiska. Rozwiązaniem wielu problemów byłaby pełna charakterystyka analityczna środowiska tzn. oznaczenie poziomów stężeń wszystkich (rozpoznanych i nierozpoznanych) zanieczyszczeń w każdym z jego elementów. Powstaje jednak wątpliwość czy takie zadanie jest obecnie możliwe do wykonania i czy byłoby to celowe biorąc pod uwagę: - ilość składników, które należałoby oznaczyć, - zróżnicowane poziomy stężeń (głównie w zakresie składników śladowych i mikrośladowych), - fluktuacje stężeń zanieczyszczeń w czasie i w przestrzeni, - złożony skład matrycy i możliwość wystąpienia interferencji, - skomplikowane, to znaczy czaso- i pracochłonne procedury przygotowania próbek do analizy, 668 Rozdział 32 - dodatkowe obciążenie środowiska przez stosowane odczynniki chemiczne, a przede wszystkim przez rozpuszczalniki organiczne używane na etapie przygotowania próbek, - dodatkowe koszty związane z koniecznością zakupu odczynników wysokiej czystości i koniecznością utylizacji lub zagospodarowania ich nadmiaru (zlewek). Uniknięcie wspomnianych niedogodności i ograniczeń związane jest z wprowadzeniem do praktyki analitycznej nowego podejścia do oceny stopnia skażenia środowiska polegającego na oznaczaniu sumarycznych wskaźników stopnia zanieczyszczenia danego elementu środowiska. Takie parametry jak CHZT i BZT, czy też ogólna zawartość węgla (OW) i węgla organicznego (OWO), wyrażające całkowitą zawartość tego pierwiastka w zanieczyszczeniach obecnych w badanej próbce mogą być z powodzeniem wykorzystywane w analityce środowiska [1]. Miarę sumarycznego obciążenia poszczególnych elementów środowiska przez zanieczyszczenia różnego typu może również stanowić toksyczność próbki wyznaczona za pomocą odpowiedniego biotestu. 2. OCENA EFEKTÓW TOKSYCZNYCH Badania toksyczności próbek środowiskowych mogą stanowić podstawę do rozwiązania trzech zasadniczych problemów: - ocena ryzyka, czyli prawdopodobieństwo wystąpienia negatywnego oddziaływania danego czynnika na żywy organizm, - określenie jak wysoka jest jego toksyczność, poprzez wyznaczenie dawki wywołującej efekt toksyczny, - próba wykrycia odległych skutków ekspozycji organizmu na czynniki toksyczne, takie jak np.: mutageny, kancerogeny, czy też związki wykazujące właściwości teratogenne i/lub embriotoksyczne. Badania ekotoksykologiczne można prowadzić w dwojaki sposób [2]: - poprzez badania epidemiologiczne, polegające na obserwacji pewnej populacji ludzkiej narażonej na określone zanieczyszczenia środowiska, co umożliwia bezpośrednie oszacowanie ryzyka narażenia człowieka, - poprzez stosowanie metod laboratoryjnych prowadzonych z wykorzystaniem różnych modeli doświadczalnych i podjęcie próby wykorzystania uzyskanych wyników do oceny wielkości narażenia człowieka. W zależności od stosowanego modelu, metody laboratoryjne dotyczyć mogą badań toksyczności w stosunku do: - całego organizmu metody in vivo - wybranego narządu - hodowli komórek metody in vitro - reakcji enzymatycznych W przypadku przeprowadzania badań z wykorzystaniem prostych modeli doświadczalnych in vitro, jak i badań na zwierzętach otrzymuje się zależność między dawką (stężeniem) czynnika toksycznego a odpowiedzią biologiczną, czyli reakcją organizmu (lub badanego modelu) na tę dawkę. W badaniach toksykologicznych parametrem mierzonym jako odpowiedź biologiczna może być np. hamowanie wzrostu komórek, aktywność odpowiedniego enzymu, przyspieszony oddech osobnika, żywotność lub śmiertelność i inne. Na podstawie zależności: dawka – odpowiedź wyznaczyć można wartości wskaźników będące ilościową miarą toksyczności badanej substancji. Siłę toksycznego 669 Rozdział 32 oddziaływania na organizmy żywe określają takie wskaźniki jak EC25 lub EC50 (ang. Effective Concentration) oraz ED25 lub ED50 (ang. Effective Dose), czyli stężenie danej toksyny w środowisku lub jej dawka, która wywołuje określony efekt biologiczny w wysokości 25% lub 50% jego maksymalnej wartości. Innym stosowanym wskaźnikiem jest wskaźnik IC50 (ang. Inhibition Concentration) – czyli stężenie czynnika toksycznego w środowisku, które powoduje osłabienie (zahamowanie) o połowę danego procesu, np. wzrostu. W przypadku toksyczności ostrej występuje takie oddziaływanie danej substancji, które zaburza procesy biologiczne w takim stopniu, iż następuje śmierć. Miarą takiego efektu jest dawka śmiertelna - LD50 (ang. Lethal Dose), czyli dawka wywołująca po określonym czasie śmierć 50% osobników badanej populacji. Często stosuje się też parametr określający stężenie śmiertelne danej substancji w wodzie, glebie lub powietrzu – LC50 (ang. Lethal Concentration). Określenie toksyczności ostrej jest zwykle wstępnym etapem oceny oddziaływania danej substancji na organizm i pozwala ukierunkować dalsze badania toksyczności. Zależność dawka – efekt biologiczny może również służyć przewidywaniu poziomu ryzyka, tzn. wyznaczeniu dawki i czasu ekspozycji, przy których prawdopodobieństwo wystąpienia efektów toksycznych jest odpowiednio niskie. W tym celu szacowane są wartości stężeń lub dawek granicznych (progowych): - NOEL lub NOEC – najwyższa dawka lub stężenie substancji toksycznej, przy którym nie obserwuje się niekorzystnego efektu jej działania (ang. No Observed Effect Level/Concentration), - LOEL lub LOEC – najniższa dawka lub stężenie, przy którym zaobserwowano pierwsze niekorzystne zmiany (ang. Lowest Observed Effect Level/Concentration), - NOAEL - najwyższa dawka lub stężenie substancji, przy której w trakcie przeprowadzonych badań nie jest wykrywalna szkodliwa zmiana ( ang. No Observed Adverse Effect Level), - LOAEL - najniższa dawka lub stężenie substancji, przy której w trakcie przeprowadzanych badań zauważa się szkodliwą zmianę ( ang. Lowest Observed Adverse Effect Level). Zaobserwowane skutki działania toksyn dotyczyć mogą zmian w morfologii, życiowej działalności, wzrostu, rozwoju lub okresu życia badanych organizmów. Wyżej wymienione wskaźniki wyrażane są w mg lub µg danej substancji na 1 kg masy ciała organizmu i na 1 dobę. Parametr LOAEL jest stosowany wówczas, gdy nie znana jest wartość parametru NOAEL (przy odpowiednio zwiększonym współczynniku niepewności). Wyznaczenie minimalnego poziomu ekspozycji poprzez określenie wartości wyżej wymienionych wskaźników nie oznacza, że efekt toksyczny nie może wystąpić. Wartości progowe określa się bowiem z pewnym prawdopodobieństwem. Ponadto, w przypadku niektórych związków chemicznych, jakakolwiek dawka (stężenie) jest niedopuszczalna i nie można wówczas wyznaczyć wartości progowych. W celu dokonania oceny ryzyka wykorzystuje się również graniczne stężenia efektywne EC10 lub EC15, które wywołują dany efekt biologiczny odpowiednio na poziomie 10% lub 15% jego maksymalnej wielkości [3]. O efekcie toksycznym danej substancji chemicznej może decydować również jej mała podatność na metabolizm, co w połączeniu z właściwościami lipofilowymi znacznie utrudnia jej wydalanie powodując kumulację w organizmie. Oceny zdolności toksyny do kumulacji w organizmie można dokonać poprzez porównanie przykładowo wartości CLD50 (z ang. Cumulative Lethal Dose) z wartością parametru LD50. 670 Rozdział 32 Dłuższy czas obserwacji i opisowy charakter wyników charakteryzuje metody badania toksyczności podostrej (subletalnej) i przewlekłej (chronicznej). Dotyczą one całego organizmu i polegają na obserwacji procesów komórkowych i biochemicznych, funkcji fizjologicznych i zachowania się osobników. Z kolei po śmierci zwierząt przeprowadza się obserwacje zmian makro- i mikroskopowych w narządach, które zaszły podczas ekspozycji na toksynę. Dodatkowo, badanie toksyczności przewlekłej obejmuje tzw. zestaw badań specjalnych. Może bowiem wystąpić działanie kancerogenne (rakotwórcze) związku, polegające na zaburzeniu mechanizmu wzrostu tkanki, także działanie mutagenne – zmiana cech dziedzicznych spowodowana uszkodzeniem DNA, bądź też efekt embriotoksyczny i/lub teratogenny polegający na uszkodzeniu lub śmierci embrionu lub płodu. A. SPOSÓB PRZEPROWADZANIA OCENY NARAŻENIA CZŁOWIEKA NA TOKSYCZNE DZIAŁANIE SUBSTANCJI Zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 18 lutego 2003 r. (Dz. U. Nr 52, poz. 467, załącznik nr 1), w procesie oceny ryzyka dla zdrowia człowieka z uwagi na toksyczne działanie substancji uwzględnia się następujące rodzaje szkodliwego działania [4]: 1) ostre działanie toksyczne - w tym przypadku określa się wartości LD50 lub LC50 lub, w przypadku wykonania badań metodą dawki ustalonej, wartość dawki różnicującej (dawka różnicująca jest dawką, która powoduje wyraźne działanie toksyczne, bez skutków śmiertelnych, w jednym z czterech poziomów dawki, określonych z wykorzystaniem odpowiedniej metody badania toksyczności (5, 50, 500 lub 2.000 mg/kg masy ciała) [5]), 2) działanie drażniące 3) działanie żrące 4) działanie uczulające ustala się, czy substancja ma zdolność do wywierania takiego działania, 5) przewlekłe działanie toksyczne - określa się zależność dawka - odpowiedź i wartość parametru NOAEL; jeżeli nie można określić wartości NOAEL, określa się wartość parametru LOAEL, ustala się, czy substancja ma zdolność do wywierania takiego działania; w przypadkach gdy można wykazać, 6) działanie mutagenne że substancja, zidentyfikowana jako substancja o działaniu rakotwórczym, nie działa genotoksycznie, 7) działanie rakotwórcze celowe jest ustalenie wartości parametrów NOAEL lub LOAEL. 8) szkodliwe działanie na rozrodczość - określa się zależność dawka - odpowiedź i wartość parametru NOAEL; jeżeli nie można określić wartości NOAEL, określa się wartość parametru LOAEL. Następnie porównuje się wyżej wymienione wartości parametrów NOAEL lub LOAEL z oszacowaną wielkością dawek lub stężeń, na które będą narażone populacje (oblicza się stosunek poziomu narażenia do wartości parametrów NOAEL lub LOAEL). 671 Rozdział 32 B. SPOSÓB PRZEPROWADZANIA OCENY ZAGROŻENIA DLA ŚRODOWISKA Zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 18 lutego 2003 r. (Dz. U. Nr 52, poz. 467, załącznik nr 3), odnośnie sposobu dokonywania oceny ryzyka dla środowiska, celem oceny zależności dawka (stężenie) – odpowiedź biologiczna jest oszacowanie stężenia substancji w określonych elementach lub przedziałach środowiska, poniżej którego nie należy spodziewać się wystąpienia szkodliwych zmian w środowisku [4]. Stężenie takie określa się jako przewidywane stężenie niepowodujące zmian w środowisku (ang. Predicted No Effect Concentration – PNEC ). Wartość parametru PNEC oblicza się, wprowadzając odpowiedni współczynnik szacowania (ang. Uncertainty Factor – UF ) do wyników badań (przeprowadzonych na organizmach żywych) takich jak: LD50, LC50, EC50, IC50, NOEL lub NOEC, LOEL lub LOEC, lub inne odpowiednie wyniki badań. Następnie porównuje się wartości parametru PEC, czyli wartość prognozowanego stężenia substancji w środowisku (ang. Predicted Effect Concentration) z wartością parametru PNEC. Na podstawie wartości stosunku PEC/PNEC wnioskuje się m.in. czy dotychczas podejmowane działania w celu ograniczenia ryzyka są wystarczające. 3. PODZIAŁ METOD BIOLOGICZNYCH W BADANIACH ŚRODOWISKA WYKORZYSTYWANYCH Metody analityczne wykorzystujące materiał biologiczny stanowią coraz poważniejszą konkurencję dla klasycznych metod analitycznych głównie dzięki swojej specyficzności, szybkości i możliwości zastosowania in situ i w układzie on-line. Ich zastosowanie umożliwia dokonanie sumarycznego pomiaru obciążenia próbki przez zanieczyszczenia różnego w skomplikowanych, złożonych matrycach środowiskowych bez praco- i czasochłonnych etapów wstępnego przygotowania pobranych próbek [6]. Ogólnie rzecz biorąc wyróżnia się dwie grupy zastosowań metod biologicznych [7]: - biomonitoring, który może być realizowany w dwojaki sposób: - w oparciu o typowe badania analityczne próbek materii ożywionej (bioty) traktowanych jako tzw. pasywne próbniki akumulacyjne dla zanieczyszczeń, - poprzez obserwację biowskaźników (odpowiednich organizmów roślinnych i zwierzęcych); - bioanalityka, która jest związana z wykorzystaniem substancji aktywnych biologicznie jako receptorów określonych zanieczyszczeń. Ze względu na sposób wykorzystania składnika biologicznego można mówić o: - bioczujnikach, gdy składnik aktywny biologicznie (bakterie, wirusy, enzymy, przeciwciała, itd.) stanowi część aktywną odpowiedniego czujnika. - biotestach, gdy materiał biologiczny stanowi „oryginalne” urządzenie kontrolno - pomiarowe. Obserwuje się gwałtowny rozwój metod biologicznych i to zarówno biorąc pod uwagę aspekty metodologiczne, jak i praktyczne. Podejmowane są również próby klasyfikacji tych metod, jednakże na razie można mówić o zamieszaniu terminologicznym co prowadzi do wielu nieporozumień. Biotest (gr. bios - życie + łac. testari = świadczyć), można zdefiniować jako eksperymentalną próbę biologiczną, której celem jest wykazanie obecności substancji toksycznych w środowisku albo poznaniu jej szkodliwości poprzez ilościowe oszacowanie wpływu tej substancji na żywy organizm (na podstawie porównania 672 Rozdział 32 z próbą kontrolną). Pomiar toksyczności jest bowiem jeszcze jednym przykładem pomiaru względnego tak powszechnego w dziedzinie klasycznej analityki chemicznej. 4. SPOSOBY PRZEPROWADZANIA BADAŃ Z WYKORZYSTANIEM BIOTESTU W literaturze spotyka się informacje na temat trzech głównych sposobów przeprowadzania badań z wykorzystaniem biotestu, w celu uzyskania danych o stopniu skażenia danego elementu środowiska: 1A. testy toksyczności realizowane w laboratorium, podczas których substancja toksyczna jest sztucznie wprowadzana do czystej wody lub osadu. Przeprowadzenie takiego testu może być źródłem informacji na temat toksyczności danej substancji w kontrolowanych warunkach. Wykonywany jest w celu przeprowadzenia wzorcowania biotestu, który następnie zostanie wykorzystany do oszacowania toksyczności próbek rzeczywistych [8, 9, 10]. 1B. testy toksyczności prowadzone w laboratorium na bazie pobranych próbek rzeczywistych (woda, gleba i osady). Toksyczność takich próbek jest porównywana z toksycznością próbek wzorcowych [11, 12, 13, 14]. 2. testy przeprowadzane in situ, z wykorzystaniem populacji organizmów żyjących w warunkach naturalnych [15, 16, 17, 18]. Podstawowych informacji na temat skażenia danego elementu środowiska dostarczają biotesty realizowane z wykorzystaniem pojedynczego gatunku roślinnego lub zwierzęcego (ang. single species tests), reprezentującego określony poziom troficzny. Testy te przeprowadzane są według znormalizowanych procedur, w określonych warunkach laboratoryjnych - optymalnych dla danego organizmu testowego [11, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. W celu dokładniejszego zbadania skomplikowanego zjawiska interakcji potencjalnie toksycznych związków chemicznych z organizmami zasiedlającymi określone ekosystemy przeprowadza się niekiedy eksperymenty w mikrosystemach (ang. microcosm). W tym przypadku do dużych (kilkuset litrowych) naczyń wprowadza się zespoły organizmów [25, 26, 27]. W trakcie prowadzenia takich badań symulowane są warunki, które w sposób naturalny dominują w badanym elemencie środowiska. Mikrosystemy mogą być źródłem informacji o wpływie substancji toksycznych zarówno na poszczególne gatunki, poziomy troficzne, jak i całą społeczność organizmów. Jeszcze rzadziej wpływ toksyn na populacje gatunków roślinnych i/lub zwierzęcych, ich strukturę i funkcjonowanie bada się w kosztownych mezosystemach – izolowanych wycinkach jeziora lub sztucznych strumieniach (ang. mesocosm), do których w sposób kontrolowany doprowadza się związki chemiczne. Układy te poddawane są naturalnej zmienności warunków środowiskowych (wiatry, temperatura, nasłonecznienie) [27, 28, 29, 30, 31]. Według innej klasyfikacji [32], biotesty realizowane być mogą w warunkach: - statycznych, gdy badana woda lub osad nie podlega wymianie w trakcie trwania testu [8, 10, 33, 34, 35]; - półstatycznych, gdy wymiana medium następuje w określonych odstępach czasowych (np. co 24 godziny, raz na tydzień), w ten sposób realizowane są testy z wykorzystaniem skorupiaka Daphnia magna [11, 12, 13, 14, 36]; - dynamicznych – przy stałej wymianie wody, podczas testów przeprowadzanych w mezosystemach, in situ, głównie z wykorzystaniem ryb jako czynnika biologicznego [29, 30]. 673 Rozdział 32 Biotesty wykorzystywane w praktyce analitycznej można oczywiście sklasyfikować ze względu na rodzaj organizmu, który stanowi element aktywny testu. Najczęściej wykorzystywane są następujące organizmy: - rośliny, - bakterie, - organizmy zwierzęce. 5. TESTY BAKTERYJNE Biotesty stanowią ważny element bioanalityki i biomonitoringu, czyli tej „gałęzi” analityki chemicznej, która przeżywa obecnie okres gwałtownego rozwoju. Bioluminescencja morskich bakterii Vibrio fischeri (formalnie: Photobacterium phosphoreum) znalazła szerokie zastosowanie w testach toksyczności. Biotesty takie stanowią użyteczne narzędzie wykorzystywane do oceny stopnia zanieczyszczenia wód [22, 37, 38, 39, 40, 41, 42], osadów dennych [21, 43] i gleb [44]. Toksyczność każdego z tych ekosystemów jest określana na podstawie pomiaru bioluminescencji bakterii, które w trakcie swoich funkcji życiowych emitują światło [45]. Pomiaru luminescencji dokonuje się przed i po inkubacji zawiesiny bakteryjnej z badaną próbką. Mechanizmy toksycznego działania poszczególnych związków chemicznych są odmienne i niezwykle złożone. Zgodnie z dostępnymi informacjami toksyczność może wynikać z [46]: - oddziaływania toksyny z receptorami komórkowymi, - przerwania funkcji membrany komórkowej, - reakcji chemicznych z elementami składowymi komórki, - hamowania/współzawodnictwa systemów enzymatycznych. Dodatkowo wzajemne reakcje (antagonistyczne i synergistyczne) zachodzące między substancjami chemicznymi mogą istotnie wpływać na wynik testu [47, 48]. Również stosowanie odczynników w celu poprawy rozpuszczalności związków trudno rozpuszczalnych może zmienić rzeczywistą toksyczność próbki [49]. Niektóre substancje mogą pośrednio wpływać na uszkodzenia komórek bakteryjnych, wskutek własnej dysocjacji i rozkładu w środowisku wodnym do produktów bardziej toksycznych. W drodze jonizacji mogą powstawać roztwory wysoce kwaśne lub alkaliczne, których wartość pH będzie główną przyczyną toksyczności. Z kolei po dodaniu buforu do roztworu, ta sama substancja może okazać się nietoksyczna [50]. Obecnie do najczęściej stosowanych urządzeń dostępnych handlowo, opartych na wykorzystaniu zjawiska bioluminescencji bakterii Vibrio fischeri, należą: - ToxAlert ®10 (Merck), - ToxAlert ®100 (Merck), - Microtox® (Azur Environmental), - LUMIStox® (Dr. Bruno Lange). Jak wynika z przeprowadzonych badań dane o toksyczności uzyskane dla tych samych związków, a przy użyciu różnych komercyjnie dostępnych testów, wykazują pewne rozbieżności [51]. Mogą one wynikać z różnic w procedurach analitycznych poszczególnych testów, składu stosowanych reagentów i sposobu przygotowania bakterii przez producenta (ang. liquid-dried lub freeze-dried). Dlatego istotne jest wykonanie przy każdej serii badań testu dla roztworu kontrolnego [Zn++] w postaci siedmiowodnego siarczanu cynku. Zalecany przez producenta w przybliżeniu 50% spadek natężenia bioluminescencji bakterii, po 30 minutach inkubacji, powinien nastąpić dla stężeń [Zn++] w zakresie od 2,11 do 25,0 mgl-1 (w zależności od typu stosowanego testu). 674 Rozdział 32 6. TESTY OPARTE NA WYKORZYSTANIU ROŚLIN W przypadku testów toksyczności opartych na wykorzystaniu roślin (fitotesty) jako czynnika aktywnego zastosowanie znajdują glony (zielenice, sinice, okrzemki), rzęsa wodna i ukorzenione makrofity (roślina i jej nasiona) wodne i lądowe. Reprezentują one organizmy o szczególnym znaczeniu dla swoich siedlisk naturalnych: dostarczają tlen, zapewniają obieg substancji organicznych, kontrolują jakość wody oraz równowagę gleby i osadów dennych. Zapewniają pożywienie, schronienie i siedlisko życia innym organizmom: insektom, bezkręgowcom, rybom, płazom, ptakom i ssakom [52, 53]. Zmiany zachodzące w roślinach mogą bezpośrednio wpływać za strukturę i funkcjonowanie całego ekosystemu. Niekorzystny wpływ pestycydów (zwłaszcza herbicydów) na rośliny wzbudza szczególne zainteresowanie ze względu na ich powszechne i rosnące stosowanie, a w efekcie rozległe zanieczyszczenie wód powierzchniowych i gruntowych. Przez lata popularnym sposobem wykorzystaniem roślin do oceny jakości środowiska wodnego był biomonitoring in situ. Rośliny wodne stosowano również do usuwania zawiesin, metali ciężkich, składników odżywczych (azotu i fosforu), toksycznych związków organicznych, jak i bakterii z odcieków powstających podczas odwadniania kopalni, składowisk odpadów, pól uprawnych i kanalizacji burzowych [52]. Dopiero niedawno znalazły one zastosowanie (w postaci fitotestów) do oceny zagrożenia wynikającego z zanieczyszczenia środowiska wodnego. Tego aspektu dotyczyć będzie dalsza część rozdziału. W literaturze dostępnych jest wiele informacji na temat bioakumulacji zanieczyszczeń chemicznych przez algi i makrofity. Rośliny te znalazły szerokie zastosowanie jako biowskaźniki in situ w kontroli jakości wody ze względu na ich zdolność akumulacji związków chemicznych, jak i fakt, że pod względem biomasy stanowią znaczną immobilną część środowiska wodnego. Ukazało się obszerne opracowanie dotyczące wykorzystania alg jako podstawy biotestów służących określeniu zawartości miedzi w środowisku [3]. Prowadzono również badania odnośnie wchłaniania przez algi takich metali jak Mn6+, Mo6+, Ni2+, V5+ [54]. A. ZASTOSOWANIE ALG JAKO ELEMENTU AKTYWNEGO FITOTESTÓW Wybór gatunku glonu do danego testu zależy od jego dostępności, wymagań hodowli i łatwości użycia. Na podstawie tych kryteriów zaleca się stosowanie mikroalg (w postaci mikrobiotestu), wśród których dwa najczęściej testowane gatunki należą do rodziny zielenic. Są to algi Selenastrum capricornutum [55] oraz Scenedesmus quadricauda i S. subspicatus [56]. Sinice i okrzemki są rzadziej stosowane ze względu na ich powolny wzrost i wymagające warunki hodowli. W literaturze opisuje się zastosowanie cytometrii przepływowej w przypadku testów opartych na wykorzystaniu mikroalg [57]. Stanowi ona szybką metodę pomiaru ilości komórek w przepływającym medium, umożliwiając pominięcie ograniczeń metody tradycyjnej. Do ograniczeń tych zalicza się: - wysoką, niemożliwą do osiągnięcia w warunkach naturalnych gęstość komórek, co prowadzi do starzenia się gatunku; - brak technik umożliwiających liczenie komórek i jednoczesne rozróżnienie pomiędzy komórkami żywymi a martwymi, a także materią zawieszoną; - niemożność wyznaczenia w czasie więcej niż jednego parametru charakteryzującego dany gatunek; - niemożność uzyskania informacji o mechanizmie toksycznego działania zanieczyszczeń. 675 Rozdział 32 Mikroalgi z powodzeniem są stosowane w cytometrii przepływowej ze względu na ich budowę (pojedynczych komórek) i zawartość fotosyntetycznego barwnika – chlorofilu a, wzbudzanego pod wpływem światła niebieskiego. Ponieważ w środowisku wodnym na populację alg rzadko składają się organizmy jednego gatunku (z wyjątkiem zakwitów wodnych), zastosowanie cytometrii przepływowej umożliwia rozdzielenie poszczególnych gatunków na podstawie odbieranego sygnału - fluorescencji, a tym samym realizację biotestów funkcjonujących w oparciu o kilka gatunków. W literaturze przedstawiono wiele badań służących porównaniu wyników uzyskanych w oparciu o testy przeprowadzone z wykorzystaniem jednego gatunku i kilku jednocześnie wobec tej samej substancji toksycznej [54, 55, 58, 59]. Inną techniką przeprowadzania testów z wykorzystaniem mikroalg jest ich unieruchomienie na specjalnym podłożu (immobilizacja). Tak przygotowane hodowle utrzymują stałość procesów oddychania i fotosyntezy, a po 12 miesiącach przechowywania ich w ciemności i temperaturze 4°C powracają do normalnego wzrostu. Dotychczas immobilizowane komórki alg stosowano głównie w procesach oczyszczania wód ściekowych z metali ciężkich, związków azotu i fosforu. Ostatnio rozpoczęto badania nad ich wykorzystaniem do kontroli jakości wody stosowanej podczas hodowli ryb [56]. Immobilizacja zapobiega tu wymyciu komórek alg i spożyciu przez zwierzęta roślinożerne. W tabeli 1 przedstawiono zastosowanie wybranych gatunków alg w testach służących do oceny toksyczności próbek środowiskowych. B. ZASTOSOWANIE ROŚLIN AKTYWNEGO FITOTESTÓW NACZYNIOWYCH JAKO ELEMENTU Badanie toksyczności z wykorzystaniem testów opartych na wykorzystaniu roślin naczyniowych przeprowadza się głównie w stosunku do pestycydów, wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) i metali ciężkich. Informacje literaturowe na temat wykorzystania wybranych gatunków roślin jako elementu aktywnego odpowiednich biotestów zestawiono w tabeli 2. 1. Rzęsa wodna Makrofity niezwykle rzadko znajdują zastosowanie w testach toksyczności. Jeśli jednak w literaturze napotyka się na tę grupę roślin, to przedstawione badania najczęściej dotyczą rzęsy wodnej (Lemna minor i L. gibba) - gatunku reprezentatywnego dla wszystkich roślin naczyniowych. Rzęsa wodna jest gatunkiem swobodnie pływającym, nie zakorzenionym w podłożu. Jej małe rozmiary, łatwość hodowli i krótki czas rozmnażania (dwukrotny wzrost liczebności następuje w ciągu 1-4 dni) decydują o wykorzystaniu jej jako materiału biologicznego. Względna wrażliwość różnych gatunków rzęs, jak również wrażliwość rzęs względem alg i innych gatunków roślin wodnych nie została dotychczas jednoznacznie określona. W badaniach opisanych w literaturze żaden z testowanych gatunków: rzęsa drobna (Lemna minor) i alga (Selenastrum capricornutum), nie wykazał zdecydowanej wrażliwości [33, 70]. Badania licznej grupy gatunków alg i makrofitów w stosunku do herbicydów świadczą o ich porównywalnej wrażliwości [34]. Rzęsa garbata wykazała podobną wrażliwość na wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne w testach porównawczych z wywłócznikiem kłosowym [71]. 676 Tabela 1. Rodzina zielenice Zastosowanie wybranych gatunków alg w testach służących do oceny toksyczności próbek środowiskowych. Gatunek Parametr mierzony i wielkość oznaczana Hamowanie wzrostu, EC50 Selenastrum capricornutum (inne nazwy: Pseudokirchneriella subcapitata, Hamowanie Raphidocelis wzrostu, subcapitata) EC10 EC50 Hamowanie wzrostu, EC50 Fluorescencja, EC10 Liczba komórek, fluorescencja, EC10, EC50, LOEC, TU10 Czas trwania testu Liczba powtórzeń 3 dni 6 ISO 8692 (1989) 1 ISO/DIS 8692 (1987) ISO 8692 (1989) 7 dni 1 dzień 1, 2 dni 1, 2 dni 6 (próba kontrolna), 1 (próba właściwa) 3 (warunki statyczne) 2 (warunki dynamiczne) 3 6 (próba kontrolna), 3 (próba właściwa) Organizacja zalecająca/ pierwotne źródło US EPA (1985) [83] ISO 8692 (1989) 677 Zastosowanie Porównanie selektywności i wrażliwości różnych gatunków alg w stosunku do herbicydów i związków nieorganicznych metali Wpływ działalności rolniczej na jakość wody rzecznej (Japonia) Określenie toksyczności antybiotyków stosowanych na farmach zwierzęcych Odnośnik literaturowy [60] [20] [55] Porównanie wrażliwości glonu w stosunku do toksycznych metali w oparciu o hodowlę prowadzoną w warunkach statycznych i dynamicznych. [61] Ocena toksyczności gleb zanieczyszczonych przez związki z grupy WWA Wpływ działalności rolniczej na jakość wód powierzchniowych (Tailandia) [62] [63] Tabela 1. c.d. Rodzina Gatunek Scenedesmus quadricauda Scenedesmus subspicatus (nowa nazwa: Desmodesmus subspicatus) Parametr mierzony i wielkość oznaczana Stężenie chlorofilu, EC20, TDS (z ang. total dissolved solids) Hamowanie wzrostu, EC50 Hamowanie wzrostu, zmiana tempa oddychania, stężenie całkowite chlorofilu, stężenie chlorofilu a, stężenie chlorofilu b, EC50 Hamowanie wzrostu, EC50 stężenie chlorofilu a Czas trwania testu Liczba powtórzeń 1, 2, 3 dni 3 3 dni 6 12 dni 3 nie określono 3 dni 6 ISO 8692 (1989) 2, 7, 14 dni 3 ISO 8692 (1989) Organizacja zalecająca/ pierwotne źródło nie określono OECD (1984) 678 Zastosowanie Odnośnik literaturowy Wpływ działalności kopalni cynku i złota na jakość wód słodkich (Alaska) [37] Porównanie selektywności i wrażliwości różnych gatunków alg w stosunku do herbicydów i związków nieorganicznych metali Wchłanianie metali (Cu+, Cu2+, Mn6+, Mo6+, Ni2+, V5+) [60] Porównanie selektywności i wrażliwości różnych gatunków alg w stosunku do herbicydów i związków nieorganicznych metali Ocena jakości wody rzecznej z wykorzystaniem biotestu in situ (Szkocja) [60] [54] [64] Tabela 1. c.d. Rodzina Gatunek Stichococcus bacillaris Chlamydomonas reinhardtii Chlorella kessleri Parametr mierzony i wielkość oznaczana Liczba komórek, hamowanie wzrostu, EC50 Biomasa, fluorescencja Hamowanie wzrostu, EC50 Hamowanie wzrostu, EC50 Hamowanie wzrostu, EC50 fotosynteza, stężenie chlorofilu, Hamowanie wzrostu, EC50 Czas trwania testu Liczba powtórzeń 1, 2, 3 dni 6 (próba kontrolna), 3 (próba właściwa) 1, 2, 3 dni 6 (próba kontrolna), 3 (próba właściwa) 4 7 dni Organizacja zalecająca/ pierwotne źródło ISO 8692 (1989) Zastosowanie Wpływ obecności związków absorbujących światło na zahamowanie procesu wzrostu alg DIN 38412 - part Wpływ stężenia składników odżywczych (azotu i fosforu) na 33 proces wzrostu alg (1989) Odnośnik literaturowy [65, 66] [19] ISO (1989) Uzyskanie danych dotyczących toksyczności fluorantenu i jego metabolitów [59] Porównanie selektywności i wrażliwości różnych gatunków alg w stosunku do herbicydów i związków nieorganicznych metali Porównanie selektywności i wrażliwości różnych gatunków alg w stosunku do herbicydów i związków nieorganicznych metali Ocena toksyczności odcieków ze składowisk odpadów niebezpiecznych zdeponowanych w kopalniach soli [60] Porównanie selektywności i wrażliwości różnych gatunków alg w stosunku do herbicydów i związków nieorganicznych metali [60] 3 dni 6 OECD (1984) 3 dni 6 OECD (1984) 4h 3 nie określono 3 dni 6 OECD (1984) 679 [60] [67] Tabela 1. c.d. Rodzina Gatunek Dunaliella tertiolecta okrzemki Skeletonema costatum Krasnorosty Ceramium strictum, Ceramium tenuicorne (inna nazwa: C. gobii) Parametr mierzony i wielkość oznaczana AGP (z ang. algal growth potential) Liczba komórek, fluorescencja, hamowanie wzrostu EC10, EC50, EC90 SMA: długość (mierzona od pierwszej do ostatniej gałęzi); CIA: liczba komórek, powierzchnia komórek, długość (wszystkich gałęzi); w obu metodach: EC10, EC20, EC25, EC50 Czas trwania testu Liczba powtórzeń 4 dni 3 1 ,2, 3 dni 7 dni Organizacja zalecająca/ pierwotne źródło US EPA (1974) 6 (próba kontrolna), 3 (próba właściwa) ISO 102 53 (1995) SMA: 6 (próba kontrolna), 4 (próba właściwa); CIA: 6 (próba kontrolna), 5 (próba właściwa) nie określono 680 Zastosowanie Odnośnik literaturowy Ocena jakości morskich wód przybrzeżnych z wykorzystaniem mikrobiotestu (Włochy) [68] Ocena wrażliwości okrzemek w odniesieniu do zaleceń OSPAR (Oslo and Paris Commissions) [58] Rowinięcie metodyki dwóch biotestów opartych na wykorzystaniu makroalg: SMA (z ang. stereo microscope analysis) i CIA (z ang. computer image analysis) [69] Rodzina sinice DIN ISO OECD US EPA Gatunek Synechococcus leopoliensis (Anacystis nidulans) Microcystic aeruginosa Parametr mierzony i wielkość oznaczana Hamowanie wzrostu, EC50 Hamowanie wzrostu, EC50 Czas trwania testu Liczba powtórzeń 4 dni 6 7 dni 6 (próba kontrolna), 1 (próba właściwa) Organizacja zalecająca/ pierwotne źródło OECD (1984) ISO (1989) Deutsches Institut für Normung International Standard Organization, Genewa, Szwajcaria Organization for Economic Co-operation and Development United States, Environmental Protection Agency 681 Zastosowanie Odnośnik literaturowy Porównanie selektywności i wrażliwości różnych gatunków alg w stosunku do herbicydów i związków nieorganicznych metali [60] Określenie toksyczności antybiotyków stosowanych na farmach zwierzęcych [55] Rozdział 32 2. Rośliny zakorzenione Zakorzenione rośliny submersyjne i emersyjne niezwykle rzadko znajdują zastosowanie w testach toksyczności. Duże rozmiary, powolny wzrost i brak ustalonych metod przeprowadzania testów przyczyniły się do sporadycznego ich stosowania w formie materiału biologicznego. W literaturze spotkano informacje o wykorzystaniu wywłócznika kłosowego (Myriophyllum spicatum) i różnolistnego (M. hydrophyllum). Rośliny mogą być hodowane w laboratorium lub pozyskiwane do testów z naturalnych źródeł. Opis warunków hodowli wybranych gatunków submersyjnych makrofitów w naturalnych osadach przedstawiono w pracy [72]. 7. TESTY OPARTE ZWIERZĘCYCH NA WYKORZYSTANIU ORGANIZMÓW Na podstawie zebranych danych literaturowych można stwierdzić, iż testy toksyczności ostrej z wykorzystaniem gatunków organizmów zwierzęcych przeprowadza się znacznie częściej niż fitotesty. Jedynie 10% wszystkich dotychczas uzyskanych danych na temat toksyczności stanowią wyniki testów roślinnych. Według informacji zawartych w bazie danych AQUIRE (ang. Aquatic Toxicity Information Retrieval) wśród dwudziestu najczęściej opisywanych organizmów testowych, zielenica – pierwszy wspomniany gatunek roślinny, pojawia się dopiero na trzynastym miejscu. Dotychczas gatunki roślinne uważane były za mniej wrażliwe w stosunku do substancji chemicznych niż organizmy zwierzęce. Takie stanowisko nie zostało jednak dotąd poparte jednoznacznymi wynikami badań. Ustalono natomiast, iż względna wrażliwość roślin i zwierząt zależy istotnie od warunków środowiska: materii organicznej, pH, temperatury, zasadowości, twardości, obecności ligandów i wzajemnych oddziaływań substancji toksycznych. Przeprowadzane badania mające na celu porównanie wrażliwości roślin i zwierząt opisane zostały w licznych publikacjach [78, 79, 80, 81]. W tabeli 3 przedstawiono zastosowanie wybranych gatunków organizmów zwierzęcych w testach służących do oceny toksyczności próbek środowiskowych. Podziału organizmów dokonano zgodnie z klasyfikacją zaproponowaną w pracy [82]. 8. NOWE TENDENCJE W ZAKRESIE WYKORZYSTANIA BIOTESTÓW W BADANIACH ŚRODOWISKOWYCH W literaturze pojawia się coraz więcej informacji dotyczących: - badań nad opracowaniem nowych typów biotestów, - wprowadzania do praktyki analitycznej handlowo dostępnych biotestów, - nowych zastosowań znanych typów biotestów. Pojawiają się również informacje o nowych kierunkach rozwojowych w zakresie biotestów. Najważniejsze z nich zostaną omówione poniżej. 682 Tabela 2. Zastosowanie wybranych gatunków roślin naczyniowych w testach służących do oceny toksyczności próbek środowiskowych. Gatunek Rzęsa drobna (Lemna minor) Rzęsa garbata (Lemna gibba) Parametr mierzony i wielkość oznaczana Liczba liści, biomasa Liczba liści, stężenie chlorofilu a, stężenie chlorofilu b, hamowanie wzrostu, EC50 Czas trwania testu Liczba powtórzeń Warunki Organizacja zalecająca/ pierwotne źródło 96 h 3 statyczne APHA (1985) 8 dni 3 statyczne ASTM (1998) nie określono Rogatek sztywny Przyrost (Ceratophyllum masy demersum), moczarka kanadyjska (Elodea canadensis), wywłócznik różnolistny (Myriophyllum mokrej 14 dni 3 statyczne 683 nie określono Zastosowanie Odnośnik literaturowy Porównanie względnej wrażliwości rzęsy drobnej i zielenicy w stosunku do szesnastu herbicydów Wpływ działalności rolniczej na jakość wody rzecznej (USA) Porównanie wrażliwości rzęsy garbatej w stosunku do wielopierścieniowych węglowodorów aroma-tycznych [34, 70] Określenie zagrożenia spowodowanego występowaniem w strumieniach wód pestycydów dla żyjących w nich organizmów wodnych (USA) Porównanie względnej wrażliwości pięciu gatunków makrofitów i sześciu gatunków alg w stosunku do czterech herbicydów [73] [33] [71] [34] Tabela 2. c.d. Gatunek heterophyllum), jezierza (Najas) Wywłócznik kłosowy (Myriophyllum spicatum) Sałata zwyczajna (Lactuca sativa) Trawa (Lolium perene) rzodkiew zwyczajna (Raphanus sativum) Parametr mierzony i wielkość oznaczana Czas trwania testu Liczba powtórzeń Warunki Organizacja zalecająca/ pierwotne źródło Długość pędów, liczba węzłów pędu głównego i bocznych, liczba i długość korzeni stężenie chlorofilu a, stężenie chlorofilu b, hamowanie wzrostu, EC50 Hamowanie wzrostu korzeni, IC50 12 dni 3 statyczne ASTM (1998) Porównanie wrażliwości rzęsy garbatej w stosunku do związków z grupy WWA [71] 120 h 3 statyczne NWRI [74, 75] Hamowanie wzrostu, liczba roślin, sucha masa 14 dni 4 statyczne OECD Porównanie wyników testów uzyskanych w trakcie badań międzylaboratoryjnych przez laboratoria WaterTox Network; w dalszej części: ocena jakości wody pitnej Ocena toksyczności i mobilności metali ciężkich w piaszczystej glebie (Belgia) 684 Zastosowanie Odnośnik literaturowy [76] Tabela 2. c.d. Parametr Czas Organizacja mierzony i Liczba Gatunek trwania Warunki zalecająca/ wielkość powtórzeń testu pierwotne źródło oznaczana Wierzba Hamowanie 336 h/ (Salix viminalis x wzrostu, 381,5 h/ nie określono schwerinii) transpiracja, 361,5 h zużycie wody APHA American Public Health Association ASTM American Society for Testing and Materials NWRI National Water Research Insitute, Burlington, Ontario, Kanada OECD Organization for Economic Co-operation and Development 685 Zastosowanie Ocena toksyczności gleb zanieczyszczonych przez związki z grupy WWA (Dania) Odnośnik literaturowy [77] Rozdział 32 A. ZESPOŁY (BATERIE) BIOTESTÓW Wybór odpowiedniego biotestu do badań toksyczności zależy od rodzaju wymaganych informacji, stanu oraz własności fizycznych i chemicznych analizowanej próbki, rodzaju badanej substancji toksycznej, a także od wrażliwości gatunku testowanego organizmu. W przypadku zastosowania testu, w którym wykorzystuje się tylko o jeden gatunek organizmu żywego jako elementu aktywnego odpowiedniego biotestu, oszacowana toksyczność odzwierciedla wrażliwość wyłącznie organizmów tego jednego testowanego gatunku. Postępowanie takie obarczone jest ryzykiem popełnienia błędu ujemnego (niedoszacowania) wyniku toksyczności badanej substancji w odniesieniu do całego ekosystemu. Ryzyko to można zmniejszyć poprzez stosowanie baterii (zespołu) biotestów, których działanie oparte jest na wykorzystaniu organizmów o różnej wrażliwości i reprezentujących różne poziomy troficzne. Podejście takie jest stosowane często podczas badań skomplikowanych mieszanin związków o nieznanych właściwościach. Porównania wzajemnej wrażliwości gatunków organizmów tworzących baterię można dokonać na podstawie wartości parametru „w” obliczonej wg poniższego wzoru [78]: NOEC x (1) w= NOEC średnie gdzie: NOEC x - stężenie substancji toksycznej, przy którym nie obserwuje się niekorzystnego efektu jej działania (ang. No Observed Effect Concentration), otrzymane w wyniku zastosowania badanego testu; NOEC średnie - średnia arytmetyczna wartości NOEC, obliczona na podstawie wszystkich tworzących baterię testów. Na podstawie wartości parametru „w” wnioskuje się o czułości biotestu. Jeśli wartość „w” obliczona dla danego testu jest mniejsza od jedności (w<1), to organizmy stosowane w tym teście charakteryzuje wysoka względna wrażliwość w stosunku do badanej substancji toksycznej. 686 Tabela 3. mięczaki pierścienice pierwotniaki Taxon Zastosowanie wybranych gatunków zwierząt w testach służących do oceny toksyczności próbek środowiskowych.. Gromada Gatunek równorzęse Tetrahymena pyriformis skąposzczety dżdżownica (Tubifex tubifex, Limnodrilus hoffmeisteri) Pijawka lecznicza (Hirudo medicinalis L.) pijawki małże (blaszkoskrzelne) Postać larwalna małży - glochidium (Anodonta cygnea zellensis) Parametr Czas mierzony i trwania wielkość testu oznaczana Liczba komórek, 46 h hamowanie wzrostu, EC50 Stężenie substancji w tkance i osadzie, BAF, BSAF Ruchliwość, liczba osobników unikających kontaktu z próbką, zmiana kształtu ciała, apetyt żywotność statyczne Organizacja zalecająca/ pierwotne źródło nie określono 12 dni statyczne nie określono 7/ 21 dni statyczne 24/ 48/ 72 h statyczne 687 Warunki Zastosowanie Odnośnik literaturowy Rozwinięcie metodyki przeprowadzania kilkupokoleniowego testu polegającego na hamowaniu wzrostu pierwotniaków Bioakumulacja lindanu i hexachlorobenzenu w warunkach laboratoryjnych [35] nie określono Ocena toksyczności wody w jeziorze, osadów dennych i modelowej mieszaniny metali ciężkich na podstawie obserwacji zmian zachowania pijawek (Litwa) [9] nie określono Wpływ pH i twardości wody na toksyczność Cd, Cu i Zn dla larwy małży słodkowodnej (glochidium) [10] [8] Tabela 3. c.d. Taxon Gromada Gatunek Racicznica zmienna (Dreissena polymorpha) Sphaerium fabale Corbicula fluminea stawonogi skorupiaki rozwielitka (Daphnia magna) Parametr mierzony i wielkość oznaczana Śmiertelność, masa sucha, masa muszli, indeks gruczołów płciowych (w skali od 0 do 5) Długość osobnika, hamowanie wzrostu, śmiertelność, liczebność potomstwa Masa mokra, stężenie metalotioneiny Czas trwania testu Warunki 2 miesiące Dynamiczne 70 – 135 dni Dynamiczne 21/ 49/ 85/ 120/ 150 dni Liczebność potomstwa, śmiertelność 21 dni Ruchliwość, EC50 24/ 48 h 688 Organizacja zalecająca/ pierwotne źródło nie określono Zastosowanie Odnośnik literaturowy Określenie genotoksyczności wód rzecznych na podstawie hamowania mikronuklei (MN), test in situ (Francja, Belgia, Luksemburg, Niemcy) [15] nie określono Zastosowanie dwóch konstrukcji klatek w celu przeprowadzenia testu in situ (USA) [16] Dynamiczne nie określono [23] Półstatyczne OECD (1998) Badanie bioakumulacji Cd i Zn na podstawie zmian stężeń metalotioneiny (MT) wytwarzanej w organizmie małż w wyniku ich transplantacji w obszar zanieczyszczony metalami ciężkimi (Francja) Ocena jakości wody rzecznej (Japonia) Ocena toksyczności wód opadowych (Japonia) Określenie wpływu wieku osobników na wyniki testu toksyczności ostrej Półstatyczne ISO 6341 (1996) [11] [12] [36] Tabela 3. c.d. Taxon Gromada Gatunek Parametr mierzony i wielkość oznaczana Ruchliwość, 24-h LC50, 48-h LC50 Śmiertelność, liczba komórek glonu, spadek apetytu Hyalella azteca Mysidopsis bahia Leptocheirus plumulosus Paracorophium excavatum Śmiertelność Długość osobnika, ilość osobników danej płci, ilość jaj, śmiertelność Czas trwania testu Warunki Organizacja zalecająca/ pierwotne źródło NMX-AA-087 (SCFI 1995) Zastosowanie 28 dni statyczne Dynamiczne statyczne Ocena skuteczności oczyszczania ścieków z zakładów przemysłu tekstylnego (Meksyk) NOM-074Ocena toksyczności ECOL-1994 oczyszczonych ścieków przemysłowych i nie oczyszczonych ścieków szpitalnych (Meksyk) [84] Ocena toksyczności wód rzecznych na podstawie obserwacji spadku apetytu wskutek wcześniejszej ekspozycji, test przeprowadzono in situ (Szkocja) ASTM (1990) Wpływ działalności kompleksu US EPA (1994, pól golfowych na zanieczyszczenie osadów 1996) US EPA (1998) dennych pobliskiej zatoki (USA) 10 dni statyczne nie określono 28 dni Półstatyczne 24/ 48 h Ekspozycja: 24 h, obserwacja apetytu: 4h 10 dni 4/ 7 dni 689 Półstatyczne Dynamiczne Ocena toksyczności osadów dennych skażonych przez miedź, test 28-dniowy przeprowadzony w mikrosystemie (Nowa Zelandia) Odnośnik literaturowy [13] [14] [17] [85] [26] Tabela 3. c.d. Taxon Gromada owady Gatunek Owad z niepełnym przeobrażeniem (Hexagenia bilineata) Owad z niepełnym przeobrażeniem (Hexagenia limbata) Larwa ochotki owada z przeobrażeniem zupełnym (Chironomus tentans) Parametr mierzony i wielkość oznaczana Śmiertelność, ilość osobników zdolnych wyłonić się na powierzchnię osadu Długość osobnika, ilość osobników danej płci, ilość jaj, śmiertelność Długość osobnika, ilość osobników Czas trwania testu Warunki 10 dni statyczne 28 dni Półstatyczne 21 dni Masa mokra, 21 dni hamowanie wzrostu, śmiertelność, bioakumulacja 10 dni 690 Organizacja zalecająca/ pierwotne źródło Environment Canada (1992) Zastosowanie Odnośnik literaturowy Ocena stopnia skażenia osadów dennych przez miedź (Nowa Zelandia) [86] Environment Canada (1993) Ocena toksyczności osadów dennych skażonych przez miedź, test przeprowadzony w mezosystemie (Nowa Zelandia) [28] statyczne nie określono Określenie bioakumulacji rtęci stanowiącej zanieczyszczenie osadów rzecznych (USA) [87] statyczne nie określono Badanie przestrzennych i czasowych zmian stężeń metali stanowiących zanieczyszczenie osadów dennych (Kanada) [88, 89, 90] Tabela 3. c.d. Taxon Gromada Okoń błękitnoskrzeli (Lepomis macrochirus) strunowce ryby Gatunek Flądra (Platichthys flesus) Parametr mierzony i wielkość oznaczana Długość osobnika, masa mokra, śmiertelność, masa wątroby, stężenie MBP w wątrobie (białek kompleksujących metale), LOEC Długość i waga osobnika Długość i waga osobnika Czas trwania testu Warunki Organizacja zalecająca/ pierwotne źródło nie określono 28 dni Półstatyczne 6 tygodni Dynamiczne nie określono 3 miesiące Dynamiczne nie określono 691 Zastosowanie Odnośnik literaturowy Ocena toksyczności osadów rzecznych zanieczyszczonych przez kadm (USA) [24] Badanie losów i skutków obecności w środowisku wodnym herbicydu z grupy triazyn (metribuzin), test przeprowadzono w mezosystemie (USA) Określenie stopnia skażenia osadów dennych przez związki chloroorganiczne i metale, test przeprowadzono in situ oraz w mezosystemie (Norwegia) [30] [29] Tabela 3. c.d. Taxon Gromada Gatunek Sumik kanałowy (Ictalurus punctatus) Parametr Czas mierzony i trwania wielkość testu oznaczana 1, 7, 28, Hematokryt 56, 84 dni (stosunek krwinek czerwonych do osocza), hemoglobina, aktywność dehydratazy ALA (kwasu δ-aminolewulinowego), stężenie glukozy i chlorków w osoczu, długość nici DNA, długość i waga osobnika, waga wątroby, waga śledziony, wskaźniki somatyczne wątroby i śledziony 692 Warunki Dynamiczne Organizacja zalecająca/ pierwotne źródło nie określono Zastosowanie Wpływ działalności kopalni węgla kamiennego na stan zanieczyszczenia wód i osadów dennych, test przeprowadzono in situ (USA) Odnośnik literaturowy [18] Tabela 3. c.d. Taxon Gromada ssaki ASTM ISO OECD SCFI US EPA Gatunek samica szczura Parametr Czas mierzony i trwania wielkość testu oznaczana 1 2 dni Aktywność etoksyrezorufiny (EROD) zależnej od P450 1A1, 1 aktywność pentoksyrezorufiny (PROD) zależnej od P450 2B, masa wątroby, 2 stężenie białek mikrosomalnych w wątrobie, stężenie tyroksyny (T4) w surowicy, powierzchnia i wysokość komórki folikuliny (hormonu żeńskigo) American Society for Testing and Materials International Standard Organization, Genewa, Szwajcaria Organization for Economic Co-operation and Development Secretaria de Comercio y Fomento Industrial United States, Environmental Protection Agency 693 Warunki statyczne Organizacja zalecająca/ pierwotne źródło 1 [91] 2 [92] Zastosowanie Ocena toksyczności ekstraktów z gleby zawierającej wysokie stężenia polichlorowanych bifenyli, pochodzącej z nieczynnego składowiska odpadów (USA). Odnośnik literaturowy [93] Rozdział 32 B. MIKROBIOTESTY Konieczność wykonywania analiz wielu próbek środowiskowych w stosunkowo krótkim czasie doprowadziła do wzrostu znaczenia szybkich zminiaturyzowanych testów toksyczności, zwanych mikrobiotestami, testami alternatywnymi, czy też testami drugiej generacji [94]. Mikrobiotesty działają w oparciu o organizmy jednokomórkowe lub małe wielokomórkowce, które w wyniku kontaktu z próbką ciekłą wykazują specyficzną odpowiedź. Ze względu na liczne zalety, testy alternatywne stosowane są najczęściej w postaci wcześniej wspomnianych baterii biotestów opartych na wykorzystaniu organizmów należących do różnych poziomów troficznych. Ponieważ mikroorganizmy stanowią podstawowe ogniwo w łańcuchu pokarmowym, wszelkie niekorzystne zmiany w nich zachodzące, w sposób bezpośredni lub pośredni mogą wpływać na organizmy wyższych poziomów troficznych, a w dalszym etapie na stan całego ekosystemu. Ze względu na dużą powierzchnię właściwą i bezpośredni kontakt błony komórkowej z badanym medium, mikroorganizmy wykazują większą wrażliwość w stosunku do substancji toksycznych, niż gatunki bezkręgowców, czy też ryby. Toksyczność, ogólnie, jest funkcją czasu ekspozycji, dlatego testy długookresowe mają szczególne znaczenie w ekotoksykologii. Ich realizacja z wykorzystaniem długo żyjących gatunków organizmów jest jednak kłopotliwa. Mikroorganizmy, charakteryzujące się krótkim czasem życia pojedynczego pokolenia stanowią wygodne rozwiązanie służące określeniu wpływu substancji toksycznej przy długotrwałym narażeniu. Ponadto takie parametry jak: - eliminacja konieczności utrzymania hodowli, - niski koszt przeprowadzenia analizy pojedynczej próbki, - możliwość jednoczesnego badania kilku próbek, - krótki czas odpowiedzi, - mała objętość badanej próbki, - niewielka przestrzeń zajmowana w laboratorium przez odpowiedni zestaw, a także - możliwość zastosowania w terenie - decydują o rosnącym zainteresowaniu tą metodą oceny stopnia zanieczyszczenia środowiska W kolejnej tabeli (tabela 4) zestawiono informacje na temat mikrobiotestów dostępnych na rynku, określanych potocznie w języku angielskim jako „toxkits” [95]. Pionierem prac nad pomysłem i rozwinięciem metodyki przeprowadzania testów tego typu z wykorzystaniem mikroorganizmów nie wymagających utrzymania stałej hodowli był zespół naukowy z Uniwersytetu w Ghent w Belgii. Organizmy dostarczane są do laboratorium w formie kryptobiotycznej: wrotki w formie cyst, skorupiaki w formie jaj przetrwalnikowych, zaś glony – jako komórki unieruchomione na odpowiednim nośniku. zabezpieczonych przed rozwojem specjalnym roztworem. Formy te mogą być przechowywane w lodówce przez okres kilku miesięcy. Przed rozpoczęciem testu cysty umieszcza się w wodzie. Pod wpływem silnego światła następuje rozwój form przetrwalnikowych i po upływie 18 - 96 godzin (w zależności od organizmu) następuje wylęg młodych osobników, gotowych do wykorzystania jako element biologiczny odpowiedniego urządzenia. Eliminacja hodowli pozwala na obniżenie kosztów badań. Wykorzystanie standardowych organizmów umożliwia standaryzację testu i otrzymanie powtarzalnych wyników w różnych laboratoriach. 694 Rozdział 32 9. PODSUMOWANIE Wyniki analizy chemicznej są źródłem informacji jakościowych i ilościowych o różnych formach zanieczyszczeń występujących w badanych próbkach środowiskowych. Poprzez porównanie wyników oznaczeń z odpowiednimi normami i standardami możliwe jest również uzyskanie ogólnych informacji co do stopnia toksyczności badanego materiału. Wyniki te nie mogą jednak stanowić źródła bezpośrednich danych o toksycznym oddziaływaniu (zarówno o charakterze ostrym, jak i przewlekłym) na żywy organizm. Źródłem takich informacji mogą być natomiast wyniki badań uzyskane za pomocą odpowiednich biotestów. W chwili obecnej większa część testów oparta jest na wykorzystaniu różnych organizmów zwierzęcych jako elementu aktywnego. Wydaje się jednak, że wzrastać będzie znaczenie fitotestów, co związane jest z: - wrażliwością organizmów roślinnych na zmiany w środowisku życia, - rosnącą liczbą regulacji prawnych zalecających stosowanie fitotestów. Liczne publikacje dotyczące biotestów zawierają informacje na temat doświadczeń przeprowadzanych w mikro- i mezosystemach. Z kolei szybkie uzyskanie danych na temat stopnia skażenia danego elementu środowiska umożliwia zastosowanie mikrobiotestów. W celu uniknięcia niedoszacowania toksyczności badanej próbki powszechnie stosowane są zespoły biotestów. Nie ma wątpliwości, że obszar zastosowania biotestów będzie coraz większy a uzyskane w ten sposób informacje będą stanowiły podstawę do podjęcia badań z wykorzystaniem „klasycznych” metodyk analitycznych. 695 Tabela 4. Wykaz mikrobiotestów dostępnych na rynku (ang. toxkits). Czas Nazwa testu Taxon Gatunek organizmu Rodzaj testu trwania testu Organizacja zalecająca Testy przeznaczone do oceny skażenia środowiska śródlądowego i słodkowodnego Selenastrum capricornutum ALGALTOXKIT FTM alga (zielenice) (inaczej: Raphidocelis subcapitata lub 72h hamowanie wzrostu Pseudokirchneriella subcapitata) OECD, ISO OECD, DAPHTOXKIT FTM magna skorupiaki (wioślarki) Daphnia magna 24-48h toksyczność ostra DAPHTOXKIT FTM pulex skorupiaki (wioślarki) Daphnia pulex 24-48h toksyczność ostra OECD CERIODAPHTOXKIT FTM skorupiaki (wioślarki) Ceriodaphnia dubia 12h toksyczność ostra US EPA Thamnocephalus platyurus 24h toksyczność ostra THAMNOTOXKIT FTM skorupiaki (bezpancerzowce) ROTOXKIT FTM ROTOXKIT FTM short-chronic PROTOXKIT FTM OSTRACODTOXKIT FTM 24h wrotki Brachionus calyciflorus pierwotniaki (orzęski) skorupiaki (małżoraczki) 48h Tetrahymena thermophila 24h Heterocypris incongruens 6 dni toksyczność ostra krótkookresowa toksyczność chroniczna (rozmnażanie) toksyczność chroniczna (hamowanie wzrostu) toksyczność chroniczna (śmiertelność/ hamowanie wzrostu) ISO ASTM AFNOR OECD - Testy przeznaczone do oceny skażenia środowiska morskiego/ estuariów ROTOXKIT M TM ARTOXKIT MTM ASTM ISO US EPA wrotki skorupiaki (bezpancerzowce) American Society for Testing and Materials International Standard Organization, Genewa, Szwajcaria United States, Environmental Protection Agency Brachionus plicatilis 24-48h toksyczność ostra Artemia franciscana 24-48h toksyczność ostra (dawniej Artemia salina) AFNOR Association Française de Normalisation OECD Organization for Economic Co-operation and Development 696 ASTM - LITERATURA [1.] [2.] [3.] [4.] [5.] [6.] [7.] [8.] [9.] [10.] [11.] [12.] [13.] [14.] [15.] [16.] [17.] [18.] [19.] [20.] [21.] [22.] [23.] [24.] [25.] [26.] [27.] [28.] [29.] [30.] [31.] [32.] [33.] [34.] [35.] Namieśnik J. , Górecki T. , Am. Lab. , 34,18 (2002) Namieśnik J. (red), Zarys ekotoksykologii, EKO-Pharma, Gdańsk, 1995 Stauber J.L. , Davies C.M. , Environ. Rev. , 8, 255 (2000) Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 18 lutego 2003 r. w sprawie sposobu dokonywania oceny ryzyka dla zdrowia człowieka i dla środowiska stwarzanego przez substancje chemiczne (Dz. U. Nr 52, poz. 467) Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 11 lipca 2002 r. w sprawie kryteriów i sposobu klasyfikacji substancji i preparatów chemicznych (Dz. U. Nr 140, poz. 1172) Buszewski B. , Jastrzębska A. , Chem. Inż. Ekol. , 6, 1097 (1999) Wardencki W. , Namieśnik J. , Chem. Inż. Ekol. , 4, 301 (2001) Egeler P. , Römbke J. , Meller M. , Knacker Th. , Franke C. , Studinger G. , Nagel R. , Chemosphere, 35, 835 (1997) Petrauskiene L. , Environ. Intern. , 28, 729 (2003) Pynnönen K. , Wat. Res. , 29, 247 (1995) Sakai M. , J. Environ. Sci. Health. , B36, 67 (2001) Sakai M. , J. Environ. Sci. Health. , B37, 247 (2002) Villegas-Navarro A. , Romero Gonzales M.C. , Rosas Lopez E. , Dominguez Aguilar R. , Sachetin Marcal W. , Environ. Intern. , 25, 619 (1999) Villegas-Navarro A. , Rodríguez Santiago M. , Ruiz Pérez F. , Rodríguez Torres R. , Dieck Abularach T. , Reyes J.L. , Environ. Intern. , 25, 535 (1997) Mersch J. , Beauvais M.N. , Mut. Res. , 393, 141 (1997) Smith J.G. , Beauchamp J.J. , Environ. Monit. Assess. , 62, 205 (2000) McWilliam R.A. , Baird D.J. , Environ. Toxicol. Chem. , 21, 1462 (2002) Martin L.K. , Jr. , Black M.C. , Ecotoxicol. Environ. Saf. , 41, 307 (1998) Hund K. , Chemosphere, 35, 1069 (1997) Okamura H. , Piao M. , Aoyama I. , Sudo M. , Okubo T. , Nakamura M. , Environ. Pollut. , 117, 411 (2002) Ricking M. , Beckman E. , Svenson A. , J. Soil & Sediments, 2, 129 (2002) Boluda R. , Quintanilla J.F. , Bonilla J.A. , Sáez E. , Gamón M. , Chemosphere, 46, 355 (2002) Baudrimont M. , Andrès S. , Metivaud J. , Lapaquellerie Y. , Ribeyre F. , Maillet N. , Latouche C. , Boudou A. , Environ. Toxicol. Chem. , 18, 2472 (1999) Cope W.G. , Wiener J.G. , Steingraeber M.T. , Atchison G.J. , Can. J. Fish. Aquat. Sci. , 51, 1356 (1994) Traunsprurger W. , Schäfer H. , Remde A. , Chemosphere, 33, 1129 (1996) Marsden I.D. , Wong C.H.T. , Al.-Mudaffar N. , Aust. J. Ecotoxicol. , 6, 21 (2000) Skowroński T. , Kalinowska R. , Pawlik-Skowrońska B. , Kosmos, 51, 165 (2002) Marsden I.D. , J. Exp. Mar. Biol. Ecol. , 270, 57 (2002) Berge J.A. , Brevik E.M. , Mar. Pollut. Bull. , 33, 46 (1996) Fairchild J.F. , Sappington L.C. , Arch. Environ. Contam. Toxicol. , 43, 198 (2002) Fairchild J.F. , La Point T.W. , Schwartz T.R. , Arch. Environ. Contam. Toxicol,. 27, 527 (1994) Gerhardt A. , A new multispecies freshwater biomonitor for ecologically relevant supervision of surface waters in: Biomonitors and biomarkers as Indicators of Environmental Change 2. Kluwer Academic/Plenum Publisher, New York 2000 Fairchild J.F. , Sappington L.C. , Ruessler D.S. , Proc. Tech. Meet. U.S. Geol. Surv., An ecological risk assessment of the potential for herbicide impacts on primary productivity of Lower Missouri River, Charleston, South Carolina, March 8-12, 1999 Fairchild J.F. , Ruessler D.S. , Carlson A.R. , Environ. Toxicol. Chem. , 17, 1830 (1998) Larsen J. , Schultz T.W. , Rasmussen L. , Hooftman R. , Pauli W. , Chemosphere, 35, 1023 (1997) 697 [36.] [37.] [38.] [39.] [40.] [41.] [42.] [43.] [44.] [45.] [46.] [47.] [48.] [49.] [50.] [51.] [52.] [53.] [54.] [55.] [56.] [57.] [58.] [59.] [60.] [61.] [62.] [63.] [64.] [65.] [66.] [67.] [68.] [69.] [70.] [71.] [72.] [73.] [74.] [75.] [76.] Klein B. , Wat. Res. , 34, 1419 (2000) LeBlond J.B. , Duffy L.K. , Sci. Total Environ. , 271, 49 (2001) Klinkow N. , Jekel M. , Vom Wasser, 93, 325 (1999) Reemtsma T. , Putschew A. , Jekel M. , Vom Wasser, 92, 243 (1999) Fiehn O. , Vigelahn L. , Kalnowski G. , Reemtsma T. , Jekel M. , Acta hydrochim. hydrobiol. , 25, 11 (1997) Reemtsma T. , Putschew A. , Jekel M. , Waste Manage. , 19, 181 (1999) Reemtsma T. , Fiehn O. , Jekel M. , Fresenius J. Anal. Chem. , 363, 771 (1999) Guzzela L. , Chemosphere, 37, 2895 (1998) Brohon B. , Gourdon R. , Soil Biol. Biochem. , 32, 853 (2000) Wolska L. , Chem. Inż. Ekol. , 7, 365 (2000) Cronin M.T.D. , Schultz T.W. , Ecotoxicol. Environ. Saf. , 39, 65 (1998) Ince N.H. , Dirilgen N. , Apikyan I.G. , Tezcanli G. , Üstün B. , Arch. Environ. Contam. Toxicol. , 36, 365 (1999) Sherrard K.B , Marriott P.J. , McCormick M.J. , Millington K. , Environ. Toxicol. Chem. , 15, 1034 (1996) Cassels N.P. , Lane C.S. , Depala M. , Saeed M. , Craston D.H. , Chemosphere, 40, 609 (2000) Ho K.T. , Kuhn A. , Pelletier M.C. , Hendricks Y.L. , Helmstetter A. , Environ. Toxicol. , 14, 235 (1999) Jennings V.K.L. , Rayner-Brandes M.H. , Bird D.J. , Wat. Res. , 35, 3448 (2001) Lewis M.A. , Environ. Pollut. , 87, 319 (1995) Wang W. , Freemark K. , Ecotoxicol. Environ. Saf. , 30, 289 (1995) Fargašová A. , Bumbálová A. , Havránek E. , Chemosphere, 38, 1165 (1999) Halling-Sørensen B. , Chemosphere, 40, 731 (2000) Chen Y.Ch. , Aquaculture, 195, 71 (2001) Stauber J.L. , Franklin N.M. , Adams M.S. , Trends Biotechnol. , 20, 141 (2002) Svedrup L.E. , Fürst Ch.S. , Weideborg M. , Vik E.A. , Stenersen J. , Chemosphere, 46, 311 (200). Šepič E. , Bricelj M. , Leskovšek H. , Chemosphere, 52, 1125 ( 2003) Rojíčkowá-Padrtowá R. , Maršálek B. , Chemosphere, 38, 3329 (1999) Chen Ch.Y. , Lin K.Ch. , Yang D.T. , Chemosphere, 35, 1959 (1997) Baun A. , Justesen K.B. , Nyholm N. , Chemosphere, 46, 251 (2002) Baun A. , Bussarawit N. , Nyholm N. , Environ. Pollut. , 102, 185 (1998) Twist H. , Edwards A.C. , Codd G.A. , Water Res. , 32, 2471 (1998) Cleuvers M. , Weyers A. , Water Res. , 37, 2718 (2003) Cleuvers M. , Ratte H.T. , Water Res. , 36, 2173 (2002) Wundram M. , Selmar D. , Bahardi M. , Chemosphere, 32, 1623 (1996) Toricelli L. , Manzo S. , Accornero A. , Manfra L. , Fresenius Environ. Bull. , 11 (2002) Bruno E. , Elkund B. , Environ. Pollut. , 125, 287 (2003) Fairchild J.F. , Ruessler D.S. , Haverland P.S. , Carlson A.R. , Arch. Environ. Toxicol. , 32, 353 (1997) Marwood Ch.A. , Solomon K.R. , Greenberg B.M. , Environ. Toxicol. Chem. , 20, 890 (2001) Smart R.M. , Barko J.W. , Aquatic Botany, 21, 251 (1985). Battaglin W. , Fairchild J. , Wat. Sci. Technol. , 45, 95 (2002) Ronco A. , Gagnon P. , Diaz-Baez M.C. , Arkhipchuk V. , Castillo G. , Castillo L.E. , Dutka B.J. , Pica-Granados Y. , Ridal J. , Srivastava R.C. , Sánchez A. , Environ. Toxicol. , 17, 232 (2002) Diaz-Baez M.C. , Sanchez A. , Dutka B.J. , Ronco A. , Castillo G. , Pica-Granados Y. , Castillo L.E. , Ridal J. , Arkhipchuk V. , Srivastava R.C. , Environ. Toxicol. , 17, 241 (2002) Prokop Z. , Vangheluwe M.L. , Van Sprang P.A. , Janssen C.R. , Holoubek I. , Ecotoxicol. Environ. Saf. , 54, 65 (2003) 698 [77.] [78.] [79.] [80.] [81.] [82.] [83.] [84.] [85.] [86.] [87.] [88.] [89.] [90.] [91.] [92.] [93.] [94.] [95.] Thygesen R.S. , Trapp S. , J. Soils & Sediments, 2, 77 (2002) Bierkens J. , Klein G. , Corbisier P. , Van Den Heuvel R. , Verschaeve L. , Weltens R. , Schoeters G. , Chemosphere, 37, 2935 (1998) Gerhardt A. , Janssens de Bisthoven L. , Mo Z. , Wang C. , Yang M. , Wang Z. , Chemosphere, 47, 35 (2002) Tsui M.T.K. , Chu L.M. , Chemosphere, 52, 1189 (2003) Balk F. , Ford R.A. , Toxicol. Lett. , 111, 81 (1999) Rajski A. , Zoologia, PWN, Warszawa 1986 Halling- Sørensen B. , Nyholm N. , Baun A. , Chemosphere, 32, 1513 (1996) McWilliam R.A. , Baird D.J. , Environ. Toxicol. Chem. , 21, 1198 (2002) Lewis M.A. , Foss S.S. , Harris P.S. , Stanley R.S. , Moore J.C. , Environ. Toxicol. Chem. , 20, 1390 (2001) Marsden I.D. , Wong C.H.T. , Mar. Freshwater Res. , 52, 1007 (2001) Naimo T.J. , Wiener J.G. , Cope W.G. , Bloom N.S. , Can. J. Fish. Aquat. Sci. , 57, 1092 (2000) Krantzberg G. , Sherman R.K. , Water Qual. Res. J. Canada, 30, 635 (1995) Krantzberg G. , Environ. Toxicol. Chem. , 13, 1685 (1994) Krantzberg G. , Using the burden of evidence approach for sediment management; Case study: Collingwood Harbour in: The Lake Huron Ecosystem: Ecology, Fisheries and Management, SPB Academic Publishing, Amsterdam, The Netherlands, 1995, 365 Pohl R.A. , Fouts R.J. , Anal. Biochem. , 107, 2197 (1980) Guengerich F.P. , Microsomal enzymes involved in toxicology – analysis and separation in: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed), Raven Press, NY, 1982, 609 Hansen L.G. , Li M.-H. , Saeed A. , Bush B. , Arch. Environ. Contam. Toxicol. , 29, 334 (1995) Rojíčkowá-Padrtowá R. , Maršálek B. , Holoubek I. , Chemosphere, 37, 495 (1998) http://www.microbiotests.be 699
