organicznych), profilowanie peptydowo

mgr farm. Agnieszka Klupczyńska
STRESZCZENIE ROZPRAWY DOKTORSKIEJ
Zastosowanie nowoczesnych strategii metabolomicznych i proteomicznych
w charakterys§ce raka płuca
Rak płuca należy do największych wyzwań współczesnej onkologii, poniewaz jest
jednym
z
najczęściejwystępujących nowotworów złośliwych,zarówno
u
kobiet,
jak i u mężczyzn oraz stanowi głowną pTzyczynę śmierci z powodu nowotworów złośliwych
na Świecie, Obecnie stosowane metody diagnostyczne nię są wystarczające, poniewaz
większośc chorych jest diagnozowanych w stadium zaawansowanym, kiedy możliwości
lęczenia są bardzo ograniczone. Jednym ze sposobów lepszego poznania patomechanizmu
rozwoju
i
przebiegu chorób nowotworov\rych oraz identyfikacji nowych markerów
biologicznych raka jest podejmowanie badań z zakresu metabolomiki i proteomiki.
Celem niniejszej pracy doktorskiej zatytułowanej ,,Zastosowanie nowoczesnych
strategii metabolomicznych i proteomtcznych w charakterystyce raka płuca" było
poszukiwantę zmian
w ludzkim
niedrobnokomórkowego
metabolomie
i
proteomie związanych
z
występowaniem
raka płuca oraz określenie ich uż7Ąecznościjako potencjalnych
markerów diagnostycznych
tej choroby. W tym celu
zastosowano rożne strategie
metabolomlcznę oraz proteomiczne: niecelowaną analizę metabolomiczną, celowaną anallzę
i ich pochodnych otaz kwasów
organicznych), profilowanie peptydowo-białkowe oraz oznaczanl,e białek
mętabolomlczną (oznaczanie wolnych aminokwasów
o aktywności proangiogennej. Badania były prowadzone z wykorzystanięm kilku różnych
metod oparlych na spektrometrii mas oraz metody cytometrii przepływowej. Przeprowadzone
w
ramach pracy doktorskiej badania stanowią obszerną analtzę zmian zachodzących
u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca na poziomie metabolomu
i
proteomu.
Na niniejszą rozprawę składa się 6 publikacji, w tym 5 prac oryginalnych otaz 1 praca
poglądowa, opublikowanych w latach 2015-2017 o łącznym współczynniku oddziaływania
impact factor (IF) wynoszącym 16,537. Zrealizowane badania umozliwiły pełniejszą
charakterystykę zmian związanych
z rozwojem i przebiegiem niedrobnokomórkowego
płuca. Spośród badanych metabolitów
i
białek wytypowano cząsteczki
o
raka
potencjalnej
użytecznościw praktyce klinicznej.
Kompleksowym analizom metabolomicznym
i
proteomrcznym zostały poddane
próbki surowicy krwi pobrane od osób ze zdiagnozowanym niedrobnokomórkowym rakiem
płuca przed rozpoczęciem leczenia przeciwnowotworowęgo oraz zdrowych ochotników
(grupy kontrolnej). Chorzy
z I stopniem
zaawansowania nowotworu stanowili 47Yo grupy
badanej, co pozwoliło na oszacowanie skuteczności badanych zwlązków wę wczesnym
wykrywaniu raka płuca, Uzyskane wyniki poddano zaawansowanej ana\tzie statystycznej,
z v,rykorzystaniem wielowymiarowych technik eksploracji danych, w celu oceny potencjału
diagnostycznego badanych zwtązków. Na przeprowadzęnię badań wyraziła zgod,ę Komisja
Bioetyczna przy Uniwersytecie Medycznym w Poznaniu (Uchwała nr 2OO1I3).
Oznaczanie wolnych aminokwasów zostało przeprowadzone
wYsokosprawnego chromatografu cieczowego połączonego
z tandemowym
za
pomocą
spektrometrem
mas (HPLC-QqQ-MS/MS), który pracował w selektywnym trybie monitorowania reakcji
wielokrotnych (MRM). Do przygotowania próbek uzyto odczynnika aTRAQ znakującego
grup} aminowe. Zastosowana metodyka pozwoliła na oznaczęnie niezwykle szerokiego
profilu wolnych aminokwasów w próbkach surowicy krwi chorych na nowotwór płuca,
obejmującego 42 związki (aminokwasy białkowe i niebiałkowe). Celem przeprowadzonych
w ramach rozprawy doktorskiej badań była ocena użytecznosci profili aminokwasowych
w wykrywaniu raka płuca u polskich pacjentów. Na podstawie jednowymiarowych analiz
statystycznych stwierdzono statystycznie istotne rożntce w poziomach ośmiu aminokwasów,
PrZy czym największe rożnicę zaobserwowano
w
stężeniach następujących metabolitów:
kwasu asparaginowego, P-alaniny, argininy, seryny
i
fenyloalaniny. Otrzymane wyniki
umozliwiły weryfikację modeli dyskryminacyjnych służącychdo wykrywania chorych na
raka płuca zaproponowanych przezjapońskich badaczy
i
opierających się na stężeniach 6
wybranych aminokwasów. Ponadto opracowano nowy model
klasyfikacyjnej, składający się
z
o
wyższej zdolności
następujących aminokwasów: B-alaniny, asparaginy,
citruliny, fenyloalaniny, histydyny oraz kwasu asparaginowego. Udowodniono użyteczność
opracowanego modęlu
w wykrywaniu zarówno podtypu
płaskonabłonkowego,
jak t gnrczołowego raka płuca, Ponadto, stwierdzono, ze podwyższony poziom fenyloalaniny
i
obniżone stęzenie cytruliny należą do najbardziej charakterystycznych zmian w profilu
wolnych aminokwasów występujących we krwi chorych
z
rakiem płuca, które występują
ntezależntę od pochodzęnia ętnicznego, stylu życia oraz charakterystyki klinicznej pacjentów.
Drugą celowaną analtzą metabolomicznąprzeprowadzoną w ramach pracy doktorskiej
było oznaczanię małocząsteczkov\rych kwasów organlcznych, Celem badań było opracowanie
nowej metodyki jednoczesnej analizy ilościowej 6 wybranych kwasów organicznych
w surowicy krwi (kwasu mlekowego, kwasu fumarowego, kwasu bursźynowego, kwasu
piroglutaminowego, kwasu glutarowego oraz kwasu 2-hydroksymasłowego)
i
zastosowanie
jej do określenia przydatności badanych metabolitów w wykrywaniu niedrobnokomórkowego
raka płuca. Nowo opracowana metodyka opierała się na wykorzystaniu techniki ekstrakcji
do fazy stałej z użyciem kolumienek Clean-up
CUQAX oraz wysokosprawnej chromatografii
cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-QqQ-MS/MS).
W
wyniku
przeprowadzonej walidacji potwierdzono dobrą dokładnośćt precyzję nowej metodyki oraz
uzyskano niskie warlościgranicy oznaczalności i wykrywalności. Dodatkowo zbadano efekt
matrycy
i
trwałośćanalitów
w
rożnych warunkach Przeprowadzone pomiary stęzeń
małocząsteczkowych kwasów organicznych były pierwszymi badaniami przedstawiającymi
oznaczanlę tej grupy metabolitÓw w surowicy krwi chorych z nowotworem płuoa za pomoaą
metody ilościowej, a nie półilościowej, Wykonane analizy wskazały na możliwośc
wykorzystania kwasu piroglutaminowego jako potencjalnego wskaźnika diagnostycznęgo
raka płuca. Przeprowadzone dodatkowe analizy statystyczne uwzględniające tylko pacjentów
z I
stopniem zaawansowania raka płuca potwierdziły zdolnośćtego mętabolitu
do wykrywania wczesnych postaci tego nowotworu. Wańo zauważyó, że opracowana
w ramach niniejszej pracy doktorskiej metodyka możę zostaó wykorzystana do badania zmian
w profilu kwasów
organicznych we
krwi związanych z
przebiegtem innych chorób
nowotworovrrych.
Kolejne zadanie badawcze obejmowało zastosowanie niecelowanego profilowania
metabolicznego
do identyfikacji nowych grup
niedrobnokomórkowego
z
rozwojem
raka płuca. Do badań został wykorzystany ultrawysokosprawny
ze
mas z wysokorozdzielczym
mas Orbitrap (UHPLC-Orbitrap-MS). Była to pierwsza nieukierunkowana
chromatograf cieczowy sprzęzony
analizatoręm
metabolitów związanych
spektrometrem
analtza metabolomiczna przeprowadzona u pacjentów
z taktęm płuca z zastosowaniem
tego
analtzatota mas, Dla związków wykazujących statystycznie istotne rożnicę przeprowadzono
identyfikację za pomocą3 baz metabolitów. W grupie zidentyfikowanych zwtązkow znalazły
się m,in. 4 aminokwasy (histydyna, leucyna, metioninaityrozyna),2
i
piroglutaminowy
kwas jabłkowy), a takżę karnityna
i2
kwasy organiczne (kwas
acylokarnityny. Podsumowując,
na podstawie analizy całościowegoprofilu metabolitów w surowicy krwi
z
niedrobnokomórkowym rakiem płuca oTaz osób
acylokarnityny, obok aminokwasów
i
chorych
z
glupy kontrolnej wytypowano
kwasów organicznych, jako kolejną ważną grupę
metabolitów z punktu widzenia poszukiwania nowych markerów raka płuca.
W
ramach proteomicznej analizy surowicy krwi osób
z
niedrobnokomórkowym
rakiem płuca zbadano równiez profil peptydowo-białkowy pacjentów. Badania wykonano
z
użyciem techniki spektrometrii mas MALDI-TOF-MS
Do oczyszczanla
I
w
zakresię mas 1-10 kDa.
zagęszczania probek surowicy krwi wykorzystano ekstrakcję do fazy stałej
w postaci końcówek do mikropipetZtpTlp. Na podstawie porównania uzyskanych widm osób
z niedrobnokomórkowym rakiem płuca i osób zdrowych
dyskryminacyjny,
z
grupy kontrolnej stworzono model
w skład którego wchodziło 10 peptydów o wattościachmlz:
1450,94;
1466,90; 1520,16; 1546,72; 1568,45; 1617,88; 1880,97; 5904,39 6330,86; 6432,69.
Opracowany model cechował się dobrą czułościąi swoistością, co zostało potwierdzonę przez
walidację zev,lnętrzną. AnaItza MSiMS wybranych różnicujących sygnałów
peptydowo-białkowego pozwoliła na identyf,rkację
2
z
profilu
białek: białka dopełniacza C3 oraz
łańcucha alfa fibrynogenu. Walidacja przeprowadzona
za pomocą testu ELISA
nie
potwierdziła istotnych rożntc w stęzeniu białka dopełntacza C3 pomiędzy osobami z raktem
płuca a grupą kontrolną. Aby lepiej poznac zmieniony profil białkowy u pacjentów z raktęm
płuca należy podjąć się dalszej identyfikacji oraz walidacji pozostałych peptydów
wchodzących w skład opracowanego modelu dyskryminacyjnego.
W ramach realtzacji niniejszej pracy doktorskiej przeprowadzono ponadto
ilościową białkowych czynników regulujących angiogenezę
z
niedrobnokomórkowym rakiem płuca i osób
z
w
anaIizę
surowicy krwi
osób
grupy kontrolnej. Projekt obejmował
oznaczanle 16 białek biorących udział w procesie angiogenezy, wśród ktorych znajdowały się
czynniki wzrostu, receptory, cytokiny, chemokiny i hormony. Analizy wykonano przy użyciu
zwalidowanej metodyki opartej
na wykorzystaniu przeciwciŃ. kulek
magnetycznych
znakowanych fluorescencyjnie oraz cytometrii przepływowej. W niniejszym badaniu grupa
chorych z niedrobnokomórkowym
zI
rakiem płuca została ograniczona do osób
stopniem
zaawansowania nowotworu. Taki wybór pacjentów pozwolił na oszacowanie uzyteczności
badanych białek we wczesnym wykrywaniu raka płuca. Stwierdzono,
że osteopontyna,
czynnik wzrostu hepatocytów (HGF) oraz pł7tkopochodny czynnik wzrostu typu
(PDGF-AB/BB) mogą znależć zastosowanię we
wczesnej
AB i BB
diagnostyce
niedrobnokomórkowego raka płuca, pTzy czym największą zdolnośćdyskryminacyjną
posiadała osteopontyna.
,,\T* t\dĄA_
'
u"\\§\_§
J
Poznan,2 marca2)I7 r.