Zachowanie się zmian o charakterze subklinicznej infekcji HPV (SPI
advertisement
PRACE ORYGINALNE Jakub WYROBA1 Robert JACH1 Hubert HURAS1 Tomasz BASTA1 Joanna STREB2 Wioletta HOSIAWA1 Jacek DRABINA1 Zachowanie się zmian o charakterze subklinicznej infekcji HPV (SPI), śródnabłonkowej neoplazji szyjki macicy (CIN) 1 i 2. Badanie prospektywne obserwacyjne Assesment of the ongiong changes among patients diagnosed with subclinical changes of an HPV infection (SPI) as well as changes in the type of CIN 1 and CIN 2 Katedra Ginekologii i Położnictwa UJ CM w Krakowie Kierownik: Prof. dr hab. med. Antoni Basta 1 Katedra Onkologii UJ CM w Krakowie Kierownik: Dr hab. n. med. Robert Jach 2 Dodatkowe słowa kluczowe: CIN1 CIN2 SPI progresja regresja HPV Additional key words: CIN1 CIN2 SPI regression progression HPV Adres do korespondencji: Jakub Wyroba Oddział Kliniczny Kliniki Endokrynologii Ginekologicznej ul. Kopernika 23 31-501 Kraków tel. 12-424-85-71/70 e-mail: [email protected] [email protected] 622 Cel pracy: Celem badania była ocena zachodzących zmian o typie regresji, progresji i stanu stacjonarnego wśród pacjentek ze zdiagnozowanymi zmianami o charakterze subklinicznej infekcji HPV, a także zmian o typie CIN 1 i CIN 2. Materiał i metodyka: Badanie przeprowadzono w grupie 289 kobiet w wieku 25-60 lat z CIN uczestniczących w programie profilaktyki raka szyjki macicy z nieprawidłowymi wynikami badania cytologicznego. Wyniki: Okres obserwacji pacjentek wynosił 6 lat. Nie stwierdzono różnic pomiędzy częstością występowania regresji zmian u pacjentek z SPI i pacjentek z CIN1. Również nie stwierdzono różnic w częstości występowania regresji w grupach pacjentek z CIN1 i z CIN2. Natomiast regresja z częściej występuje u pacjentek z SPI, niż u pacjentek z CIN2. Stan stacjonarny występował częściej u pacjentek z CIN1 i CIN 2 niż u pacjentek z SPI. W grupie pacjentek z CIN2 częściej występowała progresja do CIN3, niż w grupie pacjentek z SPI. W grupie pacjentek z CIN2 częściej występowała progresja do CIN3, niż w grupie pacjentek z CIN1. Analiza zachowania się zmian w obrębie szyjki macicy o charakterze SPI, CIN1 i CIN2 w zależności od obecności transkryptorów genów E6 i E7 HPV wykazała, że na 138 obserwowanych przypadków do progresji zmian doszło u 19,56% kobiet, głównie w obecności m RNA E6 i E7. Do remisji zmian doszło natomiast w 56,52%, głównie w przypadkach braku obecności transkryptorów E6 i E7 HPV. Wnioski: 1. Zmiany o charakterze subklinicznej infekcji HPV, CIN1 i CIN2 w obrębie szyjki macicy są zmianami, mogącymi ulegać progresji do wyższych stopni CIN i do raka szyjki macicy, mogącymi przez wiele lat pozostawać w stanie stacjonarnym a nawet ulegać remisji. 2. Zakażenie HPV typami o wysokim Purpose of study: The aim of the study was to assess the ongoing changes of the type of regression, progression and steady state among patients diagnosed with subclinical changes of an HPV infection as well as changes in the type of CIN 1 and CIN 2. Materials and methods: The study was conducted in a group of 289 women between the ages of 25-60 with abnormal cytology taking part in the CIN cervical cancer prevention program. Results: The patients were observed over a period of 6 years; no detectable differences were discovered in the frequency of regression between patients with SPI in comparision to patients with CIN1. In addition, no differences were identified in the frequency of regression between groups of patients with CIN1 and CIN2. In contrast, regression was more common in patients with SPI than in patients with CIN2. Steady state was more frequent in patients with CIN1 and CIN 2 than in patients with SPI. The results illustrated no differences in the progression of SPI and the CIN1 to CIN2. The group of patients with CIN2 were frequently associated with progression to CIN3 more than in the group of patients with SPI. The group of patients with CIN2 were frequently associated with progression to CIN3 more than in the group of patients with CIN1. Further investigation of cervical changes associated with SPI, CIN1 and CIN2 were dependent on the presence of transcription genes E6 and E7 of HPV. In 138 cases, the presence of these transcription genes lead to progression in 19.56% of women; more specifically in the introduction of mE6 and E7 RNA. There were changes typical of remission in 56,52% of cases primarily in the absence of transcriptor genes HPV E6 and E7. Conclusion: 1. The histological changes of the cervix observed in J. Wyroba i wsp. potencjale onkogennym ma znaczenie nie tylko w inicjacji, ale również w rozwoju procesu karcinogenezy w obrębie szyjki macicy poprzez kilka niezależnych mechanizmów. Wstęp Wieloetapowy rozwój raka szyjki macicy, tj. od śródnabłonkowej neoplazji 1 stopnia CIN1 (CIN–Cervical Intraepithelial Neoplasia), poprzez kolejne stopnie zaawansowania CIN do postaci inwazyjnej raka jest zwykle procesem długotrwałym, trwającym od kilku do kilkunastu lat. Dane na temat procesu karcinogenezy w obrębie szyjki macicy i możliwości diagnostyczne stanów przedrakowych i wczesnych postaci raka szyjki macicy pozwoliły już w latach 60-tych ubiegłego stulecia na wprowadzenie w niektórych krajach Europy i USA badań profilaktycznych opartych na badaniu cytologicznym rozmazów szyjkowych. Na całym świecie, w ramach prowadzenia aktywnej profilaktyki raka szyjki macicy, rocznie wykrywa się około 10 milionów przypadków śródnabłonkowej neoplazji szyjki macicy drugiego i trzeciego stopnia (CIN2-3) i 30 milionów przypadków śródnabłonkowej neoplazji pierwszego stopnia (CIN1), a więc stanów, z których część ulega progresji do raka inwazyjnego. Natomiast roczna szacowana liczba zakażeń na HPV wynosi ok. 300 000 000 (Ryc. 1) [1-3]. W Klinice Ginekologii i Onkologii UJ CM, na 5 000 kobiet, u których wykonano cytologiczne badanie profilaktyczne w kierunku raka szyjki macicy wykryto 108 (2,15%) przypadków CIN, w tym u 60 (56%) kobiet CIN1, 31 (29%) CIN2, i 17 (15%) CIN3. Śródnabłonkowa neoplazja szyjki macicy dotyczy częściej kobiet młodszych niż kobiety z rakiem szyjki macicy [4]. Wyniki przeprowadzonych badań skriningowych wśród kobiet o niskim statusie socjoekonomicznym w USA wykazały że nieprawidłowości cytologiczne w niemal 85% przypadków dotyczyły kobiet przed 40 rokiem życia [2,3]. Według danych Benard VB całkowity odsetek nieprawidłowych wyników cytologicznych w badanej grupie obejmującejponad półtora miliona kobiet wynosił 1,8%. W grupie tej 10,3% przypadków nieprawidłowości cytologicznych dotyczyło kobiet w przedziale wiekowym 18-28 lat, a 0,8% kobiet powyżej 65 roku życia [5]. Wśród tych 1,8 % (ponad 28 000 kobiet) z nieprawidłowym wynikiem badania cytologicznego, dzięki kolposkopii z biopsją celowaną u 0,4 % kobiet rozpoznano inwazyjnego raka szyjki macicy, a u 7% zmiany o charakterze CIN 2 lub CIN3 w rzeczywistości okazały się także inwazyjnymi rakami szyjki macicy. Dane epidemiologiczne przeprwoadzone przez Schiffmana M. i wsp. w ramach szeroko cytowanego badania ALTS wykazują, że ponad 57% przypadków z inwazyjną postacią raka szyjki macicy stanowią kobiety powyżej 50 roku życia [6]. Przeprowadzono dotychczas niewiele prospektywnych badań dotyczących zachowania się CIN, z których część miała miejsce jeszcze przed poznaniem roli Przegląd Lekarski 2015 / 72 / 11 subclinical HPV infection, CIN1 and CIN2 may be subject to a higher degree of progression of CIN. In addition, these changes may progress to cervical cancer, remain stationary in a steady state, or decline into remission. 2. The types of HPV infection with high oncogenic potential are not only important in initiation of cerival changes but also in the developmental process of carcinogenesis in the cervix by several independent mechanisms. zakażenia HPV w procesie karcinogenezy w obrębie szyjki macicy [7,8]. Östor AG w swojej metaanalizie [7] wykazał, że zmiany o charakterze CIN1 w 58% ulegają regresji, w 32% przypadków pozostają w stanie stacjonarnym, w 11% przypadków ulegają progresji do raka in situ (CIS), a jedynie w 1% przypadków progresji do raka inwazyjnego. Zmiany o charakterze CIN2 ulegają regresji w 43% przypadków, pozostają w stanie stacjonarnym w 35% przypadków, w 22% przypadków ulegają progresji do CIS, a w 5% do raka inwazyjnego. Natomiast zmiany o charakterze CIN3 w 32% przypadków ulegają regresji, a w stanie stacjonarnym w mniej niż 56% przypadków. Natomiast progresji do raka inwazyjnego ulega ponad 12% przypadków CIN3. Natomiast Syrjänen [8] uwzględniając towarzyszące CIN zakażenie HPV wykazał, że zmiany o charakterze CIN1 w 65,1% ulegają regresji, w 20,8% przypadków pozostają w stanie stacjonarnym, a w 14,2% przypadków ulegają progresji do raka in situ (CIS). Zmiany o charakterze CIN2 ulegają regresji w 58,6% przypadków, pozostają w stanie stacjonarnym w 18,6% przypadków, a w 21,4% przypadków ulegają progresji do CIS. Natomiast zmiany o charakterze CIN3 w 11,6% przypadków ulegają regresji, pozostają w stanie stacjonarnym w 9,3% przypadków, w 79,1% przypadków ulegają progresji do CIS, a w 0,5% przypadków progresji do raka inwazyjnego. Natomiast zmiany CIN nie związane z zakażeniem HPV według tego autora ulegają regresji w 79,9% przypadków, w 14,6% przypadków pozostają w stanie stacjonarnym, progresji do CIS ulega 11% a do raka inwazyjnego 1% przypadków. Tak więc prospektywne obserwacje kliniczne wykazały, że zmiany o charakterze śródnabłonkowej neoplazji szyjki macicy mogą w zależności od stopnia zaawansowania ulegać nie tylko progresji, ale mogą także pozostawać przez dłuższy okres czasu w stanie stacjonarnym bądź ulegać samoistnej regresji, przy czym odsetki zmian o charakterze śródnabłonkowej neoplazji szyjki macicy, które ulegają regresji lub utrzymują się jako stan stacjonarny bądź ulegają progresji do CIN wyższych stopni bądź raka inwazyjnego są bardzo zróżnicowane. W literaturze przedmiotu nie wykazano wielu polskich prac dotyczących prospektywnej obserwacji zmian o charakterze CIN1 i CIN2. Materiał i metodyka Badanie przeprowadzono w grupie 289 kobiet w wieku 25-60 lat z CIN i rakiem szyjki macicy w stopniu IA wyselekcjonowanych spośród kobiet uczestniczących w programie badań profilaktycznych raka szyjki macicy, a także diagnozowanych i leczonych w Klinice Ginekologii i Onkologii Katedry Ginekologii i Położnictwa Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie w latach 2005-2010 z nieprawidłowymi wynikami badania cytologicznego. Podstawą do zakwalifikowania kobiet do grupy badanej było stwierdzenie zmian o charakterze subklinicznej infekcji HPV, CIN1 i CIN2 zweryfikowanych badaniem histologicznym materiału tkankowego uzyskanego drogą biopsji celowanej i wyskrobin z kanału szyjki macicy. Grupę kontrolną stanowiły 44 kobiety w wieku 28-56 lat, diagnozowane i leczone w tym samym okresie z powodu nieonkologicznych schorzeń ginekologicznych. Badania cytologiczne wykonano w Pracowni Diagnostyki Cytologicznej i Badań Molekularnych Kliniki Ginekologii i Onkologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie. Badania kolposkopowe oraz pobieranie wycinków pod kontrolą kolposkopii wykonano w Klinice Ginekologii i Onkologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie, a ocena preparatów histologicznych wykonywana była w Katedrze Patomorfologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie. Średni wiek kobiet w grupie badanej wynosił 35,2±12,8 lat i nie różnił się statystycznie istotnie od średniego wieku kobiet w grupie kontrolnej, w której wynosił 36,1±8,1 lat. U wszystkich kobiet grupy badanej i kontrolnej przeprowadzono według jednolitej metodyki badanie kolposkopowe, badanie histologiczne wycinków uzyskanych na drodze biopsji celowanej lub materiału tkankowego szyjki macicy uzyskanego w drodze operacji, badanie wirusologiczne DNA HPV metodą Hybrid Capture 2 oraz badanie mRNA E6/E7 HPV testem NucliSens firmy Biomerieux, jako wskaźnik przewlekłego zakażenia HPV i rozpoczęcia procesu transkrypcji materiału genetycznego wirusa, w keratynocytach oraz badanie mikrobiologiczne treści pochwowej. Badanie kolposkopowe Ocenę kolposkopową szyjki macicy w grupach badanej i kontrolnej dokonywano za pomocą kolposkopu Leisegang i Olympus OCS-500 z zakresem powiększeń 4-80x. Tarczę części pochwowej szyjki macicy oceniano wstępnie bez użycia odczynników kontrastujących, po uprzednim przemyciu szyjki macicy 0,9% roztworem soli fizjologicznej, a następnie po kontrastowaniu powierzchni nabłonkowej przy użyciu 3% wodnego roztworu kwasu octowego oraz w próbie Schillera, tj. przy użyciu roztworu jodu w jodku potasu (płyn Lugola). Dokumentację badania kolposkopowego prowadzono przy pomocy aparatu cyfrowego Olympus, natomiast w opisie 623 badania posługiwano się mianownictwem Międzynarodowej Federacji Kolposkopii i Patologii Szyjki macicy IFCPC (IFCPC - International Federation of Cervical Pathology and Colposcopy) z 2002 roku [9]. Badanie wirusologiczne Badanie wirusologiczne metodą hybrydyzacji (Hybrid Capture 2). Obecność DNA HPV badano testem Hybryd Capture 2 (firmy Digene/Qiagen). Treść komórkową z tarczy części pochwowej i kanału szyjki macicy pobierano przy użyciu zestawu Digene Cervical Sampler (Digene Cervical Brush and Specimen Transport Medium firmy Digene, Qiagen) w celu wykonania małopłytkowej hybrydyzacji ze wzmocnieniem sygnału z użyciem chemiluminescencji dla jakościowej oceny osiemnastu typów ludzkiego wirusa brodawczaka ludzkiego. Test Hybrid Capture2 pozwala na identyfikację materiału genetycznego wirusa brodawczaka ludzkiego (HPV) osobno dla typów o wysokim i średnim potencjale onkogennym (typ B) tj. typy: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 oraz o niskim potencjale onkogennym (typ A) tj. typy: 6, 11, 42, 43, 44. Pobrany materiał przechowywano w formie zamrożonej w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem badania rozmrao żano próbki w temperaturze 20-25 C przez 30 minut. Każdorazowo przygotowywano kontrolę negatywną (3 próbki) oraz kalibrator pozytywny dla wirusów o niskim potencjale onkogennym (3 próbki), jak i dla wirusów o wysokim i średnim potencjale onkogennym (3 próbki), a także dołączano po jednej próbce kontroli jakości przeprowadzonego badania. Po dodaniu do każdej próbki kontroli negatywnej i kalibratorów odczynnika denaturującego (roztwór zasady sodowej- NaOH) umieszczano materiał w łaźni wodnej w o temperaturze 6 C na okres 45 minut - w trakcie inkubacji następowała denaturacja materiału biologicznego. Kolejny etap polegał na hybrydyzacji denaturowanego DNA ze zbuforowanym roztworem zawierającym komplementarne RNA tj. z sondami specyficznymi dla wirusów o wysokim i średnim potencjale onkogennym oraz z sondami RNA dla wirusów o niskim potencjale onkogennym. Utworzone hybrydy DNA-RNA inkubowano o w łaźni wodnej w temperaturze 65 C przez kolejne 60 minut. Do kompleksu hybrydu DNA-RNA w badanym materiale biologicznym dodawano specyficzne dla niego przeciwciała monoklonalne znakowane fosfatazą alkaliczną w roztworze z azydkiem sodu. Następnie po wypłukaniu każdej mikropłytki dodawano do niej substrat chemiluminescencyjny (CDP-StarTM z Emerald IL). Po 15 minutach dokonywano odczytu wyników badania w luminometrze (DML2000TMLuminometer). Ostatnim etapem procedury była walidacja testów i interpretacja wyników. Wynik podawano we względnych jednostkach światła (RLU-Relative Light Unit), których wartość jest wprost proporcjonalna do ilości DNA HPV w badanym materiale. Ocena wewnątrzkomórkowej zawartości 624 Rycina 1 Zakażenia HPV a zmiany kliniczne w obrębie szyjki macicy i dolnego odcinka narządu rodnego. HPV infection and clinical changes in the uterine cervix and lower female reproductive track. mRNA genów E6 i E7 wirusa brodawczaka ludzkiego (NucliSens Easy Q HPV- Biomerieux). Materiał do badania pobierano od kobiet z grupy badanej i kontrolnej z tarczy części pochwowej szczoteczką CervexBrush zawieszając go następnie w buforze ThinPrep PreservCyt. Zabezpieczony materiał o przechowywano w temperaturze -20 C i poddawano analizie w przeciągu 14 dni. Kwasy nukleinowe izolowano z użyciem automatycznego ekstraktora easyMAG (bioMerieux) metodą Booma, zgodnie z instrukcją producenta. Próbki materiału zawieszone w roztworze ThinPrep PreservCyt poddawano lizie komórkowej w temperaturze pokojowej przez okres 10 minut z buforem lizującym (NucliSens Lysis Buffer, bioMerieux). Tak przygotowane próbki materiału umieszczano w aparacie wraz z mieszaniną roztworu silikonowego (NucliSens easyMAG Magnetica Silica, bioMerieux) i poddawano automatycznej ekstrakcji. Objętość eluatu stanowiła 55 μl. Uzyskane eluaty umieszczano natychmiast w temperaturze -20oC. Detekcję transkryptorów genów E6 i E7 ludzkich wirusów brodawczaka przeprowadzono za pomocą komercyjnych testów (NucliSens EasyQ HPV, bioMerieux) opartych na metodzie Real-time PCR (NASBA). NASBA jest metodą izotermalnej amplifikacji RNA osiągniętej przez jednoczasową aktywność odwrotnej transkryptazy wirusa AMV( avian myoblastosis virus), polimerazy T7 RNA oraz RNazy H. W reakcji zastosowano startery oraz sondy MB (Molecular Beacon) komplementarne do transkryptów genów E6 i E7 wirusów HPV typ: 16, 18, 31, 33 i 45 (bioMerieux). Stężenie sond MB użytych w reakcji wynosiło 2,5 mM. Reakcja NASBA została przeprowadzona w końcowej objętości 20 μl przez 2 godziny w temperaturze 0 41 C. Do reakcji użyto 5 ul eluatu kwasów nukleinowych. W celu uniknięcia wyników fałszywie ujemnych związanych z degradacją kwasów nukleinowych zastosowano startery oraz sondy komplementarne do ludzkiego genu metabolizmu podstawowego U1A mRNA. Dla każdej próbki przeprowadzono jednoczesną reakcję dla HPV 16/ U1A, HPV 18/31 oraz HPV 33/45. Jako kontrole dodatnie posłużyły sondy ss DNA komplementarne do analizowanych typów wirusów oraz genu U1A. Metodyka badania histopatologicznego Badanie histopatologiczne przeprowadzono w sposób rutynowy z zastosowaniem automatycznych procesorów tkankowych do barwienia metodą hematoksylina-eozyna, oraz do wykonania odczynów immunohistochemicznych. Ocena histologiczna obejmowała określenie typu zmian śródnabłonkowych, ich rozległości metodą morfometryczną, obecności ewentualnej wczesnej inwazji i wielkości obszaru inwazyjnego. Pomiary morfometryczne zostały dokonane z użyciem systemu analizy obrazu AnalySIS, za pomocą metod planimetrycznych oraz stereologicznych. Przekroje oceniano za pomocą pomiaru liniowego oraz metody liczenia punków, natomiast objętość zmian metodą Cavallieri. Barwienie hematoksyliną i eozyną przeprowadzono w sposób rutynowy. Procedura barwienia skrawków nałożonych na szkiełka podstawowe składała się z następujących etapów: kąpiel w kuwecie z hematoksyliną ałunową przez 7-10 min, kąpiel w kuwecie z wodą destylowaną, płukanie bieżącą wodą przez 15 minut, kąpiel w kuwecie z wodą destylowaną, kąpiel w kuwecie z 1% eozyną Y z dodatkiem jednej kropli kwasu octowego, kąpiel w kuwecie z wodą destylowaną. Natomiast w 44 przypadkach z grupy kontrolnej, składającej się z kobiet diagnozowanych i leczonych w tym samym okresie z powodu nieonkologicznych schorzeń ginekologicznych nie wykazano zmian patologicznych w obrębie szyjki macicy. Metodyka obserwacji klinicznej kobiet ze zmianami o charakterze SPI, CIN1 i CIN2 U 138 kobiet grupy badanej przeprowadzono obserwację zachowania się subJ. Wyroba i wsp. Rycina 2 Subkliniczna infekcja HPV. Subclinical HPV infection. klinicznej infekcji HPV- SPI (n=50), CIN 1 (n=50) i CIN 2 (n=38) przez okres 6 lat. Badania kontrolne cytologiczno-kolposkopowe przeprowadzano co 6 miesięcy. W przypadkach nieprawidłowych wyników kolposkopowo- cytologicznych pod kontrolą kolposkopii pobierano wycinki do badania histopatologicznego. Natomiast badanie wirusologiczne (HC2 i mRNA E6/E7 HPV) na początku obserwacji, w przypadkach stwierdzenia progresji lub regresji zmian, oraz po co najmniej 6 letniej obserwacji zmian utrzymujących się jako proces stacjonarny. Uzyskane wyniki porównywano w grupach kobiet, u których zmiany uległy progresji, remisji lub utrzymywały się jako stan stacjonarny. Metody statystyczne W analizie statystycznej zebranego materiału zastosowano test u-Manna-Whitneya dla porównywania parametrów ilościowych w grupie badanej i kontrolnej. Wyniki Nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic pomiędzy częstością występowania regresji w 6 letniej obserwacji u pacjentek z SPI i pacjentek z CIN1. Również nie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic w częstości występowania regresji w grupach pacjentek z CIN1 i z CIN2. Natomiast regresja znamiennie częściej występuje (p=0,038) u pacjentek z SPI, niż u pacjentek z CIN2. Stan stacjonarny w trakcie 6-letniej obserwacji występował znamiennie (p=0,050) częściej u pacjentek z CIN1 niż u pacjentek z SPI. Również u pacjentek z CIN2 stan stacjonarny występował znamiennie (p=0,022) częściej, niż u pacjentek z SPI. Nie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic w częstości występowania stanu stacjonarnego w grupach pacjentek z CIN1 i z CIN2. Porównanie 6-letnich obserwacji dotyczących wyników leczenia pacjentek z SPI i z CIN1 wskazuje na brak istotnych różnic pomiędzy tymi grupami w zakresie występowania progresji do CIN2. W grupie pacjentek z CIN2 znamiennie (p=0,027) częściej występowała progresja do CIN3, niż w grupie pacjentek z SPI. W grupie pacjentek z CIN2 znamiennie (p=0,027) Przegląd Lekarski 2015 / 72 / 11 Rycina 3 Subkliniczna infekcja HPV. Subclinical HPV infection. Tabela I Subkliniczna infekcja HPV. Subclinical HPV infection. N 50 (100%) Progresja do Stan stacjonarny Remisja CIN1 CIN2 Remisja i nawrót CIN3 n % n % n % n % n % n % 38 76 4 8 4 8 2 4 0 0 2 4 Tabela II Zachowanie się śródnabłonkowej neoplazji CIN1 i CIN2. Czas obserwacji 6 lat. Changes in CIN 1 and CIN 2 during 6 years observation. Remisja Rodzaj zmiany N całkowita częściowa Progresja do Stan stacjonarny CIN2 Remisja i nawrót CIN3 n % n % n % n % n % n % 52 0 0 8 16 6 12 3 6 7 14 36,84 3 7,89 3 7,89 - - 12* 31,57 6 15,78 CIN1 50 26 CIN2 38 14 * w 4 przypadkach do CIS częściej występowała progresja do CIN3, niż w grupie pacjentek z CIN1. Nie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic w częstości występowania progresji do raka szyjki macicy pomiędzy trzema analizowanymi grupami pacjentek tj. z SPI, CIN1 i z CIN2. Stwierdzono również brak statystycznie znamiennych różnic w częstości występowania progresji do CIN3 w trakcie 6-letniej obserwacji pomiędzy grupami pacjentek z SPI i z CIN1. Wyniki obserwacji przebiegu subklinicznej postaci infekcji HPV (SPI) oraz CIN w stopniu 1 i 2. Zmiany kolposkopowo-cytologiczne (Tab. I) charakterystyczne dla subklinicznej infekcji HPV obserwowane przez okres 6 lat wykazały w w 38 (76%) remisję zmian, w 4 (8%) zmiany utrzymywały się jako proces stacjonarny, w 6 (12%) przypadkach uległy progresji do CIN, w tym w 4 (8%) do CIN1, w 2 (4%) do CIN2. W 2 (4%) przypadkach po spontanicznej regresji zmian nastąpił nawrót zmiany. Obrazy kolposkopowe SPI można pokazać na kolpofotografii (Ryc. 2,3). Przeprowadzona obserwacja cytolo- giczno- kolposkopowa (Tab. II) zmian o charakterze CIN1 i CIN2 przez okres 4-5 lat bez leczenia wykazała w 26 (52%) przypadkach remisję CIN1. W 8 (16%) przypadkach zmiana CIN1 utrzymywała się jako stan stacjonarny. W 6 (12%) przypadkach zmiana CIN1 uległa progresji do CIN2 i w 3 (6%) do CIN3. W 7 (14%) przypadkach obserwowano nawrót zmiany. Natomiast taka obserwacja CIN2 wykazała w 14 (36,84%) przypadkach całkowitą remisję do CIN1, w 12 (31,57%) progresję do CIN3, w tym w 4 przypadkach do CIS. W 3 (7,89%) przypadkach zmiana CIN2 utrzymywała się jako stan stacjonarny i również w 3 (7,89%) przypadkach nastąpiła częściowa remisja, natomiast w 6 (15,78%) przypadkach wystąpił nawrót zmian. Porównanie odsetka remisji i progresji (Tab. III) zmian o charakterze SPI, CIN1 i CIN2 wykazało, że subkliniczna infekcja HPV uległa regresji w 38 (76%) przypadkach a progresji w 6 (12%) przypadkach, w tym w 4 do CIN1 i w 2 do CIN2. CIN1 w 26 (52%) przypadkach uległa całkowitej remisji a progresji w 9 (18%) przypadkach , w tym w 6 do CIN2 i 3 do CIN3. CIN2 w 14 (36,8%) przypadkach uległa całkowitej remisji i w 12 625 (31,6%) przypadkach progresji do CIN3, w tym w 4 przypadkach do CIS. Kolpofotografia CIN1 – remisja, SPIremisja, CIN2 etc. Przeprowadzona analiza zachowania się zmian w obrębie szyjki macicy w zależności od typu HPV (Tab. IV) wykazała, że w 6 przypadkach zmian o charakterze SPI doszło do progresji do CIN w obecności zakażenia HPV o wysokim potencjale onkogennym (4 przypadki HR i 2 przypadki LR +HR), natomiast w 26 przypadkach zakażenia typami o niskim potencjale onkogennym (LR) i 3 przypadkach mieszanej infekcji (HR+LR) doszło do spontanicznej remisji zmian o charakterze SPI. W 9 (12%) przypadkach zmian o charakterze CIN 1 doszło do progresji do CIN wyższego stopnia, w tym w 8 przypadkach występowania wirusów o wysokim potencjale onkogennym (5 przypadków HR i 3 przypadki mieszanej infekcji) i w jednym przypadku z zakażeniem HPV o niskim potencjale onkogennym. Natomiast do spontanicznej remisji zmian o charakterze CIN1 doszło w26 (52%) przypadkach, głównie przy współistniejącym zakażeniu HPV o niskim potencjale onkogennym (23 przypadki LR i 2 przypadki mieszanej infekcji). U 12 (31,6%) kobiet z CIN2 w ciągu 4-5 letniej obserwacji zaobserwowano progresję do CIN3 i CIS i we wszystkich tych przypadkach stwierdzano obecność DNA HPV o wysokim potencjale onkogennym (9 przypadków HR i 3 przypadki postaci mieszanej infekcji HR+LR). Do remisji zmian CIN2 doszło w 14 (36,8%) przypadkach, w tym w 12 przypadkach infekcji HPV o niskim potencjale onkogennym i 1 przypadku mieszanej postaci zakażenia HPV. Łącznie do remisji zmian o charakterze SPI, CIN1 i CIN2 doszło w 78 (56,6%) przypadków, w tym w 61 (78,2%) przypadkach zakażenia HPV o niskim potencjale onkogennym i w 7 (5,2%) przypadkach obecności HPV o wysokim potencjale onkogennym. Natomiast progresję zmian obserwowano łącznie w 27 (19,6%) przypadkach, w tym w 26 (96,37%) w obecności DNA HPV o wysokim potencjale onkogennym i zaledwie w 1 (3,7%) przypadku obecności DNA HPV o niskim potencjale onkogennym. Analiza zachowania się zmian w obrębie szyjki macicy o charakterze SPI, CIN1 i CIN2 w zależności od obecności transkryptorów genów E6 i E7 HPV 16, 18, 31, 33 i 45 wykazała, że na 138 obserwowanych przypadków do progresji zmian doszło u 27 (19,56%) kobiet, głównie w obecności m RNA E6 i E7 - 20 (74,1%) przypadków (Tab. V). Do remisji zmian doszło natomiast w 78 (56,52%), głównie w przypadkach braku obecności transkryptorów E6 i E7 HPV- 76 (97,4%) kobiet. Omówienie Wheeler i wsp. w swojej analizie obejmującej populację kobiet amerykańskich wykazali, że w 70-90% przypadków CIN1 ustępuje samoistnie, natomiast CIN2 i CIN3 ulegają progresji lub utrzymują się odpowiednio w 57 i 70% przypadków [10]. W metaanalizie badań nad zachowaniem się śródnabłonkowej neoplazji szyjki 626 Tabela III Porównanie odsetka całkowitej remisji i progresji zmian o charakterze SPI, CIN1 i CIN2. Comparition of complite remission and progression of SPI, CIN1 and CIN2. Rodzaj zmiany N SPI Całkowita remisja Progresja p n % n % 50 38 76,0 6 12,0 CIN1 50 26 52,0 9 18,0 CIN2 38 14 36,8 12 31,6 Σ 138 78 56,5 27 19,6 Test Chi <0,005 2 macicy, przeprowadzonej przez Östora [7], który nie uwzględnił zakażenia wirusem ludzkiego brodawczaka, odsetki remisji zmian śródnabłonkowych szyjki macicy są nieco niższe, niż w badaniach Syrjänena [8], który oceniał obecność zakażenia HPV. Należy zaznaczyć, że w części przypadków remisja zmian nie jest na pewno wynikiem procesu spontanicznego, a może być skutkiem usunięcia całej zmiany w trakcie biopsji szyjki macicy pod kontrolą kolposkopii, jaka miała miejsce we wszystkich tych przypadkach. Osobnego komentarza wymaga obserwacja prospektywna zmian o charakterze CIN3 obejmujących również przypadki raka in situ szyjki macicy, która jest nie do zaakceptowania z punktu widzenia etyki lekarskiej szczególnie, że w badaniach tych miały miejsce przypadki progresji zmian do raka inwazyjnego szyjki macicy. Według danych literatury przedmiotu i własnych obserwacji, w znakomitej większości przypadków rak szyjki macicy jest poprzedzony śródnabłonkową neoplazją szyjki macicy, trwającą od kilku do nawet kilkunastu lat. Szczegółowego wyjaśnienia wymagają jedynie przypadki tak zwanego „rapid carcinoma” opisywane w literaturze. Przypadki te mogą być wynikiem tzw. jednoetapowego rozwoju raka bez poprzedzających go stanów przedrakowych, co jednak wydaje się mało prawdopodobne. Przypadki te są raczej wynikiem tzw. cichego rozwoju procesu karcinogenezy, nieuchwyconego we wcześniejszym postępowaniu diagnostycznym [10,11]. Jak wynika z przeprowadzonego badania, stwierdzenie obecności DNA HPV wysokiego ryzyka wiązało się z 9,9-krotnym zwiększeniem ryzyka progresji zmian o charakterze CIN a stwierdzenie przetrwałego zakażenia HPV definiowanego jako obecność ekspresji transkryptorów E6/E7 mRNA HPV zwiększało iloraz szans wystąpienia progresji CIN1 do CIN wyższych stopni i do raka szyjki macicy 306,18 razy. W przeprowadzonym niniejszym badaniu nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic pomiędzy częstością występowania regresji w 4-5 letniej obserwacji u pacjentek z SPI i pacjentek z CIN1. Również nie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic w częstości występowania regresji w grupach pacjentek z CIN1 i z CIN2. Natomiast regresja znamiennie częściej występowała (p=0,038) u pacjentek z SPI niż u pacjentek z CIN2. Stan stacjonarny w trakcie 4-5 letniej obserwacji występował znamiennie (p=0,050) częściej u pacjentek z CIN1 niż u pacjen- tek z SPI. Również u pacjentek z CIN2 stan stacjonarny występował znamiennie (p=0,022) częściej niż u pacjentek z SPI. Nie stwierdzono statystycznie znamiennych różnic w częstości występowania stanu stacjonarnego w grupach pacjentek z CIN1 i z CIN2. Może to świadczyć o niestałym, dynamicznym charakterze SPI, w którym czynniki immunologiczne odgrywają istotną rolę. W porównaniu z CIN1, w którym istnieją już cytologiczne znamiona zakażenia HPV (koilocytoza, dyskeratoza itp.), SPI cechuje się również, wyższym odsetkiem remisji w porównaniu z CIN 1 gdyż w CIN1 strategia unikania rozpoznania zakażenia HPV przez układ immunologiczny jest już realizowana. Porównanie 4-5 letnich obserwacji zachowania się pacjentek z SPI i z CIN1 wskazuje na brak istotnych różnic pomiędzy tymi grupami w zakresie występowania progresji do CIN2. Potwierdzać to może obserwacje innych autorów [12-15], że CIN1 jest morfologiczną manifestacją produktywnego zakażenia HPV, ale być może czas obserwacji jest zbyt krótki. W grupie pacjentek z CIN2 znamiennie częściej (p=0,027) występowała progresja do CIN3 niż w grupie pacjentek z SPI. W grupie pacjentek z CIN2 znamiennie (p=0,027) częściej występowała progresja do CIN3 niż w grupie pacjentek z CIN1. Świadczy to o stosunkowo dużym potencjale progresji zmian CIN2, w których niektórzy patomorfolodzy doszukują się początkowych znamion morfologicznych CIN3. Schiffman [14] i Rodrigez [15] na podstawie analizy blisko 10 000 kobiet znajdujących się w bazie danych Narodowego Instytutu Raka w USA wysnuli podobne wnioski. Badania epidemiologiczne przeprowadzone na populacji dorosłych kobiety wykazały, że CIN1 ulega regresji w 7080% przypadków, podczas gdy u młodych dziewcząt (adolescentek) odsetek regresji CIN1 sięga 90 % [12]. Z uwagi na tak wysoki odsetek spontanicznego cofania się zmian u młodych dziewcząt, w większości krajów zaleca się postępowanie zachowawcze, polegające raczej na obserwacji CIN niż stosowaniu leczenia [16-19]. Stosowanie technik operacyjnych a w szczególności konizacja, dodatkowo zwiększa ryzyko wystąpienia porodów przedwczesnych, zwłaszcza w ciążach bliźniaczych [20]. Natomiast zmiany o charakterze CIN3, które uważa się za prawdziwe zmiany przedrakowe wykazują potencjał progresji do raka inwazyjnego wynoszący 0,2-4% w przeciągu 12 miesięcy [21]. J. Wyroba i wsp. Tabela IV Remisja i progresja SPI oraz CIN1 i CIN2 a typy współistniejącej infekcji HPV. Remission and progression of SPI, CIN1 and CIN2 in different HPV risk groups. Remisja Progresja Charakter zmiany N LR HR LR+HR Σ % LR HR LR+HR Σ % SPI 50 26 0 3 38* 76,0 0 4 2 6 12,0 CIN1 50 23 1 2 26 52,0 1 3 5 9 18,0 CIN2 38 12 - 1 14** 36,8 0 9 3 12 31,6 Σ 138*** 61 (78,2%) 1 6 78 56,6 1 (3,7%) 16 10 27 19,6 7 (5,1%) 26 (96,3%) * w 9 przypadkach, u których wystąpiła remisja SPI, techniką HC2 nie stwierdzono infekcji HPV. ** w jednym przypadku diagnostyka HPV techniką HC2 nie wykazała obecności DNA HPV. *** w 33 przypadkach zmiany utrzymywały się lub uległy remisji i następnie nawrotowi. Tabela V Remisja i progresja zmian o charakterze SPI oraz CIN1 i CIN2 a obecność transkryptorów genów E6 i E7 HPV 16, 18, 31, 33 i 45. Remission and progression in SPI, CIN1 and CIN 2 compared to presens of E6 i E7 HPV 16, 18, 31 and 45 genes transcriptors. Remisja Charakter zmiany N SPI mRNA (+) Progresja mRNA (-) 6 mRNA (-) n % n % 6 n % n % Σ 50 1 2,6 37 97,4 38 4 66,7 2 33,3 6 CIN1 50 1 3,8 25 96,2 26 5 55,6 4 44,4 9 CIN2 38 0 0,0 14 100,0 14 11 91,7 1 8,3 12 Σ 138 2 2,6 76 97,4 78 20 74,1 7 25,9 27 p<0,001 Zachowanie się biologiczne CIN2 budzi więcej kontrowersji. Wielu klinicystów uważa CIN2 za zmianę przedrakową i dlatego rutynowo poddaje ją leczeniu [22]. Roczny odsetek regresji zmian o charakterze CIN 2 u kobiet dojrzałych szacuje się na 15-23%, a w perspektywie 4-5 letniej obserwacji sięga on 55% [23,24]. W naszej prospektywnej obserwacji, regresja CIN2 dotyczyła 52,5% przypadków. Natomiast progresja CIN2 wystąpiła w 21% przypadków, w tym do CIN3 w 18,42% a do raka inwazyjnego w 2,63% przypadków. U młodych dziewcząt, podobnie jak CIN1, zmiany o charakterze CIN2 wydają się mieć większą skłonność do regresji. W badaniu Moora i wsp. [24] odsetek regresji zmian o charakterze CIN2 wyniósł 65% a progresji do CIN3 13%. W dużym badaniu Fuchs i wsp. [25] wykazali, że 39% zmian CIN2 ulega spontanicznej regresji w ciągu 12 miesięcy a 92% w ciągu 3 lat. Niewątpliwie wyjątkowo niski odsetek inwazyjnego raka szyjki macicy w populacji młodych kobiet stanowi kolejną przesłankę do stwierdzenia, że proces karcinogenezy w obrębie szyjki macicy jest procesem wieloetapowym, trwającym kilka do kilkunastu lat i o zależnym również od pozawirusowych kofaktorów. W badaniu Moscicki i wsp. [12] spośród 95 młodych kobiet z CIN2 regresję zmian stwierdzono u 70% z nich w ciągu 3 lat. Ten odsetek regresji zmian był wyższy niż w starszych badaniach klinicznych. Syrjanen i wsp. [26] stwierdzili odsetek regresji CIN2 wynoszący 53% a odsetek progresji Przegląd Lekarski 2015 / 72 / 11 tych zmian wyniósł 21%. To badanie obejmowało nieco starsze kobiety niż badanie Moscicki a ponadto nie u wszystkich kobiet CIN potwierdzono badaniem histologicznym szyjki macicy. Odsetek ten stwierdzono dla rozpoznań cytologicznych. Natomiast wśród histologicznie potwierdzonych rozpoznań CIN2 odsetek regresji wyniósł 34% a odsetek progresji – 20% [27]. W innym badaniu Nasiell i wsp. [28] również wykazali niższy odsetek regresji zmian CIN wynoszący- 54% a progresji- 30%. Wszystkie ta badania sugerują, że CIN2 może cechować się odmienną charakterystyką biologiczną lub, że klasyfikacja morfologiczna nie dość dokładnie odzwierciedla biologiczny potencjał tej zmiany. Niektórzy badacze uważają, że nie istnieje coś takiego jak CIN2. Większość zgadza się, że powtarzalność histologicznego rozpoznania CIN2 jest niska [29,30]. Wciąż niejednoznaczne wnioski wynikają z badań nad koinfekcjami bakteryjnymi w progresji zmian CIN. W ciekawym badaniu Moscicki i wsp. [12] zaobserwowała, że współistniejące zakażenie N. gonorrhoeae wiązało się ze zwiększonym odsetkiem regresji zmian o charakterze CIN2. Wysunęli oni hipotezę, że intensywny odczyn zapalny spowodowany rzeżączką wiąże się nieoczekiwanie z pozbyciem się przez organizm zakażenia wirusowego. Niezależnie w cytowanym badaniu stwierdzono, że zakażenie HPV typami 16/18 wiązało się z 20-krotnym zwiększeniem ryzyka progresji CIN. W badaniu Xiaolei i wsp. [31] wykazano, że koinfekcja Ureaplasma Urealiticum może nasilać efekt mutagenny HPV i tym samym prowadzić do do częstszych progresji zmian CIN. Nie możemy zapominać że infekcja HPV oraz zmiany o typie CIN wiążą się nie tylko ze zmianami w obrębie narządów płciowych, ale także z rozwojem nowotworów innych narządów, szczególna rola infekcji HPV 16 jest podkreślana w przypadku raka odbytu [32]. Wnioski 1. Zmiany o charakterze subklinicznej infekcji HPV, CIN1 i CIN2 w obrębie szyjki macicy są zmianami, mogącymi ulegać progresji do wyższych stopni CIN i do raka szyjki macicy, mogącymi przez wiele lat pozostawać w stanie stacjonarnym a nawet ulegać remisji. 2. Zakażenie HPV typami o wysokim potencjale onkogennym ma znaczenie nie tylko w inicjacji, ale również w rozwoju procesu karcinogenezy w obrębie szyjki macicy poprzez kilka niezależnych mechanizmów. Piśmiennictwo 1. http://globocan.iarc.fr/ 2. Alberico S, Facca MC, Di Bonito L, Millo R, Casaccia R. et al: Frequency of cervico-vaginal infections (Trichomonas vaginalis; Chlamydia trachomatis -CHL-; herpes simplex virus -HSV-; human papilloma virus -HPV-) in cervical intraepithelial neoplasia. Eur J Gynecol Oncol. 1988; 9: 252-257. 3. Smith L, Angarone MP: Sexually Transmitted Infections. Urol Clin North Am. 2015; 42: 507-518. 4. Rotkin K, King W: Relation of adolescent coitus to cervical cancer risk. JAMA. 1962; 179: 486-491. 5. Singer A: Circumcision and cervical cancer. Lancet 1966; 1: 137. 6. Schiffman M, Solomon D: Findings to date from the ASCUS-LSIL Triage Study (ALTS). Arch Pathol Lab Med. 2003; 127: 946-949. 7. Östor AG: Natural history of cervical intraepithelial neoplasia- a critical review. Inr J Gynecol Pathol. 1993; 12: 186-192. 8. Syrjänen E: Natural history of cervical HPV infection and CIN. Chapter 6 In Syrjänen K, Syrjänen S. Papillomavirus infection in human pathology. J. Willey & Sons New York. 2000: 142-166. 9. Hammes LS, Naud P, Passos EP, Matos J, Brouwers K. et al: Value of the International Federation for Cervical Pathology and Colposcopy (IFCPC) Terminology in predicting cervical disease. J Low Genit Tract Dis. 2007; 11: 158-165. 10. Wheeler CM: Natural history of human papillomavirus infections, cytologic and histologic abnormalities, and cancer. Obstet Gynecol Clin North Am. 2008; 35: 519-536. 11. Stoler MH: The virology of cervical neoplasia: an HPV- associated malignancy. Cancer J. 2003; 9: 360-367. 12. Moscicki AB, Shiboski S, Hills NK, Powell KJ, Jay N. et al: Regression of low-grade squamous intra-epithelial lesions in young women. Lancet 2004; 364: 1678-1683. 13. Johnson N, Khalili M, Hirschowitz L, Ralli F, Porter R: Predicting residual disease after excision of cervical dysplasia. BJOG 2003; 110: 952-955. 14. Lu CH, Liu FS, Kuo CJ, Chang CC, Ho ES: Prediction of persistence or recurrence after conization for cervical intraepithelial neoplasia 3. Obstet Gynecol. 2006; 107: 830-835. 15. Manu af Heurlin (81,82 Dokt Ingii). 16. Cox JT, Schiffman M, Solomon D: ASCUS-LSIL Triage Study (ALTS) Group. Prospective follow-up suggests similar risk of subsequent cervical intraepithelial neoplasia grade 2 or 3 among women with cervical intraepithelial neoplasia grade 1 or negative colposcopy and directed biopsy. Am J Obstet Gynecol. 2003; 188: 1406–1412. 17. Nassiel K, Nassiel M, Vaclavinkova V: Behavior of moderate cervical dysplasia during long term followup. 1983; 61: 609–614. 18. Syrjanen K, Kataja V, Yliskoski M, Chang F, 627 Syrjanen S: Natural history of cervical human papillomavirus lesions does not substantiate the biologic relevance of the bethesda system. 1992; 79: 675–682. 19. Wright TC, Massad LS, Dunton CJ, Spitzer M, Wilkinson EJ, Solomon D: 2006 consensus guidelines for the management of women with cervical intraepithelial neoplasia or adenocarcinoma in situ. Am J Obstet Gynecol. 2007; 197: 340–345. 20. Pinborg A, Ortof G, Loft A, Rasmussen SC, Ingerslev HV: Cervical conization doubles the risk of preterm and very preterm birth in assisted reproductive technology twin pregnancies. Hum Reprod. 2015; 30: 197-204. 21. Goldie SJ, Kohli M, Grima D, Weinstein MC, Wright TC. et al: Projected clinical benefits and cost-effectiveness of a human papillomavirus 16/18 vaccine. J Natl Cancer Inst. 2004; 96: 604–615. 22. Castle PE, Schiffman M, Wheeler CM, Solomon D: Evidence for frequent regression of cervical intraepithelial neoplasia-grade 2. 2009; 113: 18–25. 628 23. Insinga RP, Dasbach EJ, Elbasha EH: Epidemiologic natural history and clinical management of human papillomavirus (HPV) disease: a critical and systematic review of the literature in the development of an HPV dynamic transmission model. BMC Infect Dis. 2009; 9: 119. 24. Moore K, Cofer A, Elliot L, Lanneau G, Walker J, Gold MA: Adolescent cervical dysplasia: histologic evaluation, treatment, and outcomes. Am J Obstet Gynecol. 2007; 197: 141, e1–6. 25. Fuchs K, Weitzen S, Wu L, Phipps MG, Boardman LA: Management of cervical intraepithelial neoplasia 2 in adolescent and young women. J Pediatr Adolesc Gynecol. 2007; 20: 269–274. 26. Syrjanen K, Kataja V, Yliskoski M, Chang F, Syrjanen S: Natural history of cervical human papillomavirus lesions does not substantiate the biologic relevance of the bethesda system. 1992; 79: 675–682. 27. Kataja V, Syrjanen K, Mantyjarvi R, Vayrynen M, Syrjanen S. et al: Prospective follow-up of cervical HPV infections: life table analysis of histopathological, cytological and colposcopic data. Eur J Epidemiol. 1989; 5: 1–7. 28. Nassiel K, Nassiel M, Vaclavinkova V: Behavior of moderate cervical dysplasia during long term followup. 1983; 61: 609–614. 29. Castle PE, Schiffman M, Wheeler CM, Solomon D: Evidence for frequent regression of cervical intraepithelial neoplasia-grade 2. 2009; 113: 18–25. 30. Dalla Palma P, Giorgi Rossi P, Collina G, Buccoliero AM, Ghiringhello B. et al: The reproducibility of CIN diagnoses among different pathologists: data from histology reviews from a multicenter randomized study. Am J Clin Pathol. 2009; 132: 125–132. 31. Xiaolei C, Taot H, Zongli S, Honrying Y: The role of ureaplasma urealiticum infection in carvical intraepithelial neoplasia and cervical cancer. Eur J Gynaecol Oncol. 2014; 35: 571-575. 32. Sehnal B, Dusek L, Cibula D, Zima T, Halaska M. et al: The relationship between the cervival and anal HPV infection in women with cervical intraepitelial neoplasia. J Clin Virol. 2014; 59: 18-23. J. Wyroba i wsp.
