Folia Medica Lodziensia

advertisement
Folia Medica Lodziensia
tom 33 suplement 2
2006
Przemysław Lewkowicz
ROLA AKTYWOWANYCH LIPOPOLISACHARYDEM
LIMFOCYTÓW T REGULATOROWYCH CD4+CD25+
W MODULOWANIU AKTYWNOŚCI, APOPTOZY I ŚMIERCI
LUDZKICH NEUTROFILI
PRACA HABILITACYJNA
Zakład Immunologii Klinicznej
Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi
Kierownik Zakładu:
Prof. dr hab. n. med. Henryk Tchórzewski
2006
SPIS TREŚCI
Wykaz stosowanych skrótów .................................................................................................. 9
1. Wstęp ....................................................................................................................................
1.1. Wprowadzenie ...............................................................................................................
1.2. Rozpoznanie drobnoustrojów i aktywacja neutrofili .......................................................
1.2.1. Rola receptorów Toll-podobnych w obronie przed patogenami i w regulacji
odpowiedzi immunologicznej .................................................................................
1.2.2. Lipopolisacharyd jako cząstka PAMP stymulująca odpowiedź immunologiczną..
1.2.3. Rola ludzkich neutrofili w przebiegu procesu zapalnego.......................................
1.2.4. Patofizjologiczne znaczenie aktywacji neutrofili.....................................................
1.2.5. Antyoksydanty jako nieswoiste czynniki zapobiegające konsekwencjom stresu
oksydacyjnego w przebiegu zapalenia...................................................................
1.2.6. Apoptoza neutrofili - główny mechanizmu utrzymania homeostazy zapalenia ....
1.3. Limfocyty T regulatorowe CD4+CD25+ ...........................................................................
1.3.1. Charakterystyka fenotypowa limfocytów T regulatorowych CD4+CD25+ oraz
metody ich izolacji ..................................................................................................
1.3.2. Funkcje limfocytów CD4+CD25+ w badaniach in vitro............................................
1.3.3. Mechanizmy oddziaływania limfocytów Treg CD4+CD25+na komórki efektorowe
1.3.4. Rola komórek Treg w kontroli odpowiedzi przeciwinfekcyjnej...............................
1.3.5. Regulacja funkcji limfocytów Treg CD4+CD25+ ....................................................
2. ZałoŜenia i cel pracy .............................................................................................................
3. Materiał i metody ...................................................................................................................
3.1. Materiał ..........................................................................................................................
3.2. Metody ...........................................................................................................................
3.2.1. Izolacja komórek i układy badawcze......................................................................
3.2.1.1. Neutrofile ............................................................................................................
3.2.1.2. Limfocyty Treg CD4+CD25+high i CD4+CD25- .....................................................
3.2.1.3. Układy badawcze...............................................................................................
3.2.2. Analiza obecności receptorów TLR4 na limfocytach Treg ....................................
3.2.2.1. Analiza ekspresji mRNA ...................................................................................
3.2.2.2. Analiza cytometryczna ekspresji receptorów TLR4 na powierzchni
limfocytów .........................................................................................................
3.2.3. Ocena aktywności jądrowego czynnika transkrypcyjnego FoxP3 .........................
3.2.3.1. Analiza cytometryczna ......................................................................................
3.2.3.2. Analiza mRNA dla białka FoxP3 metodą real-time reverse transcription (RT)
PCR ...................................................................................................................
3.2.4. Ocena produkcji reaktywnych form tlenu ..............................................................
3.2.5. Ocena ekspresji CD11b i CD62L ..........................................................................
3.2.6. Ocena wytwarzania cytokin IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α i TGF-β1..............................
3.2.7. Ocena apoptozy metodą znakowania komórek Aneksyną V oraz jodkiem
propidyny ...............................................................................................................
3.2.8. Analiza ekspresji receptora CD16 (FcγRIII) ..........................................................
3.2.9. Analiza statystyczna ..............................................................................................
4. Wyniki ....................................................................................................................................
4.1. Analiza mRNA i ekspresji powierzchniowej TLR4 na limfocytach Treg .......................
4.2. Analiza aktywności jądrowego czynnika transkrypcyjnego FoxP3 ................................
13
13
15
15
18
21
23
24
25
26
29
32
33
38
39
41
45
45
45
45
45
46
48
50
50
51
51
52
52
53
54
54
55
56
56
57
57
60
5.
6.
7.
8.
9.
4.3. Analiza produkcji reaktywnych form tlenu przez neutrofile w obecności
limfocytów Treg .............................................................................................................. 62
4.4. Analiza ekspresji molekuł adhezyjnych CD11b i CD62L .............................................. 66
4.5. Analiza wytwarzania TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10 i TGF-β1 ................................................. 68
4.6. Analiza apoptozy i śmierci neutrofili ............................................................................... 72
4.6.1. Aneksyna V vs jodek propidyny ........................................................................... 73
4.6.2. CD16 ..................................................................................................................... 80
4.6.3. Ocena Ŝywotności neutrofili w mieszanych inkubacjach z limfocytami Treg ...... 82
Dyskusja ................................................................................................................................ 85
Wnioski .................................................................................................................................. 96
Piśmiennictwo ....................................................................................................................... 97
Streszczenie ........................................................................................................................ 113
Abstract ............................................................................................................................... 117
Folia Medica Lodziensia, 2006, 33/S2:9-119
ROLA AKTYWOWANYCH LIPOPOLISACHARYDEM
LIMFOCYTÓW T REGULATOROWYCH CD4+CD25+
W MODULOWANIU AKTYWNOŚCI, APOPTOZY I ŚMIERCI
LUDZKICH NEUTROFILI
PRZEMYSŁAW LEWKOWICZ
STRESZCZENIE
Funkcjonowanie
układu
immunologicznego
oparte
jest
o
współdziałanie
komórek
immunokompetentnych. Zarówno w narządach limfatycznych, jak i w ognisku zapalnym komórki
znajdują się w bezpośrednim kontakcie; mogą one wzajemnie wpływać i modulować swoje funkcje
na zasadzie wydzielania biologicznie aktywnych substancji (np. cytokin, reaktywnych form tlenu,
reaktywnych form azotu, enzymów proteolitycznych, czynników wzrostowych) oraz bezpośrednio
na skutek kontaktu receptorów powierzchniowych. Limfocyty T regulatorowe CD4+CD25+ (Treg)
odgrywają kluczową rolę w hamowaniu odpowiedzi immunologicznej i zapobieganiu reakcjom
autoimmunizacyjnym. Ich działanie hamujące w stosunku do limfocytów T efektorowych
CD4+CD25- było przedmiotem licznych badań zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo. Okazuje
się jednak, Ŝe moŜliwe są takŜe interakcje limfocytów Treg z innymi komórkami układu
immunologicznego, m. in. limfocytami T CD8+, komórkami dendrytycznymi czy monocytami.
MoŜliwość regulacji funkcji komórek odporności wrodzonej, przez młodsze filogenetycznie
limfocyty Treg wydaje się być kontrowersyjna. Wspólnym mianownikiem łączącym układ
odporności wrodzonej i nabytej mogą być receptory odpowiedzialne za rozpoznanie patogenów,
takie jak receptory Toll podobne (Toll-like receptors; TLR), znajdujące się zarówno na komórkach
odporności wrodzonej, jak i limfocytach T i B. W ostatnich latach pojawiły się równieŜ dowody
przemawiające za tym, Ŝe funkcje limfocytów Treg mogą być bezpośrednio regulowane przez TLR.
Tym samym istnieje moŜliwość oddziaływania tych samych ligandów TLR zarówno na neutrofile
czy monocyty, jak równieŜ limfocyty Treg, a konsekwencje takiego działania są do tej pory
nieznane.
Celem pracy była ocena wpływu limfocytów Treg CD4+CD25+ na funkcje neutrofili, a takŜe roli
lipopolisacharydu (LPS), waŜnego stymulatora odpowiedzi immunologicznej pochodzenia bakteryjnego działającego przez TLR4, w modulowaniu interakcji pomiędzy neutrofilami i limfocytami
Treg. Ze względu na to, Ŝe obecność TLR4 na limfocytach Treg CD4+CD25+ nie została jednoznacznie potwierdzona we wcześniejszych badaniach innych autorów, oceniono TLR4 metodą
cytometrii przepływowej i metodą półilościową RT-PCR. W niniejszej pracy jednoznacznie
potwierdzono znacznie większą ekspresje TLR4, zarówno na powierzchni limfocytów Treg, jak i na
poziomie mRNA, w porównaniu do limfocytów T efektorowych CD4+CD25-. Wykazano równieŜ
funkcjonalne znaczenie tych receptorów po stymulacji komórek LPS lub przeciwciałami anty-CD3
i anty-CD28. Zaobserwowano bowiem podobną zmianę w ekspresji wewnątrzkomórkowego
czynnika transkrypcyjnego FoxP3 dla obu typów stymulatorów.
Następnie przeprowadzono serię eksperymentów w hodowlach mieszanych limfocytów Treg
lub T efektorowych z neutrofilami. Neutrofile były inkubowane z odpowiednią populacją limfocytów
w stosunku 100:1 lub 10:1. Wykazano, Ŝe limfocyty Treg CD4+CD25+ mają wpływ na funkcje
neutrofili i ich apoptozę, a obecność LPS (liganda TLR4) znacząco oddziałuje na interakcje
międzykomórkowe. Limfocyty Treg aktywowane LPS są zdolne do hamowania wytwarzania
reaktywnych form tlenu i cytokin przez neutrofile, promują takŜe apoptozę i śmierć tych komórek.
Gdy limfocyty Treg były aktywowane za pośrednictwem TCR, stopień zahamowania funkcji
neutrofili był podobny, jak w przypadku stymulacji LPS. Co ciekawe, potencjał hamujący limfocytów
Treg aktywowanych LPS jest częściowo zaleŜny od wytwarzania cytokin hamujących IL-10
i TGF-β, podczas gdy po stymulacji limfocytów przy uŜyciu przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28 nie
zaobserwowano udziału cytokin. Ponadto działanie limfocytów Treg w stosunku do neutrofili jest
częściowo uzaleŜnione od interakcji CTLA-4 z receptorami B7.1 na neutrofilach. Wydaje się, Ŝe
głównym mechanizmem hamowania funkcji neutrofili przez limfocyty Treg jest indukcja apoptozy
i śmierci komórek, co zostało wykazane w szeregu eksperymentów oceniających Ŝywotność
neutrofili na podstawie wnikania barwników do ich wnętrza oraz zmian w ekspresji markerów
błonowych (CD16). Indukcja apoptozy była głównie udziałem uwalnianych przez limfocyty Treg
perforyn i granzymów, a w mniejszym stopniu zaangaŜowaniem drogi zaleŜnej od Fas/FasL.
Działanie limfocytów Treg zostało odnotowane w inkubacjach, gdzie proporcje badanych komórek
ustalono na 10:1 (neutrofile do limfocytów Treg).
Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano, Ŝe limfocyty regulatorowe T CD4+CD25+ są
zdolne do bezpośredniego hamowania funkcji neutrofili i skrócenia ich przeŜywalności, zwłaszcza
w obecności LPS. Poczynione obserwacje są nowatorskie i unikalne w skali światowej. Wyniki
obecnych badań pozwalają na sformułowanie oryginalnej hipotezy tłumaczącej mechanizmy
regulacji procesu zapalnego. W pierwszym etapie odpowiedzi immunologicznej w stosunku do
patogenów bakteryjnych dochodzi do chemotaksji i ekspozycji neutrofili na antygeny związane
z bakteriami (np. LPS) za pośrednictwem receptorów TLR. Na skutej tego dochodzi do aktywacji
wszystkich funkcji neutrofili i zahamowania ich apoptozy, co umoŜliwia skuteczną eliminację
patogenów. Jednocześnie cząstki bakteryjne oddziałują na napływające limfocyty T regulatorowe
CD4+CD25+, w wyniku czego ulegają one aktywacji. Tak aktywowane limfocyty Treg nie są zdolne
do hamowania potencjału przeciwbakteryjnego neutrofili uprzednio pobudzonych, ale mają
moŜliwość skutecznej neutralizacji neutrofili nowo przybyłych do ogniska zapalenia. Dzięki temu
w pierwszej fazie zapalenia komórki układu odporności nieswoistej mogą skutecznie eliminować
patogeny, natomiast w drugiej fazie działanie supresyjne limfocytów T regulatorowych chroni przed
skutkami nadmiernej i przedłuŜonej aktywacji neutrofili, co umoŜliwia rozpoczęcie gojenia
i naprawy tkanek.
ROLA AKTYWOWANYCH LIPOPOLISACHARYDEM
LIMFOCYTÓW T REGULATOROWYCH CD4+CD25+
W MODULOWANIU AKTYWNOŚCI, APOPTOZY I ŚMIERCI
LUDZKICH NEUTROFILI
PRZEMYSŁAW LEWKOWICZ
ABSTRACT
Function of immune system is based on the cooperation of immune cells. Both in lymphoid
organs and in the site of inflammation, immune cells remain in contact and can modulate their
function through the realize of active mediators (e.g. cytokines, reactive oxygen intermediators,
reactive nitric intermediators, photolytic enzymes, growth factors) or directly through the contact of
surface receptors. CD4+CD25+ T regulatory (Treg) cells play a central role in the suppression of
immune response and prevention of autoimmune reactions. Treg cell function towards CD4+CD25T effector cells has been thoroughly explored both in in vitro and in vivo studies. Recently, it has
been reveled that CD4+CD25+ Treg cells can also inhibit CD8+ T cells, dendritic cells and
monocytes. On the first sight, the possibility of innate immune cell regulation by phylogeneticly
younger Treg cells sounds controversial. Pathogen recognition receptors, such as toll-like
receptors (TLRs), which recently have been shown on T and B cells, could provide a critical link
between innate and acquired immune systems. There is also evidence that TLR ligands can
directly modulate the suppressive capacity of Treg cells. Thus, interactions between CD4+CD25+
Treg cells, innate immune cells and microorganisms seem to be very probable, but the
consequences of such interactions are still unknown.
In this study we suggest that during early immune response CD4+CD25+ Treg cells could be
attracted to the inflammatory environment, exposed to LPS and could interact with immune cells.
We investigated whether CD4+CD25+ Treg cells can directly modulate polymorphonuclear
neutrophil (PMN) function, and how the presence of LPS affects these interactions. Because it
remains controversial, whether LPS, a major component of Gram-negative bacterial wall, can
modulate T cell function, we first assessed TLR4 expression in T lymphocytes. We have shown
significantly higher expression of TLR4 at protein and mRNA level in CD4+CD25+ Treg compared
to CD4+CD25- T cells. Next, we demonstrated that LPS and anti-CD3/CD28 activation of Treg
contributed to comparable changes in FoxP3 protein expression. These findings suggest that TLR4
stimulation of CD4+CD25+ Treg cells results in their subsequent activation which is reflected by the
reduction of FoxP3 expression. Next we investigated changes in PMNs cocultured with
CD4+CD25+ Treg cells or CD4+CD25- T cells. As both CD4+ T cells and PMNs express TLR4, we
used ultrapure LPS to define a probable effect of CD4+CD25+ Treg on PMNs during TLR4
stimulation. As neutrophils are the most numerous leukocytes in blood as well as in the site of
acute immune response to Gram-negative bacteria, we cultured PMNs and T cells at a ratio 100:1
(equivalent to conditions in peripheral blood), and at a ratio 10:1, that may reflect physiological
proportions of PMNs and Tregs at the site of inflammation. Our study demonstrates that
CD4+CD25+ Treg cells affect neutrophil function and survival, and that TLR4 ligand is involved in
the regulation of the cell interactions. We found that LPS activated Treg cells inhibit reactive
oxygen intermediates and cytokine production by neutrophils. Moreover, Treg cells reverse LPSinduced survival of neutrophils and promote their apoptosis and death. We also found that TCR
activated Treg cells induce the same effects on PMNs as those achieved by TLR4 stimulation.
Importantly, the suppressive potential of CD4+CD25+ Treg cells induced by LPS seem to be
partially IL-10 and TGF-β dependent, whereas anti-CD3/CD28 stimulation is rather contact
dependent. CTLA-4/B7-1 interactions are partially responsible for the contact-dependent
mechanism of PMN inhibition by Treg cells. Induction of apoptosis and death of PMNs after their
contact with CD4+CD25+ Treg cells may be a crucial mechanism of PMN/Treg interactions. Our
studies revealed that Treg cells induced PI positivity in PMNs which is a typical marker of cell
death. We also demonstrated the decreased rate of viable neutrophils in coculture with Treg cells.
This may result from perforin/granzyme cytotoxity of CD4+CD25+ Treg cells against cells, as an
addition of EGTA to the cultures resulted in the reduction of apoptopic cell rate. Interestingly, CD95
blocking antibodies managed to inhibit partly the acceleration of neutrophil death in the presence of
stimulated Treg, which indicates multiple mechanisms are involved in Treg cell-mediated
suppression. When neutrophils were preincubated with LPS prior to the addition of Treg cells, they
became absolutely insensitive to proapoptopic effect of Tregs. This observation suggests that Treg
cells could inhibit only these cells which have not been activated yet.
On the strength of the data presented above, we propose a model, in which during an early
immune response, recruited neutrophils are first exposed to LPS at the site of inflammation that
results in the activation of their effector function. Treg cells appear later and become activated by
TLR ligands. Although, Treg cells fail to suppress PMNs which have been already activated, they
could potently prevent the activation of newly appeared neutrophils. This mechanism allows an
effective anti-microbial immune response which is crucial for resolution of infection. On the other
hand, Treg cells control the timely removal of PMNs from affected site in later stages of
inflammation and limit inappropriate inflammatory potential.
Download