cwiczenie 1 izolacja DNA teoria 2015

advertisement
Farmakogenetyka – Biotechnologia Medyczna Io
Ćwiczenie 1
Izolacja genomowego DNA różnymi metodami
Praca laboratoryjna z użyciem materiału biologicznego wymaga szczególnej dbałości
o prawidłowe wykonanie każdego etapu pracy, dlatego też tylko zastosowanie odpowiednich
warunków pobierania próbek, izolacji i przechowywania DNA zapewnia efektywne uzyskanie
pożądanego produktu. Szczególnie istotnym etapem pracy jest proces izolacji DNA.
Podstawą do analiz materiału genetycznego jest uzyskanie czystego (pozbawionego białek
i inhibitorów enzymów wykorzystywanych w następnych etapach pracy), wielkokocząsteczkowego
(nie zdegradowanego) preparatu DNA. Jakość otrzymanego izolatu DNA determinuje powodzenie
dalszych badań molekularnych. W warunkach laboratoryjnych izolację DNA, niezależnie
od wybranej przez nas metody, powinno się przeprowadzać z zastosowaniem jałowych materiałów
oraz odczynników, w taki sposób, aby uniknąć zanieczyszczenia preparatu obcym materiałem
genetycznym (musimy mieć pewność, że wynik badania dotyczy materiału badanego, a nie
przypadkowych zanieczyszczeń np. tkankami lub wydzielinami laboranta).
Do badań molekularnych wykorzystuje się najczęściej DNA wyizolowane z około 200 µl krwi
obwodowej, przy czym standardowo pobiera się co najmniej 1 ml, aby mieć możliwość
ewentualnego powtórzenia izolacji lub uzyskania większej ilości materiału do dalszych badań.
Coraz większą popularnością cieszą się metody izolacji DNA wykorzystujące wymazy. DNA
wyizolowane metodą wymazu z wewnętrznej powierzchni policzka stosuje się zazwyczaj
w sytuacjach, gdy nie ma możliwości pobrania krwi. Trzeba mieć na uwadze, że preparat uzyskany
z wymazu zawiera, oprócz DNA pacjenta, także materiał genetyczny bakterii i innych
mikroorganizmów zamieszkujących jego jamę ustną.
Do badań diagnostycznych krew pobierana jest do probówki z EDTA (EDTA - wersenian zapobiega pozaustrojowemu krzepnięciu krwi poprzez wiązanie jonów wapnia oraz hamuje
aktywność deoksyrybonukleaz). Wykorzystuje się również inne antykoagulanty, jak na przykład
heparyna, jednakże ich obecność może mieć znaczący wpływ na kolejne etapy pracy z analizowaną
próbką (mogą częściowo przechodzić do izolatu, są często inhibitorami reakcji PCR).
Metodyki izolacji DNA zalecają rozpoczęcie preparatyki niezwłocznie po pobraniu próbki.
W przypadku pracy z krwią dopuszcza się przechowywanie prób w 4°C przez kilka dni. Jeśli
w ciągu 48h od pobrania materiału nie zostanie on poddany izolacji, zaleca się go zamrozić
w buforze do lizy i przechowywać w -20°C. Można go także utrwalić w alkoholu. Krew jako
materiał do izolacji DNA nie jest stabilna w temperaturze –20°C, w razie dłuższego
przechowywania (powyżej kilku miesięcy) należy ją głęboko zamrozić (-80°C).
Wyizolowane DNA można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka godzin,
w temperaturze 4°C kilka miesięcy, a w temperaturze -80°C nieograniczony czas. Należy jednak
pamiętać, że częste rozmrażanie i zamrażanie powoduje degradację DNA.
Katedra Farmakologii PUM ∙ Powstańców Wlkp. 72 70-111 Szczecin ∙ tel. 91 466 1589
Farmakogenetyka – Biotechnologia Medyczna Io
Transportowanie próbek: wymaga prawidłowego zabezpieczenia ich przed zniszczeniem
i zmianami warunków przewożenia, szczelnego zamknięcia probówek oraz starannego oznaczenia
prób.
Uwaga: Krew jest materiałem potencjalnie zakaźnym. Podczas wszystkich etapów pracy (także
z uzyskanymi izolatami DNA) obowiązuje odzież ochronna i jednorazowe rękawice ochronne. Pod
żadnym pozorem nie należy dopuścić do przeniesienia krwi poza probówki, w których
wykonywana jest analiza, nie należy dotykać rękawicami ciała, żywności, telefonów komórkowych,
wcierać krwi w błony śluzowe itp. Podczas nabierania krwi pipetą automatyczną należy bardzo
powoli i w sposób kontrolowany zwalniać tłok, aby nie ‘zassać’ płynu do wnętrza pipety.
Izolacja DNA
Izolacja DNA może być przeprowadzona na bardzo wiele sposobów, a metody stosowane
w laboratoriach prawie zawsze są kompilacją kilku metod. Techniki izolacji DNA polegają
na rozbiciu komórek i oddzieleniu DNA od innych struktur komórkowych, cząsteczek RNA i białek
związanych z DNA.
Wybór odpowiedniej metody izolacji DNA zależy od:
a) pochodzenia materiału, z którego przeprowadzamy izolację;
b) rodzaju materiału (tkanka, organ, hodowla komórkowa);
c) rodzaju izolowanego DNA (DNA genomowe, mitochondrialne, plazmidowe);
d) przeznaczenia wyizolowanego DNA (PCR, klonowanie).
Izolacja całkowitego DNA składa się zasadniczo z kilku następujących po sobie etapów:
1) pobranie próbki materiału biologicznego,
2) homogenizacja pobranego materiału (w przypadku tkanek) i/lub liza błon komórkowych (w celu
uwolnienia DNA),
3) denaturacja białek,
4) oczyszczanie DNA z resztek lizatu,
5) rozpuszczanie DNA,
6) ocena jakościowa i ilościowa uzyskanego izolatu DNA.
Wybór odpowiedniej metody homogenizacji materiału biologicznego zależy od pochodzenia
materiału:
- miękkie tkanki zwierzęce: homogenizacja,
- zawiesiny komórkowe i płyny biologiczne: sonifikacja lub tylko liza chemiczna,
- komórki roślinne, bakteryjne: rozcieranie mechaniczne,
- komórki bakteryjne, drożdże: liza enzymatyczna,
- komórki pochodzące z hodowli komórkowych: liza detergentami;
Metody stosowane do lizy komórek można podzielić na:
a) fizyczne (zamrażanie, rozmrażanie; szok osmotyczny),
b) mechaniczne (rozcieranie perełkami szklanymi, tlenkami glinu),
c) chemiczne (liza detergentami, np. SDS, CTAB [Cetyltrimethylammonium bromide], DTAB
[Dodecyltrimethylammonium bromide], Tryton-X-100).
Katedra Farmakologii PUM ∙ Powstańców Wlkp. 72 70-111 Szczecin ∙ tel. 91 466 1589
Farmakogenetyka – Biotechnologia Medyczna Io
Kolejny etap izolacji to usuwanie frakcji komórkowych poprzez odwirowanie i oddzielenie DNA
od związanych z nim białek za pomocą:
- nasyconego buforu roztworu fenolu;
- chloroform z alkoholem izoamylowym;
- chloroform z oktanolem;
- mieszanina fenolu z chloroformem i alkoholem izoamylowym (25:24:1).
Denaturację białek przeprowadza się przy pomocy detergentów (np. SDS) i soli (np. NaCl)
powodujących denaturację białek i dysocjację kompleksów DNA - białka. Białka można także
usunąć przez trawienie ich proteinazami, zwykle proteinazą K.
Ze względu na obecność DNaz izolację DNA przeprowadza się w obecności czynników
chelatujących (EDTA, CDTA).
Odbiałczone DNA wytrącane jest za pomocą etanolu lub izopropanolu w obecności soli octanu
sodu, potasu, amonu lub NaCl.
Uwaga: Izopropanol (propan-2-ol) powoduje szybsze i bardziej wydajne wytrącanie DNA, jednak
etanol jest znacznie tańszy.
Wyizolowane DNA jest następnie zawieszane w wodzie lub w buforze TE (10 mM Tris:HCl pH
7.8-8.0, 1 mM EDTA). W lekko zasadowym buforze TE DNA jest bardziej stabilne i może być
przechowywane w lodówce, ale bufor może nieznacznie zmieniać środowisko reakcji PCR. Przy
rozpuszczaniu w wodzie destylowanej, przy dłuższym przechowywaniu zaleca się zamrożenie
izolatu w –20°C.
Wyróżnia się kilka różnych metod izolacji DNA, spośród których najpopularniejsze to:
1) izolacja DNA z zastosowaniem ekstrakcji fenolem i chloroformem (metoda organiczna),
2) izolacja DNA z odsalaniem białek,
3) izolacja DNA przez związanie DNA z nośnikiem (złoża krzemionkowe),
4) izolacja DNA metodą separacji magnetycznej.
Etapami wspólnymi dla większości stosowanych metod są:
- wstępne przygotowanie próbki, obejmujące oczyszczenie, rozdrobnienie i zawieszenie materiału
w buforze stabilizującym,
- liza komórek.
1) Izolacja DNA z zastosowaniem ekstrakcji fenolem i chloroformem
Ponieważ DNA jest naładowaną ujemnie makrocząsteczką rozpuszczalną w roztworach
wodnych, nie wykazującą powinowactwa do hydrofobowych rozpuszczalników organicznych,
można je poddać ekstrakcji z użyciem mieszaniny fenolu i chloroformu. Proces ten obejmuje
homogenizację badanego materiału i/lub lizę komórek przy użyciu takich detergentów, jak sól
sodowa siarczanu dodecylu (SDS) czy Triton-X100, których zadaniem jest degradacja błon
komórkowych, a ponadto denaturacja białek. Lizę komórek przeprowadza się w podwyższonej
temperaturze w obecności proteinazy K, enzymu rozkładającego białka. W metodzie
z zastosowaniem fenolu i chloroformu, uzyskany lizat wytrząsa się następnie kilkukrotnie
w obecności tych rozpuszczalników organicznych, które ekstrahują z fazy wodnej (jaką jest
uzyskany lizat) tłuszcze. Obecność fenolu powoduje też, że na granicy fazy organicznej i fazy
wodnej gromadzą się zdenaturowane białka. Na tym etapie w izolowanej przez nas próbce możemy
Katedra Farmakologii PUM ∙ Powstańców Wlkp. 72 70-111 Szczecin ∙ tel. 91 466 1589
Farmakogenetyka – Biotechnologia Medyczna Io
wyróżnić 3 różniące się od siebie warstwy: górną - wodną, zawierającą kwasy nukleinowe;
środkową - zawierającą zdenaturowane białka oraz dolną - organiczną. Taki kilkukrotny proces
ekstrakcji oczyszcza izolowaną próbkę DNA z białek i lipidów. Ostatnim etapem procesu izolacji
jest wytrącenie DNA w obecności jonów sodu przy pomocy izopropanolu lub etanolu. Uzyskany
osad DNA, po uprzednim przemyciu etanolem, rozpuszcza się w wodzie lub buforze TE.
Wadą tej metody izolacji DNA jest konieczność pracy z lotnymi, trującymi, niebezpiecznymi
rozpuszczalnikami organicznymi.
2) Izolacja DNA z odsalaniem białek
Odbiałczenie DNA zachodzi na skutek odsalania białek komórkowych poprzez
zastosowanie zjawiska odwodnienia i wytrącania z użyciem nasyconego roztworu NaCl.
W pierwszej kolejności do pobranego materiału dodaje się bufor ekstrakcyjny, zawierający NaCl,
TRIS/HCl, EDTA, a następnie proteinazę K oraz detergent (SDS). Próbkę inkubuje się w temp.
55°C przez 3 do 12 godzin. Po inkubacji do próbki dodaje się następnie nasycony roztwór NaCl
oraz chloroform. Następne etapy obejmuję wytrącanie DNA, jego suszenie oraz rozpuszczanie
w buforze TE. Zaletą metody izolacji DNA z odsalaniem białek jest jej stosunkowo proste
wykonanie oraz niewygórowany koszt.
3) Izolacja DNA przez związanie DNA z nośnikiem (przez adsorpcję na kolumnach
wypełnionych krzemionką)
W metodzie tej tkanka lub komórki, z których ma zostać uzyskany izolat DNA,
w pierwszej kolejności muszą zostać poddane lizie w podwyższonej temperaturze. Proces ten,
oprócz obecności buforu zawierającego tak jak wcześniej proteinazę K, zawiera również sole
chaotropowe, jak np. tiocyjanian guanidyny (który dodatkowo ułatwia lizę komórek oraz
inaktywuje nukleazy), chlorowodorek guanidyny, jodek sodu, nadchloran sodu. Sole chaotropowe
są związkami rozrywającymi wiązania wodorowe istniejące pomiędzy makrocząsteczkami
a cząsteczkami wody. Usunięcie „płaszcza wodnego” z cząsteczek DNA umożliwia w następnym
etapie jego wiązanie do membrany krzemionkowej. Po zakończeniu trawienia materiału
biologicznego w obecności soli chaotropowych, uzyskany izolat przenosi się na kolumnę, do dna
której przytwierdzona jest membrana krzemionkowa. Dzięki obecności soli chaotropowych i buforu
o dużej sile jonowej dochodzi do selektywnej adsorpcji cząsteczek DNA do materiału membrany
(inne składniki nie ulegają związaniu). Po odwirowaniu kolumny i odrzuceniu przesączu
ze składnikami lizatu komórkowego, poza DNA, zwykle przemywa się dwukrotnie kolumnę
roztworem o niższej sile jonowej zawierającym alkohol. Usuwa się dzięki temu resztki
zanieczyszczeń pochodzących z lizatu komórek, a także wymycie soli chaotropowych. Ostatni etap
postępowania stanowi wymycie oczyszczonego DNA buforem TE (który zawiera TRIS
o właściwościach buforujących, zapewniający lekko zasadowe pH oraz EDTA – chelator jonów)
lub jałową wodą. Uzyskuje się roztwór DNA, którego cząsteczki osiągają długość do 50 kpz.
Zaletą izolacji DNA metodą kolumienkową jest jej prostota, szybkość, wydajność, brak
konieczności stosowania szkodliwych związków chemicznych oraz brak konieczności wytrącania
i ponownego rozpuszczania DNA. Wydajność tej metody może być jednak niższa niż w przypadku
izolacji metodą fenol-chloroform.
Katedra Farmakologii PUM ∙ Powstańców Wlkp. 72 70-111 Szczecin ∙ tel. 91 466 1589
Farmakogenetyka – Biotechnologia Medyczna Io
4) Izolacja DNA metodą separacji magnetycznej
Cząstki magnetyczne o właściwościach adsorpcji DNA wykonane są zazwyczaj na bazie
tetratlenku triżelaza (Fe3O4) wykazującego właściwości magnetyczne, w połączeniu z takimi
materiałami jak polistyren czy krzemionka, które zwiększają adsorpcję DNA do powierzchni
powstałych cząstek. Tak przygotowane cząsteczki magnetyczne o średnicy 0.5-10 µm miesza się
z uzyskanym lizatem komórkowym. Cząsteczki DNA w odpowiednim środowisku specyficznie
adsorbują na powierzchni cząstek – dzięki ich właściwościom magnetycznym łatwo można
wyodrębnić DNA od pozostałych składników roztworu. Przyłożone zewnętrznie pole magnetyczne
powoduje gromadzenie się i unieruchomienie cząstek w miejscu działania pola, dzięki czemu
w łatwy sposób można usunąć całość wprowadzonego lizatu. Cząstki z zaadsorbowanym
na powierzchni DNA można przemyć odpowiednim buforem po usunięciu pola magnetycznego.
Po ponownym przyłożeniu pola bufor przemywający usuwa się nie naruszając ponownie
unieruchomionych przez kontakt z magnesem cząstek. Ostatnim etapem tej izolacji jest dodanie
do cząstek buforu wymywającego, dzięki któremu DNA dostaję się do roztworu (elucja).
Przyłożenie pola magnetycznego umożliwia ostateczne oddzielenie uzyskanego roztworu DNA
od cząstek magnetycznych.
Ta metoda izolacji DNA jest cenna głównie ze względu na swoją szybkość i prostotę. Zastosowanie
cząstek magnetycznych eliminuje konieczność stosowania toksycznych rozpuszczalników
organicznych czy też konieczność wirowania prób. Wydajność izolacji metodą separacji
magnetycznej jest porównywalna z ekstrakcją DNA metodą fenol-chloroform, przy czym izolacja
trwa zaledwie kilkanaście minut, co oznacza istotną oszczędność czasu. Wadę stanowi wyższy
koszt metody.
Pomiar stężenia DNA
Pierwszym etapem pracy z materiałem genetycznym przed jego dalszą analizą technikami
biologii molekularnej jest określenie czystości oraz stężenia uzyskanych preparatów. Obecność
w roztworze DNA takich zanieczyszczeń jak fenol, EDTA, heparyna itp. może istotnie zaburzać
przebieg wielu technik analizy DNA, w szczególności PCR. Kontrolę jakości preparatów DNA
przeprowadza się za pomocą pomiaru spektrofotometrycznego lub za pomocą wizualnej oceny
elektroforezy w żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. Ocena wizualna jest wystarczająca
do niektórych zastosowań (np. PCR/RFLP), jednak pomiar stężenia jest zalecany w przypadku
użycia DNA jako matrycy do sekwencjonowania lub analizy ilościowej z wykorzystaniem aparatów
do PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR). Standaryzacja stężenia pomiędzy próbami
zmniejsza także ryzyko kontaminacji prób o niskim stężeniu przez równoległej analizie prób DNA
o szczególnie wysokim stężeniu.
W tradycyjnych spektrofotometrach preparaty muszą być rozcieńczone najczęściej 100x
wodą lub buforem TE. Do kalibracji spektrofotometru używa się tego samego roztworu, w którym
rozcieńczono preparaty. Spektrofotometry najnowszej generacji wykorzystują technologię retencji
próbki, która stosuje napięcie powierzchniowe do utrzymania próbki w miejscu. To eliminuje
konieczność stosowania kuwet lub innych urządzeń na próbki oraz pozwala na czyszczenie
w czasie kilku sekund. Ponadto, posiadają możliwość pomiarów próbek bez konieczności ich
rozcieńczania (50–krotnie wyższe stężenia niż próbki mierzone za pomocą standardowych
Katedra Farmakologii PUM ∙ Powstańców Wlkp. 72 70-111 Szczecin ∙ tel. 91 466 1589
Farmakogenetyka – Biotechnologia Medyczna Io
spektrofotometrów kuwetowych), w bardzo niewielkich objętościach (1-2µl), co zmniejsza straty
cennego materiału.
Kwasy nukleinowe wykazują maksymalną absorbancję przy długości fali 260 nm, białka
(ze względu na obecność aminokwasów aromatycznych) przy 280 nm, a zanieczyszczenia
organiczne przy długości fali mniejszej od 240 nm. Absorbancja przy 260 nm jest równa 1 (gęstość
optyczna OD=1) dla dwuniciowego DNA o stężeniu 50 µg/ml, dla jednoniciowego DNA o stężeniu
33µg/ml i RNA o stężeniu 40 µg/ml. Różnice w absorbancji są wynikiem złożoności struktury
DNA i RNA i dlatego jednoniciowe kwasy nukleinowe absorbują więcej światła (oligonukleotydy –
tylko 30 µg/ml).
Zbyt niski stosunek wartości absorbancji A260 do A280 świadczy o zanieczyszczeniu preparatów
kwasów nukleinowych białkami, a zbyt wysoki o zanieczyszczeniu detergentami stosowanymi
podczas izolacji. Wartość współczynnika A260/A280 w zakresie 1,8-2 oznacza, że preparaty
są wystarczająco oczyszczone, natomiast wartość równa 1,5 oznacza, że w badanym preparacie
DNA lub RNA jest 50% białka.
Bardzo dobry preparat DNA powinien mieć dużą lepkość, stężenie około 1 mg/ml, czystość
spektrofotometryczną zawartą pomiędzy wartością 1,8 a 2,0.
Do większości analiz DNA opartych na technice PCR (amplifikacji) zaleca się stosowanie stężeń
DNA rzędu 20 ng/µl, przy założeniu, że matrycowy izolat stanowi 10% mieszaniny PCR.
Po uzyskaniu roztworu DNA o zadowalającej jakości, przystąpić można do właściwych analiz
z zastosowaniem technik biologii molekularnej.
Katedra Farmakologii PUM ∙ Powstańców Wlkp. 72 70-111 Szczecin ∙ tel. 91 466 1589
Download
Random flashcards
123

2 Cards oauth2_google_0a87d737-559d-4799-9194-d76e8d2e5390

ALICJA

4 Cards oauth2_google_3d22cb2e-d639-45de-a1f9-1584cfd7eea2

bvbzbx

2 Cards oauth2_google_e1804830-50f6-410f-8885-745c7a100970

Motywacja w zzl

3 Cards ypy

Create flashcards