Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do roślin
advertisement
Rekombinacja in vitro i wprowadzanie zrekombinowanego DNA do komórek Jak otrzymać zrekombinowane DNA-schemat klonownia molekularnego Schemat doświadczenia pozwalającego na rekombinację DNA w wektorze np. plazmidowym: 1. Przygotowanie fragmentu DNA 2. Przygotowanie wektora do klonowania (etapy 1 i 2 zwykle odbywają się równocześnie) 3. Ligacja wektora i wstawki 4. Wprowadzenie zrekombinowanego DNA do odpowiedniego gospodarza np. transformacja bakterii zrekombinowanym DNA 5. Selekcja i analiza transformantów (screening) I. Przygotowanie fragmentu DNA 1. DNA do klonowania najczęściej jest trawione odpowiednim enzymem restrykcyjnym (ale możemy także rekombinować w wektorach fragmenty DNA powielone wcześniej techniką PCR) 2. Elektroforetyczna kontrola jakości, poprawności i wydajności trawienia (lub amplifikacji, jeśli fragment DNA powielamy w PCR), ewentualne oczyszczenie produktu trawienia przez izolację fragmentu DNA z żelu agarozowego OPCJONALNIE: a) Dodanie nowego miejsca restrykcyjnego po trawieniu enzymem generującym tępe końce - poprzez ligację linkerów DNA np. wyposażonych w miejsce restrykcyjne b) Zamiana lepkiego 5’ końca na koniec tępy (np. egzonukleazą, polimerazą Klenowa) c) Zamiana lepkiego 3’ końca na koniec tępy d) dodanie ogonków homopolimerowych np. w klonowaniu cDNA Opcjonalne manipulacje na fragmencie DNA do klonowania a) zamiana końca tępego na lepki poprzez dodanie linkerów wyposażonych w miejsca restrykcyjne b) dodawanie ogonków homopolimerowych w klonowaniu cDNA W niektórych eksperymentach (dotyczy to np. rekombinowania w wektorach eukariotycznego cDNA) nie można użyć do klonowania enzymów restrykcyjnych. Wyposaża się je wtedy w sztuczne lepkie końce (co może również dotyczyć wektorów). Technika ta polega na wyposażeniu końców 3’ DNA w łańcuchy identycznych nukleotydów (ang. Homopolymer tailing). Syntezę homopolimerowych jednoniciowych zakończeń DNA dokonuje terminalna transferaza nukleotydowa. Zaletą tej techniki jest to że na zasadzie komplementarności mogą się ze sobą skleić jedynie fragmenty obcego DNA i DNA wektora, a nie ma możliwości autoligacji wektora. W wyniku ligacji cząsteczek wyposażonych w sztuczne lepkie końce powstają więc jedynie cząsteczki zrekombinowanego DNA II. Przygotowanie wektora np. plazmidowego 1. Wektor do klonowania musi być zlinearyzowany odpowiednim enzymem (enzymami) restrykcyjnym (najczęściej takim samym jak klonowany fragment*) * BamHI BglII 5'-G^G A T C C-3 3'-C C T A G^G-5' 5'-A^G A T C T-3‘ 3'-T C T A G^A-5' 2. Elektroforetyczna kontrola jakości, poprawności i wydajności trawienia – szczególnie istotna w przypadku wektora!!! a) Opcjonalnie defosforylacja 5’ końców wektora, która zapobiega autoligacji DNA wektora!!! (tylko przy trawieniu pojedynczym enzymem) III. Ligacja wektora i wstawki – właściwa rekombinacja in vitro W rekombinacji in vitro wykrzystuje się ligazę DNA uzyskiwaną z komórek E. coli zakażonych fagiem T4 (ligaza ta wymaga ATP i skleja poza lepkimi także tępe końce DNA) Optymalna temp. działania ligazy T4 od 4 (dla końców lepkich), 15-25 (dla końców tępych) W mieszaninie ligacyjnej wstawka (insert, rekombinowany fragment DNA) powinna stanowić molowy nadmiar względem ilości cząsteczek wektora •Przy małym stężeniu DNA wstawki najbardziej prawdopodobne jest połączenie końców tej samej cząsteczki DNA (recyrkularyzacja). •Wzrost stężenia DNA w reakcji ligacji zwiększa prawdopodobieństwo połączenia dwóch różnych cząsteczek DNA •Dla większości aplikacji można przyjąć stosunek molarny wstawka : wektor - 3:1 •W reakcji ligacji prawie nigdy nie powstaje 100% zrekombinowanego DNA, dlatego wektory wyposaża się w systemy wizualnej selekcji zrekombinowanych klonów, poddaj się je defosforylacji itp. IV. Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do bakterii 1. Transformacja Zjawisko transformacji – czyli pobierania nagiego DNA z podłoża do komórek wykazano po raz pierwszy w bakteriach G+ Streptococcus pneumoniae (a potem także w Pneumonococcus czy Diplococcus) - Fred Griffiths 1928. •Zdolność transformacji bakterii zależy od tzw. stanu kompetencji •Stan naturalnej kompetencji uwarunkowany jest genetycznie. •W takiej transformacji najlepiej pobierany jest liniowy natywny ds DNA. Jedna nić ulega degradacji, druga rekombinacji do genomu gospodarza. •Naturalną zdolność wchodzenia w stan kompetencji wykazują głównie bakterie Gramdodatnie (Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus). •Bakterie Gram-ujemne zwłaszcza te z rodziny Enterobacteriaceae (m.in. E. coli) podlegają tego typu transformacji ze znacznie mniejsza wydajnością. Sztuczna kompetencja – •transformacja E. coli plazmidowym DNA z użyciem metody chemicznej •podstawowy sposób wprowadzania zrekombinowanego DNA do bakterii Procedura transformacji E. coli plazmidowym DNA metodą chemiczną: 1. Przygotowanie hodowli biorcy we wczesnej fazie logarytmicznej (OD600 0.3-0.4) 2. Otrzymanie komórek kompetentnych przez traktowanie bakterii zimnym (0 st. C) roztworem 50 lub 100mM chlorku wapnia (w niektórych modyfikacjach stosuje się dodatek innych jonów np. Mg lub Rb). Roztwory chlorków sprawiają ze osłona komórkowa staje się przepuszczalna np. dla plazmidu 3. Zmieszanie komórek kompetentnych z preparatem DNA (plazmid adsorbuje się na powierzchni komórki) i poddanie krótkotrwałemu działaniu szoku cieplnego. Szybkie podwyższanie temperatury (do 42 st. C na ok. 3 min.) powoduje zmiany w powłokach komórkowych bakterii (podwyższona temperatura wpływa na stan fizyczny lipidów w błonie powodując powiększenie porów) pozwalające na wniknięcie cząsteczek DNA do wnętrza komórek 4. Pozostawienie komórek w podłożu nieselekcyjnym na okres umożliwiający powrót komórek do normalnego stanu fizjologicznego i wyrażenie się genów zawartych na wprowadzanym plazmidzie lub wektorze fagowym (co najmniej 1 godz. W pożywce bez antybiotyku z napowietrzaniem)- bardzo ważne!!! 5. Wysiew komórek na podłoża selekcyjne lub w przypadku transformacji z wykorzystaniem wektora fagowego (np. M13) na płytki bez selekcji z agarem miękkim – „top agarem” Od czego zależy wydajność transformacji bakterii metodą chemiczną? 1. Szczep biorcy powinien być bezplazmidowy (wrażliwy na antybiotyki), mieć nieaktywny system restrykcyjny (Res-) zapobiega degradacji obcego DNA oraz system rekombinacji (RecA-) co zapewnia stabilność wprowadzanych plazmidów w komórce (ważne np. przy klonowaniu genów chromosomalnych. Takie cechy mają np. szczepy E. coli DH5 i XL1-Blue rekomendowane jako biorcy w transformacji 2. DNA plazmidowy powinien być oczyszczony – nadmiar soli, enzymów restrykcyjnych, resztek fenolu, obniża lub hamuje wydajność transformacji 3. Najbardziej efektywną formą transformacji jest forma ccc DNA plazmidu, transformacja formą liniową jest mało wydajna i stosowana tylko w szczególnych wypadkach 4. Wydajność transformacji zależy od wielkości cząsteczki plazmidu, duże cząsteczki transformują się trudniej 5. Nadmiar DNA nie wpływa na wzrost wydajności, optymalna ilość dla E. coli powinna wynosić od 20-200 ng na reakcję 6. Komórki kompetentne są bardzo wrażliwe i należy się z nimi obchodzić bardzo delikatnie, zwłaszcza podczas wirowania, mieszania z DNA. Wszystkie etapy preparatyki należy przeprowadzać w lodzie. Wydajność podaje się jako liczbę transformantów w przeliczeniu na 1 mikrogram DNA. Dla E. coli wydajność ta w metodzie wapniowej (z chlorkiem wapnia) waha się od 104 do 106 (max. 107 na 1 g plazmidowego DNA). 2. Elektrotransformacja (elektroporacja ) Istotą metody jest przepuszczenie przez zawiesinę komórek krótkiego (5-10 msek) impulsu prądu o bardzo wysokim napięciu (12502500 V). Prowadzi do powstawania porów (wielkości do 2 nm) w błonie (impuls elektryczny przejściowo i odwracalnie przerywa ciągłość błony), przez które do komórek może wnikać DNA. Po raz pierwszy zastosowana przez Dovera i wsp. 1988 roku dla bakterii, zyskała wielką popularność, ponieważ pozwala transformować gatunki, które trudno uzyskują kompetencję metodami chemicznymi. Zalety elektroporacji w porównaniu z metodą chemiczną : •można uzyskać bardzo wysoką wydajność transformacji (109-1010 transformantów na g DNA, to co najmniej dwa rzędy wielkości więcej niż w metodzie chemicznej), •można wprowadzać bardzo duże cząsteczki DNA (np. plazmidy z insertami wielkości setek kpz) np. zrekombinowane wektory do konstrukcji bibliotek genowych z dużymi wstawkami. Pewną wadą jest to że łatwo można zniszczyć (zabić) komórki bakteryjne w zawiesinie V. Selekcja transformantów na odpowiednich podłożach selekcyjnych Analiza transformantów: • Namnożenie bakterii niosących zrekombinowane DNA w płynnym podłożu selekcyjnym • Izolacja plazmidowego DNA • Trawienie plazmidowego DNA – analiza obecności wstawki Metody wprowadzania DNA (np. zrekombinowanego) do innych (niż bakterie) typów komórek Zwykle nie służy to klonowaniu molekularnemu!!! Problem z nomenklaturą!!! Jeżeli wprowadzamy zrekombinowane DNA do: 1. Bakterii i drożdży to mówimy o transformacji 2. Komórek roślin – także mówimy o transformacji genetycznej roślin choć to zupełnie inny proces niż w przypadku bakterii 3. Komórek zwierzęcych lub ludzkich mówimy o transfekcji (ponieważ używamy wtedy głownie wektorów pochodzenia wirusowego). W tym wypadku pojęcie transformacji dotyczy transformacji nowotworowej tych komórek Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do drożdży: • Transformacja metodami chemicznymi komórek drożdży odbywa się na zasadach podobnych jak w przypadku transformacji komórek bakteryjnych • zrekombinowane DNA możemy też wprowadzać do drożdży przez elektrotransformację • z wykorzystywaniem odpowiednich wektorów np. typu YAC Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do roślin •Wykorzystuje się bakterie z rodzaju Rhizobium: Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes, które posiadają naturalną zdolność do wprowadzania swojego DNA do roślin. •Posiadają w swojej komórce plazmid, kodujące geny niezbędne do infekcji rośliny. Jeden z fragmentów tego plazmidu, nazwany odcinkiem T (T-DNA), integruje się z materiałem genetycznym komórki gospodarza. •Dzięki usunięciu części sekwencji wewnątrz plazmidu T, w to miejsce można stawić dowolny fragment obcego DNA •Metoda ta ma poważne ograniczenie - można ja stosować wyłącznie do roślin dwuliściennych, ponieważ tylko one ulegają infekcji przez Agrobacterium Transformacja genetyczna roślin dwuliściennych 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) Wybór odcinka DNA mającego stanowić „transgen” w roślinie i wstawienie go w odpowiednie miejsce wektora będącego pochodną plazmidu T - rekombinacja w E. coli (transformacja I) Wprowadzeniu zrekombinowanego wektora do Agrobacterium (transformacja II), Inkubacja bakterii niosących wektor z fragmentem tkanki roślinnej (kokultywacja) – umieszczenie eksplantatów w roztworze bakterii Przeniesienie fragmentów tkanki na pożywkę selekcyjnoregeneracyjną z odpowiednim antybiotykiem (czynnik eliminujący Agrobacterium i czynnik selekcyjny transformantów) Indukcja podziałów komórkowych i powstanie bezkształtnej masy dzielących się komórek zwanej kalusem, Regeneracja roślin z komórek kalusa za pomocą pożywek zawierających hormony roślinne, Ukorzenianie rośliny w odpowiedniej pożywce, Przeniesienie roślin do ziemi, hartowanie; analizy molekularne, fizjologiczno-biochemiczne Sposoby transformacji genetycznej czyli wprowadzania np. zrekombinowanego DNA do roślin jednoliściennych (zboża, trawy i cebulowate) -Mikrowstrzeliwanie – biobalistyka (nie wymaga tworzenia protoplastów z komórek roślinnych) Inne metody są stosowane raczej rzadko – w większości wymagają uzyskania protoplastów Metody wprowadzania zrekombinowanego DNA do komórek zwierzęcych i ludzkich: • Dominują metody biologiczne, które są najbardziej skuteczne transfekcja z użyciem zrekombinowanych wektorów wirusowych tj. inkubacja linii odpowiednich komórek z zawiesiną zrekombinowanego wirusa w odpowiednich warunkach (pożywka, temp. itd.) Inne metody (rzadziej stosowane) • Lipofekcja (najczęściej wprowadzane jest DNA bezwektorowe • Mikroiniekcja dojądrowa - DNA bezwektorowe Wykorzystanie liposomów i lipopleksów – lipofekcja Liposomy to drobne syntetyczne pęcherzyki lipidowe. Powstają one spontanicznie, jeżeli pewne typy lipidów zawiesi się w roztworze wodnym. Ich błonę stanowi podwójna warstwa lipidowa, tak więc budową przypominają np. błonę komórki. Liposomy wiążą i kondensują DNA spontanicznie, tworząc komleksy o wysokim powinowactwie do błon komórkowych. Zwykle mają dość niewielką pojemność wewnętrzna średnica liposomu (0,025-0,1 mikrometrów) jest zazwyczaj znacznie mniejsza niż długość plazmidowego DNA, który może mierzyć nawet do 2 mikrometrów. Oznacza to że tylko nieliczne ciasno zwinięte cząsteczki DNA mogą być otaczane w liposomach Problemem jest także ukierunkowane lipososmów do konkretnych tkanek Lipofekcja c.d. •Liposomy powinny być także wyposażone w peptydy, zdolne niszczyć błony endosomalne i zapobiegać lizosomalnej degradacji DNA, a także w rekombinazy, wspomagające rekombinację między wprowadzonym DNA a DNA komórki, oraz białka i RNA, które mogą służyć ekspresji wprowadzonego DNA. Ciągle próbuje się ulepszać tego typu niewirusowe nośniki pozwalające wprowadzać DNA do komórek zwierzęcych i ludzkich Dość obiecujące są rożnego rodzaju lipidy kationowe i polimery kationowe tzw. lipopleksy. Na ich korzyść przemawia •brak ryzyka rekombinacji genetycznych i mutacji typu insercji występujących w przypadku stosowania nośników wirusowych •stosunkowo duża pojemność (większa niż liposomów) dla terapeutycznego DNA •możliwość wielokrotnych iniekcji (lipidy oraz polimery kationowe nie są bowiem immunogenne) co umożliwia ich bezpieczniejsze stosowanie także in vivo (czyli w tym przypadku np. u pacjenta) Mikroiniekcja dojądrowa (głównie komórki zwierzęce np. w transgenezie zwierząt rzadziej kom. ludzkie) •Polega na wstrzykiwaniu DNA bezpośrednio do jąder komórek za pomocą szklanych mikroigieł, kontrolowanych przez sterowane hydraulicznie mikromanipulatory, przy równoczesnej obserwacji pod mikroskopem o wysokiej rozdzielczości. •Metoda ta jest bardzo wydajna •Doświadczenie wykonywanie jest przez ręcznie człowieka. Metoda praco- i czasochłonna. Obszary współczesnej biotechnologii, na które inżynieria genetyczna ma największy wpływ: zielona biotechnologia obejmująca rolnictwo i szeroko pojęty przemysł rolno-przetwórczy czerwona biotechnologia — związana z różnymi aspektami ochrona zdrowia ludzi i zwierząt (włącznie z diagnostyką, farmacją, jak również weterynarią) Podstawą współczesnej zielonej biotechnologii jest transgeneza – przeniesienie na stałe do jakiegoś organizmu jednego lub więcej genów pochodzących z innej komórki lub innego organizmu – GMO Podstawą transgenezy jest rekombinacja in vitro - łączenie dowolnych cząsteczek DNA Transgeniczne rośliny bardziej odporne na choroby i czynniki środowiska Transgeniczne rośliny - poprawione cechy jakościowe: pszenica – więcej glutelin = lepsza wartość wypiekowa mąki ananas – białko utrudniające zamarzanie = mniejsze straty przy przechowywaniu w chłodniach pomidor – więcej karotenu = lepsze wybarwianie owoców ryż – zwiększenie zawartości prowitaminy A kawa – usunięcie enzymów zaangażowanych w syntezę kofeiny Rośliny GM jako „bioreaktory” - agrofarmaceutyka (agropharming) wykorzystanie roślin transgenicznych jako bioreaktorów do produkcji białek, które mogą być wykorzystane w terapii lub diagnostyce medycznej somatotropina ziemniak – bulwa kolagen tytoń – liście podj. hemoglobiny tytoń – nasiona interleukina-2 ziemniak – bulwy interferon alfa ziemniak Transgeniczne zwierzęta - poprawione cechy użytkowe •Szybszy wzrost zwierząt hodowlanych •Większa wydajność produkcji np. mleka albo mięsa - (mleko specjalnie przystosowane do produkcji serów) •Transgeniczne zwierzęta w medycynie i badaniach biomedycznych – badania podstawowe - transgeniczne myszy są niezastąpionym modelem w badaniu chorób człowieka, np. nowotworów, otyłości, starzenia, chorób układu krążenia, cukrzycy itp. •Genetycznie modyfikowane zwierzęta np. świnie jako dawcy narządów albo ksenogenicznych komórek i tkanek do przeszczepów Czerwona biotechnologia - ochrona zdrowia ludzi i zwierząt Produkcja rekombinowanych białek (leków, hormonów, białek wykorzystywanych w biologii molekularnej) w mikroorganizmach i komórkach eukariotycznych Transformation Rekombinowane biofarmaceutyki: • Do chwili obecnej na świecie do użytku dopuszczonych jest ok 650 leków białkowych, z czego 400 to leki oparte na białkach rekombinowanych • Kolejne 1300 rekombinowanych biofarmaceutyków jest w fazach testów, z wyraźną tendencją wzrostu udziału w ich produkcji komórek eukariotycznych, choć niektóre typy tych leków np. przecinowotworowe, są w dużej mierze produkowane w bakteriach Lista rekombinowanych biofarmaceutyków przeciwnowotworowych dopuszczonych do stasowania w jednym miesiącu 2015 Jakiego typu schorzenia próbujemy leczyć za pomocą rekombinowanych biofarmaceutyków Zysk ze sprzedaży rekombinowanych biofarmaceutyków przeciwnowotworowych przewyższa zyski ze sprzedaży leków chemicznych Terapia genowa - leczenie chorób genetycznych np. przez wprowadzenie terapetucznego DNA albo wprowadzenie tzw. genu samobójczego – zniszczenie chorych komórek np. nowotworowych wektor AAV wektor retrowirusowy • • • Unia Europejska dopuściła na swój rynek pierwszą terapię genową • Stężenie tłuszczów we krwi chorych poddawanych terapii ulega wyraźnemu zmniejszeniu, znacząco zmniejsza się ryzyko wystąpienia zapalenia trzuski, które stanowi główne powikłanie w tej chorobie • Glybera jest obecnie jednym z najdroższych leków świata. Koszt terapii jednego pacjenta wynosi ponad 1,2 mln euro Glybera jest przeznaczona dla osób cierpiących na rzadką (jedna-dwie osoby na milion) chorobę związaną z niemożnością właściwego trawienia tłuszczów (wrodzony niedobór lipazy lipoproteinowej (LPLD – lipoprotein lipase deficiency) Technologia oparta na wiedzy o DNA umożliwia ponadto •rozwój precyzyjnej, szybkiej i taniej diagnostyki • projektowanie osobistych leków “custom drugs” (spersonalizowana medycyna)
