Znaczenie humoralnej odporności matczynej

Znaczenie humoralnej odporności matczynej
przeciwko hemaglutyninie typu 1 wirusa grypy świń
prof. dr hab. Iwona Markowska-Daniel, dr n. wet. Małgorzata Pomorska-Mól
Zakład Chorób Świń Państwowego Instytutu Weterynaryjnego-Państwowego Instytutu
Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Puławy
Streszczenie
Oceniono czas utrzymywania się odporności matczynej przeciwko hemaglutyninie
typu 1 (H1) u prosiąt. Do doświadczenia wykorzystano pięć seropozytywnych loch, u których
testem zahamowania hemaglutynacji (HI) stwierdzono miano przeciwciał przeciwko
hemaglutyninie typu 1 (anty H1) na poziomie ≥ 640, oraz i ich potomstwo (po 8 prosiąt z
każdego miotu). Krew od loch pobierano na 10 dni przed porodem, a od prosiąt w wieku 7,
21, 28 dni oraz 6, 8, 10, 12, 14 oraz 16 tygodni. Do oznaczania poziomu swoistych
przeciwciał w surowicy zastosowano test HI oraz komercyjny test ELISA. Za wynik dodatni
uznawano miano HI i wartość indeksu IRPC (określonego testem ELISA) > 20. Miano HI
wynosiło średnio 1280 ± 783, a wartości indeksu IRPC 87,06 ±17,41. Miano matczynych
przeciwciał hemaglutynacyjnych u 7 dniowych prosiąt wynosiło ≥ 2560 i utrzymywało się na
tym poziomie do 3 tygodnia życia. Następnie,
w przeciągu kolejnych 5 tygodni,
obserwowano gwałtowny spadek miana HI do średniej wartości 420. Począwszy od 8
tygodnia życia spadek poziomu MDA był łagodniejszy. Krzywa obrazująca spadek IRPC
miała nieco odmienny przebieg. W pierwszych 3 tygodniach życia wartości IRPC spadły
gwałtownie, by następnie do 6 tygodnia pozostać na mniej więcej stałym poziomie. MDA
utrzymywały się w surowicy prosiąt na poziomie uznawanym za dodatni do 13-14 tygodnia.
Czas, w którym poziomy MDA spadły poniżej wartości dodatnich, wyznaczony na podstawie
wyników testów HI i ELISA, był bardzo zbliżony - wykazano silną korelację pomiędzy
średnimi wynikami uzyskanymi w obu testach (r = 0,83; p = 0,01). Biorąc pod uwagę fakt,
że MDA mogą interferować z antygenem szczepionkowym, moment szczepień prosiąt
przeciw SIV powinien być wyznaczany na podstawie oceny profilu serologicznego. Takie
postępowanie pozwoli na najbardziej efektywne zastosowanie szczepionek.
Słowa kluczowe: grypa świń, odporność matczyna, hemaglutynina typu 1
1
Significance of maternal humoral immunity against hemaglutinin type 1 of swine
influenza virus
prof. dr hab. Iwona Markowska-Daniel, dr n. wet. Małgorzata Pomorska-Mól
National Veterinary Research Institute, Department of Swine Diseases,
The duration of maternal humoral immunity in piglets against hemaglutinin type 1
(H1) of swine influenza virus was evaluated. Five seropositive sows, with the mean value of
hemagglutination-inhibiting antibody titre reaching at least 640 and their litters (8 piglets
from each litter), were used. The blood from sows was taken 10 days before parturition, and
from piglets at 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12 and 16 week of life. For the determination of H1 specific
antibodies, HI and commercial ELISA test were used. The HI titre and value of IRPC index
above 20, were considered positive. The average HI titre in sows serum was 1280 ± 783,
while IPRC value 87,06 ±17,41. The titre of maternal HI antibodies in all 7 days old piglets
was at least 2560, and remained on this level during the first 3 weeks of life. During next five
weeks a drop in the mean HI antibody levels to 420 was observed. Starting from 8 week of
life the reduction of maternal antibodies (MDA) was less rapid. The curve, which visualized
the mean IRPC values, had a bit different course. During the first 3 weeks of life the values
of the mean IRPC index dropped dramatically. From 3 to 6 week of life the values of IRPC
were relatively stable. The MDA in the serum of piglets were above level considered to be
positive until about 13-14 weeks of age. The moments when the levels of MDA in serum of
piglets fallen down under the value considered positive was similar, with respect to both test
used in the study and the strong positive correlation was found between mean values
determined by both methods (r = 0.83; p = 0.01). Take into account, that the MDA may
interfere with the vaccine antigen, the moment of the vaccination of piglets against swine
influenza, should be based on the results of serological profile of the herd. It will guarantee
the most effective usage of the vaccines.
Keywords: swine influenza, maternal immunity, hemaglutinin type 1
2
Znaczenie humoralnej odporności matczynej
przeciwko hemaglutyninie typu 1 wirusa grypy świń*1
prof. dr hab. Iwona Markowska-Daniel, dr n. wet. Małgorzata Pomorska-Mól
Zakład Chorób Świń Państwowego Instytutu Weterynaryjnego-Państwowego Instytutu
Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Puławy
Grypę świń wywołuje pneumotropowy wirus należący do rodziny Orthomyxoviridae,
rodzaju Influenzavirus. Wirus posiada otoczkę złożoną od wewnątrz z białka matrycowego
(M1), które jest głównym białkiem strukturalnym, od zewnątrz zaś z warstwy lipidowej oraz
wypustek białkowych: hemaglutyniny (H) i neuraminidazy (N). Hemaglutynina posiada
właściwości fuzyjne, dzięki którym wirus może połączyć się z odpowiednimi receptorami
komórkowymi, co umożliwia jego wnikanie do komórek gospodarza. Przeciwciała przeciwko
hemaglutyninie (antyH) uniemożliwiają wirusowi połączenie się z receptorem i tym samym
blokują zakażenie komórki. Hemaglutynina jest immunogenem indukującym powstawania
podtypowo-swoistej odporności humoralnej.
Neuraminidaza bierze udział w pierwszej fazie zakażenia rozkładając kwas
neuraminowy znajdujący się w receptorach komórkowych swoistych dla wirusa grypy.
Enzym ten spełnia także istotną rolę przy uwalnianiu wirusów potomnych z zakażonych
komórek. Przeciwciała przeciwko neuraminidazie ograniczają rozsiewanie wirusa w
organizmie zakażonego osobnika.
Wyodrębniono trzy typy wirusa grypy: A, B i C. Wśród typu A wirusa grypy można
wyróżnić wiele podtypów w zależności od budowy hemaglutyniny, której dotychczas
scharakteryzowano 16 form oraz neuraminidazy, występującej w 9 wariantach. W populacji
trzody chlewnej krąży kilka podtypów wirusów grypy świń oraz ich reasortantów. Najczęściej
* Praca finansowana ze środków na naukę w latach 2008-2011 jako projekt badawczy nr NN 308 275934
3
izoluje się trzy główne podtypy wirusa grypy: H1N1, H1N2, H3N2. Warto podkreślić, że
badaniami filogenetycznymi wykazano, że szczepy izolowane od świń w Europie i Azji
różnią się genetycznie od szczepów izolowanych w Ameryce Płn.
Po zakażeniu wirusem grypy, w wyniku indukcji mechanizmów swoistej odpowiedzi
humoralnej, powstaje szereg przeciwciał, w tym: antyH, przeciw neuraminidazie (antyN),
przeciw białku matrycowemu (antyM) oraz przeciwko nukleoproteinie wirusa (antyNP).
Jednak jedynie przeciwciała antyH, mogą zablokować łączenie się wirusa z komórkami
gospodarza i przez to zahamować rozwój infekcji. Pozostałe przeciwciała nie mogą zapobiec
zakażeniu, modulują one jednak przebieg infekcji poprzez wpływ na aktywność bójczą
komórek układu odpornościowego głównie poprzez wzmaganie cytotoksyczności zależnej od
przeciwciał. Jak wykazano w badaniach przeprowadzonych na myszach, cytotoksyczne
limfocyty T są swoiste głównie w odniesieniu do białek NP i M wirusa grypy, a w mniejszym
stopniu wobec H i N. Cytotoksyczne limfocyty T, pomimo iż nie są zdolne do zablokowania
łączenia się wirusa z receptorami, a więc tym samym nie mogą zapobiec infekcji, odgrywają
istotną rolę w procesie eliminacji wirusa z tkanki płucnej.
Odpowiedź immunologiczna organizmu na zakażenie jest szybka i prowadzi
najczęściej do efektywnej eliminacji wirusa z układu oddechowego. Swoiste przeciwciała
antyH1 w surowicy można wykryć testem zahamowania hemaglutynacji w 7 dniu po
zakażeniu. Wykorzystując wysoce oczyszczony antygen izotopowo-swoisty, metodą
immunoenzymatyczną (ELISA) stwierdzono wzrost miana przeciwciał klasy IgM oraz IgG w
surowicy już po 3 dniu od zakażenia, natomiast wzrost poziomu przeciwciał klasy IgA w
wymazach z nosa po 4 dniach. Obecność swoistej odpowiedzi komórkowej potwierdzono po
7 dniach od zakażenia.
Po przechorowaniu grypy, przeciwciała utrzymują się na wysokim poziomie przez
mniej więcej 8-10 tygodni, po czym ich poziom zaczyna spadać.
4
Wydaję się, że przeciwciała poszczepienne utrzymują się krócej, niż powstające po
przechorowaniu.
W surowicy początkowo dominują przeciwciała klasy IgM, później IgG, natomiast w
popłuczynach z nosa stwierdzono obecność immunoglobulin klasy IgA. Larsen i wsp. (2000),
badając odpowiedź immunologiczną w przebiegu zakażenia wirusem grypy, wykazali
obecność komórek produkujących przeciwciała klasy IgA oraz IgG w błonie śluzowej nosa,
czym dowiedli, że w tkankach układu oddechowego trzody chlewnej dochodzi do miejscowej
produkcji przeciwciał. W popłuczynie z drzewa oskrzelowego także potwierdzono obecność
swoistych przeciwciał głównie klasy IgG, które pochodzą prawdopodobnie z surowicy,
wykazano w niej także obecność niewielkich ilości przeciwciał klasy IgA. Nie można więc
wykluczyć także lokalnej produkcji przeciwciał w obrębie miąższu płuc.
Eksperymentalnie wykazano, że świnie poddane powtórnemu zakażeniu tym samym
podtypem wirusa grypy w przeciągu 6-9 tygodni od infekcji pierwotnej były kompletnie
zabezpieczone przed replikacją wirusa w obrębie płuc oraz błon śluzowych nosa. Nie jest
jednak znany okres utrzymywania się tego typu zabezpieczenia. Za ochronę przed replikacją
wirusa grypy w obrębie tkanek osobnika zakażonego w największym stopniu wydają się być
odpowiedzialne przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyninie.
Wykazano niewielkiego stopnia protekcję krzyżową (redukcja siewstwa, łagodniejszy
przebieg kliniczny) pomiędzy wirusami H1N1, H1N2 i H3N2, krążącymi w Europie. Jest to
najprawdopodobniej powodowane dużą homologią białek NP i M u wszystkich
wymienionych podtypów, pomimo znacznych różnic w budowie hemaglutynin i
neuraminidaz. Ochrona poszczepienna wydaję się być jeszcze bardziej uzależniona od
podobieństw pomiędzy szczepem terenowym odpowiedzialnym za infekcję, a szczepem
zawartym w biopreparacie. Ponadto, szczepienia w małym stopniu, lub wcale, nie
zabezpieczają przed siewstwem wirusa, co najprawdopodobniej jest związane z brakiem
5
poszczepiennych przeciwciał klasy IgA. Podobna sytuacja może mieć miejsce u prosiąt
pochodzących od szczepionych loch, które pomimo posiadania wysokich mian przeciwciał
matczynych (MDA) w surowicy, nie będą zabezpieczone przed siewstwem.
Obecnie szczepionki przeciwko grypie są używane na świecie głównie do szczepienia
loch. U loch cyklicznie otrzymujących szczepionkę przeciwko grypie w okresie
przedporodowym, miana HI w surowicy wahają się najczęściej od 160 do 1280 lub wyższych.
Tak wysokie miana przeciwciał w surowicy loch prawdopodobnie zapewniają długotrwałą
bierną odporność u potomstwa. W badaniach przeprowadzonych przez Thacker (2000) u
prosiąt pochodzących od loch nieszczepionych, jednak posiadających niskie miana
przeciwciał antyH w surowicy, miana HI powyżej 40 utrzymywały się do 6 tygodnia życia.
Natomiast u prosiąt pochodzących od loch szczepionych w okresie ciąży, wysokie miana HI
w surowicy utrzymywały się aż do 16 tygodnia życia (czyli w wielu przypadkach przez
zdecydowaną większość okresu tuczu). Długość utrzymywania się MDA przeciwko wirusowi
grypy, podawana przez różnych autorów, waha się do 4 do 16 tygodni.
Nie należy zapominać, że MDA obecne w surowicy prosiąt mogą interferować z
antygenem
szczepionkowym,
a
tym
samym
ograniczać
odpowiedź
i
odporność
poszczepienną. Biorąc pod uwagę wyniki dotychczasowych doświadczeń wydaje się, że w
sytuacji, w której przeciwko grypie immunizuje się lochy, skuteczne szczepienie warchlaków
może być problematyczne, w związku z długim czasem utrzymywania się MDA w ich
surowicy.
Jak wykazano prosięta z bierną odpornością nie są chronione przed siewstwem wirusa
grypy. Jest to zrozumiałe, gdyż odporność bierna obejmuje głównie przeciwciała klasy IgG,
które przechodzą do krążenia ogólnego. W wyniku biernej immunizacji nie dochodzi
natomiast do przekazania przeciwciał klasy IgA, które hamują replikację wirusa w obrębie
błony śluzowej nosa. U części zwierząt z odpornością bierną stwierdzono kompletną
6
protekcję przed replikacją wirusa w obrębie płuc, co niewątpliwie wiąże się z obecnością w
tym obszarze swoistych przeciwciał klasy IgG pochodzących z surowicy. Należy mieć jednak
na uwadze, że zwierzęta z wysokim poziomem MDA nie rozwijają czynnej odpowiedzi
pozakaźnej po kontakcie z homologicznym typem wirusa, i pozostają tym samym w pełni
wrażliwe na zakażenie tym samym typem wirusa w przyszłości. Osłabioną lub opóźnioną w
czasie odpowiedź pozakaźną obserwowano u prosiąt z niższym poziomem MDA. Ponadto,
jak wykazano, odporność bierna nie zabezpiecza przed zakażeniem odmiennym podtypem
wirusa.
Jak powszechnie wiadomo, długość utrzymywania się u potomstwa odporności
matczynej (laktogennej) jest trudna do ścisłego określenia. Waha się ona bowiem w
zależności od szeregu czynników, głównie od stężenia immunoglobulin w siarze oraz ilości i
czasu pobrania siary przez oseska w okresie wchłanialności przeciwciał przez błonę śluzową
przewodu pokarmowego. Dla większości chorób świń MDA utrzymują się przez okres 4-8
tygodni. W przypadku choroby Aujeszkyego odporność bierna może utrzymywać się do 1011 tygodnia życia, w przypadku zakażeń parwowirusowych nawet do 6 m-cy.
W przypadku grypy, dane z piśmiennictwa wskazują na dosyć szeroki zakres czasowy
utrzymywania się MDA w organizmach prosiąt. Precyzyjne określenie tego okresu jest istotne
z punktu widzenia oceny statusu immunologicznego stada. Ponadto, jest to także istotne dla
lekarza praktyka planującego szczepienie stada, gdyż powinien on koniecznie wziąć pod
uwagę obecność przeciwciał matczynych, które w przypadku zbyt wczesnej immunizacji
prosiąt mogą zmniejszyć lub całkowicie uniemożliwić odpowiedź prosięcia na antygen
szczepionkowy. Ponadto, jak wykazali Kitikoon i wsp. (2006), u prosiąt posiadających MDA
w momencie szczepienia, a następnie poddanych eksperymentalnemu zakażeniu szczepem
heterologicznym, paradoksalnie obserwowano wydłużony okres choroby, wyższą gorączkę i
7
większą częstotliwość pojawiania się zapalenia płuc. Wydaje się, że MDA mogą interferować
z odpornością komórkową i zmieniać kierunek odpowiedzi z Th1 na Th2.
Biorąc powyższe pod uwagę, celem badań było określenie czasu utrzymywania się
przeciwciał matczynych przeciwko hemaglutyninie typu 1 wirusa grypy świń u prosiąt
pochodzących od loch z wysokimi mianami HI (≥ 640) w okresie tuż przed porodem. Do
określenia poziomu humoralnej odporności biernej użyto dwóch metod serologicznych: testu
zahamowania hemaglutynacji oraz ELISA.
Materiał i metody
Zwierzęta. Badania własne przeprowadzono w fermie trzody chlewnej zlokalizowanej w
województwie lubelskim. Ferma stosuje zamknięty cykl produkcyjny. Stado podstawowe
liczy 60 loch linii hybrydowej. W porodówkach i na warchlakarni, przestrzegana jest zasada
całe pomieszczenie pełne - całe pomieszczenie puste. Prosięta odsadzane są w wieku około 28
dni. Średnio od loch odchowuje się 10 prosiąt w miocie.
W okresie poprzedzającym doświadczenie (ok. 1,5 miesiąca przed porodami) na
fermie odnotowano zachorowania świń na grypę, w tym zachorowania loch, co potwierdzono
badaniami laboratoryjnymi (izolacja wirusa z wykorzystaniem zarodków kurzych SPF, PCR,
badania serologiczne). W badaniach wykorzystano pięć seropozytywnych loch (miano HI
antyH1 ≥ 640) i ich potomstwo (po 8 prosiąt z każdego miotu).
Krew do badań laboratoryjnych od loch i prosiąt pobierano z żyły czczej przedniej, do
probówek z przyspieszaczem wykrzepiania (Medlab, Polska). Krew od loch pobierano na 10
dni przed porodem, a od prosiąt w wieku 7, 21, 28 dni oraz 6, 8, 10, 12, 14 oraz 16 tygodni.
W celu oddzielenia surowicy probówki z krwią wirowano przez 15 minut przy 3000 obr./min.
Badania serologiczne. Do oznaczania poziomu swoistych przeciwciał w surowicy
zastosowano test zahamowania hemaglutynacji, który przeprowadzono zgodnie ze
standardową procedurą europejską, oraz komercyjny test ELISA (CIVTEST Suis Influenza,
8
Hipra, Hiszpania).
Test immunoenzymatyczny ELISA. Zgodnie z zawartą w ulotce zestawu informacją,
test wykrywa przeciwciała przeciw wirusowi grypy H1N1 oraz w mniejszym stopniu H3N2.
Płytki 96-dołkowe wchodzące w skład zestawu są opłaszczone specyficznym antygenem
wirusa grypy świń typu A. Badanie zostało przeprowadzone godnie z instrukcja producenta
zestawu.
Przed badaniem surowice zostały rozcieńczone zgodnie z rekomendacją (1:200). Pięćdziesiąt
mikrolitrów roztworu kontroli ujemnej i dodatniej (dołączonych do zestawu) oraz 50 µl
rozcieńczonych surowic badanych naniesiono do odpowiednich dołków i inkubowano 60
minut w temp. 37ºC. Po inkubacji płytkę trzykrotnie płukano, a następnie do każdego dołka
nanoszono po 50 µl roztworu koniugatu - przeciwciała skierowane przeciwko świńskim
immunoglobulinom klasy IgG znakowane peroksydazą chrzanową (HRPO). Płytkę
poddawano kolejnej inkubacji przez 60 minut w temp. 37ºC. Po wypłukaniu dodawano 50 µl
roztworu substratu 2,2-azynobis(3etylobenzotiazolino-6-sulfonianu) (ABTS) do każdego
dołka i delikatnie mieszano przez 2 sekundy. Płytkę poddawano 15 minutowej inkubacji w
ciemności. Wyniki odczytywano niezwłocznie po nałożeniu roztworu stopującego. Gęstość
optyczna (OD) mierzono przy długości fali 405 nm, z użyciem czytnika do mikropłytek
(Multiskan RC, Labsystems, Finlandia).
Obecność lub brak swoistych przeciwciał określono obliczając indeks względny IRCP
według wzoru: IRPC = [(OD próbki- xOD neg) / (xOD dod – xOD neg)] x100, gdzie:
xOD neg – średnia wartość OD kontroli ujemnej
xOD dod - średnia wartość OD kontroli dodatniej
IRPC ≥ 20.0 wskazywało na wynik dodatni, natomiast IRPC < 20.0 na wynik ujemny.
Zahamowanie
hemaglutynacji.
W
teście
zahamowania
hemaglutynacji
wykorzystano szczep referencyjny najczęściej występującego podtypu SIV w Europie: H1N1
9
(A/Sw/Bel/1/98), który otrzymano z Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu w
Gandawie, w Belgii. Celem uzyskania homogennej puli wirusa, szczep referencyjny
namnażano, zakażając 10-dniowe zarodki kurze SPF. Do oznaczenia miana wirusa użytego w
badaniach serologicznych zastosowano test hemaglutynacji.
Celem eliminacji niespecyficznych inhibitorów reakcji hemaglutynacji, surowice
pochodzące od zwierząt doświadczalnych poddawano inaktywacji termicznej w łaźni wodnej
w temp. 56ºC przez 30 minut. Następnie surowice inaktywowano chemicznie stosując
inkubację z roztworem RDE (Sigma), związkiem posiadającym właściwości niszczące
receptory wirusów, które mogłyby być przyczyną otrzymania wyniku fałszywie dodatniego.
W dalszym etapie, celem zahamowania aglutynacji krwinek, inkubowano surowice w 1,5%
roztworze cytrynianu sodu, w stosunku 1:5, przez 30 min., w 56ºC, a następnie z 50% RBC w
stosunku 1:10 w 4ºC przez 1 h, mieszając próbki co 15 minut. Takie postępowanie miało na
celu pozbycie się heteroaglutynin. Po zakończeniu inkubacji wstępnych materiał
odwirowywano (1000 obr./min przez 10 min.), a zebrany supernatant wykorzystywano do
testu zahamowania hemaglutynacji. W rezultacie do dalszych badań używano surowic w
rozcieńczeniu 1:10.
Poziom przeciwciał swoistych dla H1 wirusa grypy świń w badanych surowicach
określano testem HI w odmianie mikro. Stosowano 4 jednostki hemaglutynacyjne (4U HA)
wirusa oraz 0,5% roztwór RBC. Test wykonywano w 96-dołkowych mikropłytkach o
kolistym dnie. Wykonywano kolejne rozcieńczenia badanej surowicy w postępie
arytmetycznym, zaczynając od rozcieńczenia 1:20, a kończąc na rozcieńczeniu 1:2560,
pozostawiając dwie kolumny na płytce wolne: jedną dla surowicy referencyjnej, drugą dla
kontroli autoaglutynacji krwinek. Następnie dodawano 25 µl 4U HA wirusa (oprócz dołków z
kontrolą krwinek). W kolejnym etapie do wszystkich dołków dodawano 50 µl 0,5% roztworu
10
RBC w PBS. Zawartość mikropłytek mieszano i inkubowano około 60 min w temperaturze
pokojowej, do chwili aż krwinki opadły na dno basenika.
Miano HI stanowi odwrotność ostatniego rozcieńczenia badanej surowicy, która
całkowicie hamuje hemaglutynację. Jako graniczne miano dodatnie przyjmowano miano
przeciwciał antyhemaglutynujących ≥ 20. Dla wartości mian poniżej 20, w celach
przeprowadzenia obliczeń statystycznych przyjęto wartość 5.
Wyniki i dyskusja
Obecność swoistych przeciwciał w surowicy loch doświadczalnych potwierdzono
obydwoma testami użytymi w doświadczeniu. Miana przeciwciał antyH1 w surowicy loch na
dziesięć dni przed porodem, oznaczone przy pomocy testu zahamowania hemaglutynacji,
wynosiły średnio 1280 ± 783. Minimalna wartość miana hemaglutynacji wynosiła 640.
Wartości IRPC, określone z użyciem zestawu ELISA, wynosiły średnio 87,06 ±17,41.
Wyniki uzyskane po analizie materiału pochodzącego od prosiąt przedstawiono na ryc.
1, 2 i 3 oraz w tab.1.
Przeciwciała matczyne, u wszystkich 7-dniowych prosiąt użytych w doświadczeniu,
były na bardzo wysokim poziomie (przynajmniej 2560) i utrzymywały się na tym poziomie
do 3 tygodnia życia. Następnie obserwowano gwałtowny spadek miana HI do średniej
wartości 420 w przeciągu kolejnych pięciu tygodni. Począwszy od 8 tygodnia życia spadek
poziomu MDA był łagodniejszy.
Krzywa obrazująca spadek indeksu IRPC miała nieco odmienny przebieg. Może być
to związane z tym, że użyty w doświadczeniu test, nie jest swoisty jedynie dla przeciwciał
skierowanych przeciwko hemaglutyninie 1 wirusa grypy, gdyż, jak podaje producent zestawu,
za jego pomocą można wykrywać także przeciwciała antyH3. W pierwszych trzech
tygodniach życia spadek wartości indeksu IRPC był dosyć gwałtowny, by następnie, do 6
tygodnia życia, pozostać na poziomie mniej więcej stałym. W kolejnym okresie wartości
11
indeksu IRPC ulegały postępującemu spadkowi, osiągając około 13 tygodnia życia wartość
graniczną.
Przeciwciała matczyne utrzymywały się w surowicy prosiąt na poziomie uznawanym
za wynik dodatni (HI oraz IRPC powyżej 20) do mniej więcej 13-14 tygodnia życia.
Biorąc pod uwagę fakt, że do zakażenia wirusem grypy dochodzi najczęściej po
przeniesieniu zwierząt na warchlakarnię (tj. ok. 4-6 tygodnia życia), co wykazano w
badaniach przeprowadzonych przez Markowska-Daniel i wsp. (2005), obecność przeciwciał
matczynych może w dużym stopniu zredukować to niebezpieczeństwo.
W badaniach przeprowadzonych przez Loeffen i wsp. (2003) średni czas
utrzymywania się MDA antyH1 wynosił 7 tygodni, natomiast antyH3 10 tygodni. W
badaniach przeprowadzonych przez Fleck i wsp. (2002), MDA antyH1, mierzone testem HI,
były na poziomie poniżej wartości uznawanych za dodatnie już u 10 tygodniowych
warchlaków, podczas, gdy test ELISA wskazywał na ich obecność do około 13 tygodnia
życia. W badaniach własnych indeks IRPC, określony na podstawie wyników testu ELISA,
obniżył się poniżej wartości uznawanej za dodatnią, minimalnie wcześniej, niż miało to
miejsce w przypadku wyników uzyskanych przy pomocy testu zahamowania hemaglutynacji
(Rys. 3.).
Stwierdzono silną korelację dodatnią pomiędzy średnimi wynikami uzyskanymi przy
pomocy testu zahamowania hemaglutynacji, a wynikami testu ELISA (współczynnik
korelacji r = 0,83; p = 0,01) (Rys.4.)
Badania serologiczne służące do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko
wirusowi grypy znajdują zastosowanie w określeniu statusu immunologicznego stada lub
określenia optymalnego terminu szczepień. Ponadto, pomimo, iż niezbitym dowodem
zakażenia wirusem grypy jest wyizolowanie wirusa lub potwierdzenie obecności jego
materiału genetycznego w tkance płucnej czy wymazie z nosa, ze względu na dość krótki czas
12
przebywania wirusa grypy w organizmie chorego zwierzęcia, metody serologiczne znajdują
zastosowanie także w diagnostyce choroby.
Do dyspozycji jest kilka testów serologicznych, w tym test zahamowania
hemaglutynacji, test seroneutralizacji oraz komercyjne testy ELISA. Metodą rekomendowaną
przez OIE i najczęściej stosowaną w laboratoriach jest test zahamowania hemaglutynacji.
Test ten jest tak zaprojektowany, by wykrywać swoiste przeciwciała skierowane przeciwko
hemaglutyninom wirusa grypy. Jest to test stosunkowo tani, a jednocześnie pozwalający na
wykrycie przeciwciał antyH, które w dużym stopniu zabezpieczają przed zakażeniem
(oczywiście należy pamiętać, że ochrona ta będzie się wiązała z zakażeniem tym samym
podtypem, co wirus wykorzystany w teście zahamowania hemaglutynacji). Nie mniej jednak,
przeprowadzenie testu zahamowania hemaglutynacji jest dosyć praco – i czasochłonne. Nie
bez znaczenia jest także fakt konieczności pozyskiwania komponentów do przeprowadzenia
tego testu od zwierząt (krew), co może budzić wątpliwości natury etycznej. Nie ulega
wątpliwości, że opracowanie szybkiego, taniego, prostego w użyciu i skutecznego narzędzia
do analizy dużej liczby próbek jednocześnie, byłoby cenna alternatywą dla testu
zahamowania hemaglutynacji. Powyższe warunki mógłby teoretycznie spełnić test ELISA,
zwłaszcza w kontekście określania profili serologicznych stad.
W badaniach własnych stwierdzono silną korelację pomiędzy średnimi wynikami
uzyskanymi przy pomocy testu zahamowania hemaglutynacji oraz testu ELISA (r = 0,83, p =
0,01). W przeprowadzonych badaniach, na 360 ocenionych surowic, nie stwierdzono
wyników
fałszywie
dodatnich
(mając
za
metodę
odniesienia
test
zahamowania
hemaglutynacji), natomiast wyniki fałszywie ujemne stwierdzono w 28 przypadkach, co
stanowi 7,7% wszystkich wyników.
Na podstawie uzyskanych wyników, trudno jest jednak wnioskować, na ile test ten
może znaleźć zastosowanie w ocenie dynamiki zmian poziomu przeciwciał, w kontekście
13
wykrycia aktualnego zakażenia. Zagadnienie to wymaga niewątpliwie przeprowadzenia
odrębnych badań, które uwzględniałyby jego czułość oraz swoistość.
Analizując uzyskane wyniki, nie jest możliwe wiarygodne oszacowanie swoistości
testu, gdyż ocenie poddawano relatywnie małą liczbę próbek negatywnych, oraz nie
analizowano reakcji krzyżowych.
Podsumowanie. Moment, w którym poziomy MDA spadły poniżej wartości
uznawanych za dodatnie, wyznaczony na podstawie wyników obu zastosowanych testów, był
bardzo zbliżony. Jak wykazano, potomstwo pochodzące od loch z wysokimi mianami
przeciwciał antyH1 w surowicy, posiada odporność bierną do osiągnięcia wieku około 13-14
tygodni. Biorąc pod uwagę fakt, że MDA mogą interferować z antygenem szczepionkowym,
a wydaję się to szczególnie istotne w przypadku szczepionek inaktywowanych, szczepienie
warchlaków 4-5 tygodniowych i powtórnie 8-9 tygodniowych może być dosyć
problematyczne i w efekcie okazać się nieskuteczne. Ponadto, jak wykazali Kitikoon i wsp.
(2006) szczepienie prosiąt w obecności MDA (miano HI od 40 do 80), może paradoksalnie
doprowadzić do wystąpienia choroby o cięższym przebiegu.
Obserwując dynamikę obniżania się poziomów MDA, oraz czas potrzebny do
pojawienia się przeciwciał poszczepiennych, bardziej zasadne i efektywne mogłoby się
okazać szczepienie warchlaków dwukrotnie w wieku 8 i 10, czy nawet 8 i 12 tygodni.
Optymalnie, moment szczepień dla każdej jednostki chorobowej, w tym także dla grypy świń,
powinien być wyznaczany na podstawie wyników badań serologicznych w odniesieniu do
każdego stada, wykonanych w specjalistycznym laboratorium. Takie postępowanie pozwala
na najbardziej efektywne, także z punktu widzenia ekonomicznego, stosowanie szczepionek.
Piśmiennictwo u Autorów
14
Tab.1. Średnie (±SD) poziomy przeciwciał matczynych antyH1 w surowicy świń w
zależności od wieku i rodzaju użytego testu (na czerwono oznaczono wartości uznawane za
wyniki ujemne)
Wiek w tygodniach
Średnia ± SD
Miano HI
Indeks IRPC
1
3
4
6
8
10
12
14
16
2560
2560
1920
852,5
420
175
70
8,75
5,0
±0
±0
±783
±352
±160
±123
±20
±7,5
±0
99,31
83,89
82,41
78,28
64,49
53,02
40,29
9,92
7,87
±6,82
±30,43
±5,06
±5,72
±6,47
±9,81
±3,76
±5,51
±4,28
15
2560,0 2560,0
2600
2400
2200
miano HI oraz wartość IRPC
2000
1920,0
1800
1600
1400
1200
1000
852,5
800
600
420,0
400
175,0
200
70,0
0
0
1
3
4
6
8
10
12
8,8
5,0
14
16
18
wiek w tygodniach
Rys.1. Poziom humoralnej odporności biernej w zależności od wieku świń – wyniki testu
zahamowania hemaglutynacji
16
120
99,31
miano HI oraz wartość IRPC
100
83,89
82,41
78,28
80
64,49
60
53,01
40,29
40
20
9,92
7,87
0
0
1
3
4
6
8
10
wiek w tygodniach
12
14
16
18
Rys.2. Poziom humoralnej odporności biernej w zależności od wieku świń – wyniki testu
ELISA
17
320
300
miano HI
IRPC
280
260
miano HI oraz wartość IRPC
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0
1
3
4
6
8
10
12
14
16
18
wiek w tygodniach
Rys.3. Porównanie czasu utrzymywania się przeciwciał matczynych na podstawie wyników
testu zahamowania hemaglutynacji i ELISA (wielkości < 20 wskazują na wynik ujemny)
18
r = 0,83175, p =0.01
120
wartość IRPC
100
80
60
40
20
0
0
400
800
1200
miano HI
1600
2000
2400
0,95 Prz.Ufn.
Ryc.4. Korelacja pomiędzy średnimi wynikami uzyskanymi przy pomocy testu zahamowania
hemaglutynacji i testu ELISA
19