InŜynieria genetyczna, klonowanie, terapia genowa

InŜynieria genetyczna, klonowanie,
terapia genowa
dr n. med. Bogusław Nedoszytko
WSZPIZU
Wydział w Gdyni
Gen - odcinek kwasu dezoksynukleinowego (DNA)
kodujący jeden łańcuch polipeptydowy lub jedną
cząsteczkę kwasu rybonukleinowego (RNA).
Gen - odcinek DNA kodujący jeden łańcuch polipeptydowy.
replikacja
DNA
DNA
transkrypcja
RNA
( m, t, r )
translacja
białko
Gen - odcinek DNA kodujący jeden łańcuch polipeptydowy.
Gen zajmuje stałe miejsce ( locus ) w chromosomie
homologicznym
Jądro
Chromosom
Gen
Genom człowieka:
46 chromosomów
2,6 metra DNA
3 miliardy par nukleotydów (A,T,G,C)
30 000 –40 000 genów
Gen 1000 - 200 000 par
nukleotydów
Cecha autosomalna - cecha kodowana przez gen mający
swój locus w chromosomach autosomalnych.
Cecha sprzęŜona z płcią ( z chromosomem X) - cecha
kodowana przez gen mający swój locus w
chromosomie płciowym X.
Cecha holandryczna - cecha kodowana przez gen
mający swój locus w chromosomie płciowym Y.
Fenotyp - obserwowane cechy charakterystyczne
osobnika, których ujawnianie się jest wynikiem
oddziaływania czynników genetycznych i
środowiskowych.
Ekspresja genu - stopień fenotypowego przejawiania się
genu. Stopień nasilenia cechy, objawów .
1944r, Avery, McLeod, McCarty publikują pracę
stwierdzającą, Ŝe czynnikiem, który moŜe przywracać
infekcyjność bakterii Streptococcus pneumonae (dwoinka
zapalenia płuc), jest czysty DNA.
1950r , E. Chargraff odkrywa "alfabet DNA", czyli
skład nici DNA oraz przedstawia regułę, głoszącą, ze
liczba zasad pirymidynowych w DNA jest równa liczbie
zasad purynowych.
1953r, J. D. Watson i F.Crick, prezentują DNA, jako
helisę złoŜoną z dwóch nici powiązanych wiązaniami
wodorowymi. Na podstawie obrazów dyfrakcji promieni
X, dostarczonych przez R. Franklin i M. Wilkinsa oraz
odkryć E. Chargraffa, udało się stworzyć model DNA.
W 1962 roku J. D. Watson, F.Crick i M. Wilkins
otrzymują Nagrodę Nobla.
1956r, Dokładne zbadanie ludzkiego kariotypu i
podanie właściwej liczby chromosomów ludzkich (46)
- Tijo i Levan
1958r, Beadle, E. Tatum i J. Lederberg
otrzymują Nagrodę Nobla za ustalenie
podstawowych prawideł rządzących genetyką
bakterii i grzybów.
J. Lederberg zajmował się badaniem zjawiska
koniugacji i transdukcji u bakterii,
Beadle, E. Tatum, jeszcze w 1941 byli autorami
stwierdzenia jeden gen - jeden enzym.
1959r, Nagroda Nobla za prace dotyczące
polimeryzacji kwasów nukleinowych dla A.
Kronenberga i S. Ochoa.
Kronenberg, jako biochemik, zajmował się badaniem
aktywności enzymów, w latach pięćdziesiątych skupił się
na enzymach replikujących DNA - wyizolował
polimerazę DNA I.
S. Ochoa, zajmował się enzymami wykorzystującymi
energię z wysokoenergetycznych wiązań ATP.
1961r, J. Monod, A. M. Lwoff i F. Jacob
przedstawiają operonowy model ekspresji genów
prokariotycznych. Za swoje badania otrzymują
Nagrodę Nobla w 1965 roku.
1968r, Nagroda Nobla dla R.W. Holleya, H.G.
Khorana i M.W. Nirenberga za ustalenie podstaw
kodowania informacji genetycznej (rozszyfrowanie
kodu genetycznego).
M.W. Nirenberg odkrył, Ŝe w ekstrakcie komórek
E. coli moŜe zachodzić synteza nowych białek po
dodaniu mRNA W 1961 roku udało mu się ustalić, Ŝe
sekwencja UUU koduje fenyloalaninę.
H.G. Khorana, odkrył w jaki sposób moŜna
syntetyzować trójnukleotydowe fragmenty RNA o
znanej sekwencji - pozwoliło to na rozszyfrowanie
kodu genetycznego.
R.W. Holley - zajmował się badaniami nad tRNA,
ustalił, Ŝe ma on strukturę liścia koniczyny.
1970r,
H.G. Khorana styntetyzuje pierwsze DNA
in vitro
1975r,
D. Baltimore, R. Dulbecco i H.M Temin
otrzymują Nagrodę Nobla za odkrycie
retrowirusów i odwrotnej transkryptazy
(enzymu, który moŜe syntetyzować DNA na
matrycy RNA)
1977r
F. Sanger, Barrel i Maxam i W. Gilbert
udoskonalają metody sekwencjonowania DNA,
F. Sanger i W. Gilbert (wraz z P. Bergiem)
w 1980 roku dostają Nagrodę Nobla
Pierwszy sklonowany gen ludzki przez J.
Shine (somatomammotropina sklonowana na
plazmidzie bakteryjnym)
Itakurze udaje się uzyskać somatostatynę
drogą inŜynierii genetycznej
1983r
B. McClintock otrzymuje Nagrodę Nobla
za odkrycie ruchomych elementów
genetycznych - transpozonów. B.
McClintock prowadziła swe badania jeszcze
w latach czterdziestych. Badając
kukurydzę zauwaŜyła, Ŝe niektóre cechy
dziedziczą się niezgodnie z prawami
Mendla.
K. Mullis przedstawia załoŜenia metody
PCR. Obecnie jest to podstawowa metoda
uŜywana w badaniach naukowych i analizach
klinicznych. K. Mullis dostał Nagrodę
Nobla w dziesięć lat po swoim odkryciu
1990r,
Pierwsza kliniczna próba terapii genowej.
Leczenie SCID przez (cięŜki, złoŜony niedobór
immunologiczny) przez wprowadzenie
prawidłowej kopii genu ADA (deaminaza
adenozyny).
1993r,
Nagroda Nobla za odkrycie genów
podzielonych (pokazano, Ŝe w genach znajdują
się regiony kodujące - eksony i niekodujące introny). Nagrodę otrzymali P. Sharp i R.
Roberts.
1996r,
Ian Wilmut sklonowanie owcy Dolly
2001r,
Craig Venter odczytanie 95% DNA u pięciu
osób - obu płci i róŜnych ras.
Jose B. Cibelli, Robert P. Lanza i Michael D.
West - sklonowanie ludzkich zarodków.
Biotechnologia i
inŜynieria genetyczna
Biotechnologia - zespół technologii , słuŜących
do wytwarzania uŜytecznych , Ŝywych
organizmów lub substancji pochodzących z
organizmów lub ich części. Inaczej - wszelkie
manipulacje Ŝywymi organizmami prowadzące do
osiągnięcia określonych korzyści.
"Biotechnologia to zintegrowane zastosowanie
wiedzy i techniki w dziedzinie biochemii ,
mikrobiologii i nauk inŜynieryjnych w celu
technologicznego wykorzystania zdolności
drobnoustrojów , kultur tkankowych lub części z
nich."
InŜynieria genetyczna - zespół technik
badawczych pozwalający na wyizolowanie i
charakterystykę określonych genów , a takŜe
wprowadzenie do nich zmian.
Odkrycie dwóch typów enzymów
przyczyniło się w duŜej mierze do
rozwinięcia technik klonowania DNA.
Pierwszy z nich to enzymy restrykcyjne tnące DNA kaŜdego organizmu na
powtarzalny komplet fragmentów. Drugi
typ to ligazy - enzymy trwale łączące
pocięte fragmenty z samoreplikującymi się
cząsteczkami DNA tzw. wektorami.
Pozwala to na produkowanie
zrekombinowanego DNA. MoŜe on być
włączany do odpowiednich komórek komórek gospodarza.
RESTRYKTAZY - tną DNA tworząc
powtarzalny komplet fragmentów.
Ligazy - enzymy trwale łączące pocięte
fragmenty z samoreplikującymi się
cząsteczkami DNA tzw. wektorami.
WEKTOR - cząsteczka DNA mogąca być nośnikiem
interesującego nas kawałka DNA, która posiada
zdolność do autonomicznej replikacji w danym typie
komórek.
Zmodyfikowane genetycznie
wirusy i bakterie
Zmodyfikowane wirusy:
- szczepionki,
-wektory dla wprowadzania genów do bakterii,
terapii genowych
Zmodyfikowane bakterie:
-szczepionki bakteryjne
- wytwarzające ludzkie białka – insulina,
somatotropina
- rozkładające zanieczyszczenia
ropopochodne
Szczepionki
•Szczepionki zawierające Ŝywe atenuowane
drobnoustroje (atenuacja przez wprowadzenie
do genomu ściśle określonych mutacji
delecyjnych).
Np.. szczepionki przeciwko Salmonella typhi.
• Szczepionki podjednostkowe
fragment genu Clostridium tetani kodujący
domenę toksyny odpowiedzialną za jej
immunogenność sklonowano w komórkach E.coli
- szczepionka przeciwko wirusowi Ŝółtaczki
Hepatitis B produkowana w komórkach droŜdŜy
dzięki ekspresji antygenu otoczki wirusowej
Szczepionki tzw. III generacji :
- podanie czystego genu - "nagie"
szczepionki.
- wstrzyknięcie do mięśni szkieletowych
DNA wirusa grypy w formie plazmidu
indukuje powstanie specyficznych
cytotoksycznych limfocytów T.
Transgeniczne rośliny i
zwierzęta
Organizm transgeniczny - organizm wyŜszy ,
do genomu którego wprowadzono nowy gen ,
heterologiczny (z innego organizmu) w taki
sposób , aby znalazł się on zarówno w
komórkach somatycznych jak i komórkach
pasma płciowego dzięki czemu podlega
dziedziczeniu. Jest to trwała modyfikacja
genetyczna.
Transgeniczne rośliny
Transgeniczne rośliny:
Naturalny system wprowadzania DNA - plazmidy
Agrobacterium jako wektory DNA dla roślin
dwuliściennych.
Bezwektorowa transfekcja komórek roślinnych
- elektroporacja
- mikroiniekcja
-zastosowanie "armatki genowej"
-- wstrzeliwanie drobnych kuleczek
wolframowych opłaszczonych DNA
Zwiększanie trwałości roślin dzięki ingerencji w
ich metabolizm np. stworzenie niegnijącego
pomidora poprzez wykorzystanie strategii
antysensu tzn. transformacja antysensownym
RNA . –
Antysensowne oligonukleotydy - krótkie odcinki jednoniciowego
DNA lub RNA komplementarne do specyficznych sekwencji genu.
√ oligonukleotydy bez właściwości katalitycznych
√ oligonukleotydy o własnościach katalitycznych (rybozymy)
Mechanizm działania:
√ hamowanie transkrypcji przez tworzenie trójniciowej struktury z
DNA
√ hamowanie procesu dojrzewania mRNA
√ hamowanie transportu mRNA z jądra do cytoplazmy
√ przyspieszenie degradacji mRNA
√ blokowanie inicjacji translacji
Rybozym
Zasada działania antysensownego DNA
Wprowadza się do genomu gen natywny dodatkowy ,
zamiast wzmoŜonej ekspresji obserwuje się efekt
odwrotny aŜ do wygaszenia. Uzyskano w ten sposób
niewiędnące goździki.
Uzyskanie nowych odmian - nowych kolorów ,
kształtów , właściwości wzrostu np. roślin
ozdobnych m.in. pomarańczowe petunie
(transformacja z udziałem Agrobacterium
genem ze szlaku produkcji antocyjaniny z
kukurydzy) czy przekształcenie ziemniaka w
roślinę ozdobną.
•Wykorzystanie roślin jako bioreaktorów do
produkcji białek heterologicznych. W ten sposób
produkowane są interleukiny , cytokiny , hormony
wzrostu , przeciwciała. (niski koszt, duŜa ilość
białka)
• Uodpornienie roślin na infekcje co daje zwiększone
plony , lepszy wzrost i wyŜszą jakość poprzez
zainfekowanie ich szczepem wirusowym powodującym
łagodniejszy efekt chroni przed infekcją przez bardziej
zjadliwy szczep lub transgenizacja genami kodującymi
białko płaszcza danego wirusa np. wirusa mozaiki
tytoniowej.
Ochrona przed owadami np. dzięki ekspresji toksyny
bakteryjnej Bacillus thuringiensis chroniona jest bawełna
lub dzięki transgenicznej ekspresji inhibitora proteaz
serynowych - tytoń.
Uodpornienie roślin na herbicydy (2,4D)
Ziemniaki Bt odporne na szkodniki
(np. stonkę)
- zboŜa asymilujące azot z powietrza
- rośliny z genami antygenów wirusowych
lub bakteryjnych – szczepionki
- rośliny odporne na mróz
- rośliny z genem fluorescencji – oświetlanie
ulic
Transgeniczne zwierzęta
Transgeniczne zwierzęta to organizmy , które mają
obcy DNA wbudowane trwale do komórek
rozrodczych - komórek linii płciowej.
Uzyskuje się je:
- dzięki mikroiniekcji in vitro DNA do jednego z
przedjądrzy zapłodnionej komórki jajowej przed
pierwszym jej podziałem ,
- przez infekcję wczesnego zarodka
zrekombinowanym wektorem pochodzenia
wirusowego ,
- poprzez modyfikację genetyczną pierwotnych
komórek węzła zarodkowego i wprowadzenie ich
do zarodka w stadium blastocysty, poniewaŜ
komórki węzła zarodkowego są zdolne do
róŜnicowania się we wszystkie typy komórek,
Pierwszym zwierzęciem transgenicznym była
mysz z genem hormonu wzrostu szczura.
POLLY (z lewej) jest transgenicznym
klonem rasy Poll Dorset z
wprowadzonym ludzkim genem
czynnika IX.
Klonowanie zarodków ssaków
Klonowanie zarodków ssaków.
Dzięki temu moŜliwe jest uzyskanie wielu
identycznych osobników. Wzbudza to ogromne
zainteresowanie m.in. hodowców mających
nadzieje na stworzenie jak największej liczby
zwierząt o poŜądanych cechach.
1. Metoda izolacji blastomerów.
2. Metoda agregacji blastomerów.
3. Metoda podziału zarodków.
4. Metodą transplantacji jąder komórek
zarodkowych.
Metoda izolacji blastomerów.
W miarę kolejnych podziałów zygoty
powstaje wiele komórek potomnych blastomerów. Początkowo kaŜdy z nich
jest taki sam i teoretycznie posiada
moŜliwość utworzenia wszystkich
pozostałych komórek. Znaczy to , Ŝe w tym
stadium z kaŜdego blastomeru moŜe
powstać cały organizm. Doświadczalnie
zostało to potwierdzone dla stadium nie
przekraczającego ośmiu blastomerów.
Jest to takŜe uzaleŜnione od gatunku.
Metoda transplantacji jąder komórek
zarodkowych.
Jest to jedyna metoda pozwalająca na
uzyskanie klonów liczących większą liczbę
osobników. Usuwane są oba przedjądrza
zygoty lub chromosomy z nie zapłodnionych
oocytów a następnie wprowadzane są na ich
miejsce jądra z blastomerów zarodków.
Wprowadzenie uzyskuje się róŜnymi
metodami : mikrochirurgiczną
transplantacją , metodą fuzji komórkowych
czego odmianą jest elektrofuzja itd.
1951 - Pierwsze udane przeniesienie embrionu z macicy jednej krowy do
innej;
1952 - Klonowanie Ŝab z komórek kijanek;
1970 - Sklonowanie mysich embrionów;
1979 - Sklonowanie owczych embrionów;
1980 - Sklonowanie krowich embrionów;
1984 - Australijka o imieniu Zoe urodziła się z zamroŜonego embrionu;
Marzec 1996 - Ian Wilmut z Roslin Institute w Edynburgu (Wielka
Brytania) ogłasza, Ŝe otrzymał pięć owieczek sklonowanych przez
podział dziewięciodniowego zarodka. Trzy owce wkrótce po porodzie z
niewyjaśnionych przyczyn zdechły. Dwie pozostałe - Megan i Morag w
kwietniu 1997 zaszły w ciąŜę. Naukowcy z dumą podkreślają, Ŝe do
zapłodnienia doszło w sposób naturalny;
Megan i Morag sklonowane przez podział dziewięciodniowego
zarodka
5 lipca 1996 Ianowi Wilmutowi urodziła się Dolly –
pierwsza owca sklonowana z komórki pobranej z
dorosłego organizmu;
Dolly z poczętym naturalnie
jagnięciem
Procedura klonowania Dolly :
-pobranie jądra komórkowego z komórki
wymienia dorosłej owcy,
- połączenie tegoŜ jądra z pozbawioną
uprzednio jądra komórką jajową
(oocytem).
- wszczepienie tak spreparowanej komórki
jajowej matce zastępczej.
-Dolly urodziła się za 277próbą
Dolly nie była klonem Ŝadnej z trzech owiec
uŜytych w tym eksperymencie, bowiem ma dwa
genomy od dwóch róŜnych owiec A i B (jądrowy
i mitochondrialny) oraz „matkę” zastępczą.
.
Lipiec 1997 - TakŜe w Roslin Institute urodziły się Polly i Molly - dwie
owce sklonowane z komórek zarodkowych z "wstawionym"
dodatkowym genem, kierującym produkcją białka - leku dla chorych
na hemofilię;
Sierpień 1997 - Naukowcy z Beaverton w USA sklonowali małpy,
dzieląc ich ośmiokomórkowe embriony;
Styczeń 1998 - Richard Seed, biznesmen i ekscentryczny naukowiec
(fizyk, który w latach 70. przekwalifikował się na biologię) z USA,
ogłosił, Ŝe w ciągu półtora roku zamierza sklonować człowieka;
20 stycznia 1998 - Pierwszy raz pokazano George'a i Charliego transgeniczne byczki sklonowane przez naukowców z Uniwersytetu
Massachusetts (USA);
16 lutego 1998 w PPL Therapeutics (firmie współpracującej z
Wilmutem) przyszedł na świat cielak sklonowany tą samą metodą co
owca Dolly. Na pamiątkę tego, Ŝe urodził się w święto - Dzień
Prezydenta, nazwano go Mr. Jefferson;
5 lipca 1998 w Japonii na świat przychodzą dwie sklonowane
jałówki.
Sklonowany gaur (Bos gaur)
?
Klonowanie terapeutyczne
Proces klonowania terapeutycznego polega
na wprowadzeniu jądra "dorosłej" komórki do
"pustej" (pozbawionej własnego jądra)
komórki jajowej. Taka hybryda moŜe
następnie stworzyć nowy zarodek identyczny
genetycznie z dawcą jądra komórkowego.
Klonowanie terapeutyczne - po co?
Aby z powstałych zarodków pozyskiwać
komórki macierzyste. Komórki te potrafią
przekształcić się w dowolną tkankę organizmu,
np. we włókna nerwowe, komórki krwi czy
włókna mięśni.
Komórki macierzyste mogą stać się
niewyczerpanym źródłem tkanek zastępczych.
Początkowo niewielkie grupy komórek
wszczepiano by do organizmu w celu naprawy
uszkodzeń, np. po zawale serca. Docelowo z
komórek macierzystych moŜna by hodować
całe narządy.
Komórki macierzyste – klonowanie
terapeutyczne
wątroba,
Krew (przeszczep szpiku,)
Siatkówka (retinopatie)
Mózg (choroba Parkinsona , Alzheimera)
Serce
skóra
Terapia genowa - metody,
nadzieje i rzeczywistość
Terapia genowa
♣ korekcja defektu genetycznego przez
wprowadzenie do komórek prawidłowego genu
♣ zmiana własności komórek przez wprowadzenie
obcego genu
♣ regulacja ekspresji nieprawidłowego genu.
Rodzaje terapii genowych:
Terapia genowa komórek płciowych
Terapia genowa zarodków
Terapia genowa komórek somatycznych
Terapia genowa komórek macierzystych (stem
cells)
Terapia genowa in vivo
Terapia genowa ex vivo
Wektor - cząsteczka DNA (wirus, plazmid,
chromosom) przenosząca leczniczy gen.
gen
Cechy idealnego wektora genowego:
- wprowadza jeden lub więcej genów
- rozpoznaje komórki docelowe
- ulega ekspresji wyłącznie w komórkach
docelowych
- nie wywołuje reakcji immunologicznej
- insercja wektora do DNA nie powoduje mutacji
- zachowuje stabilność w komórkach docelowych
i potomnych
- łatwość syntezy
Uwidacznianie komórek po transfekcji przez
wprowadzanie genu:
- lucyferazy
- białka zielonej fluorescencji
- beta-galaktozydazy
Niewirusowe techniki transferu DNA
• transfekcja z uŜyciem jonów wapnia
• mikroinjekcja
• elektroporacja
• liposomy
• iniekcja plazmidowego DNA
• bombardowanie cząsteczkami DNA ( gene-gun
transfer)
• wprowadzanie sztucznych chromosomów
• wektory biochemiczne - połączenia DNA z
białkami
Gene-gun transfer, balistic DNA injection, particle
bombardement
DNA plazmidowe jest precypitowane na cząsteczkach złota o
wielkości 1-3 mikronów. Cząsteczki te wprowadzane są do
komórek przy zastosowaniu urządzeń wykorzystujących pulsy
prądu o wysokim napięcia lub ciśnienie helu.
Zastosowania:
* wprowadzanie DNA do komórek skóry, wątroby i mięśni.
* immunizacja przy pomocy szczepionek DNA wprowadzanych do
mięśni (HIV, Hepatitis B,C, HSV, papilloma, influenza, ch. Lyme ,
Helicobacter pylori, malaria).
Pistolety genowe (gen
guns)
Liposomy - lipidy reagujące elektrostatycznie z ujemnie
naładowanym DNA tworząc stałe
kompleksy
- Kationowe
- pH-wraŜliwe
- chronią DNA przed degradacją
- wprowadzają duŜe cząsteczki DNA
- nie są immunogenne
- nie powodują ryzyka zakaŜenia
kompetentnym wirusem
Lipofektyna : - N-[1-(2,3-diolejoylx)propyl]-N-N-Ntrimethylo amono
- dioleoyl fosfatydyloetanolamina (DOPE)
Wirusowe techniki transferu DNA
- wektory retrowirusowe (HIV, MLV).
- wektory adenowirusowe
- adeno-associated wiruses (AAV)
- wektory z wirusa opryszczki (HSV)
- wektory z wirusa Vaccinia
- wektory z wirusa Sendai
Prawidłowy wirus
Zrekombinowane
wirusy
Transfer przy uŜyciu Adenoma associated virus
(AAV)
A. Liposomy
>20kb
(+) - nieimmunogenne
- nie powodują chorób
(-) - mała skuteczność transferu
- nietrwała ekspresja
B. Retrowirusy
8-10kb (+) - integracja do genomu
- stabilna ekspresja
(-) - wymagają komórek dzielących się
- losowość integracji → mutacje
c. Adenowirusy
8 - 35 kb (+) - nie powoduje powaŜnych chorób
- nie wymagają komórek
dzielących się
(-) - brak integracji
- immunogenność
Współczesne zastosowania terapii genowej:
• Terapia dziedzicznych chorób jednogenowych:
• niedobory odporności ( ADA-SCID, sprzęŜona z X-SCID)
• dystrofie mięśniowe
• mukowiscydoza (cystic fibrosis)
• hemophilia B
• cukrzyca typu I
• choroby metaboliczne (fenyloketonuria,
hipercholesterolemia etc.)
• choroby spichrzeniowe (mukopolysacharydozy, ch.
Gauchera,)
• Terapia dziedzicznych chorób wieloczynnikowych:
• nowotwory
• choroby naczyń krwionośnych (choroba wieńcowa, choroby
naczyń kończyn)
• choroby neurodegenercyjne (ALS, MS, ch. Alzheimer, ch.
Parkinsona)
• choroby reumatyczne
• Terapia chorób nabytych
• urazy (złamania kości, leczenie ran )
• choroby infekcyjne
• Znakowanie genami komórek
•nowotwowy (białaczki, czerniak, rak sutka i inne)
14.09. 1990r - Blaese RM, Anderson
WF,
Culver K.W z National Institute of Health,
po razpierwszy zastosowali terapię genową
u człowieka. 4 letniej pacjentce, Ashanti De
Silva , chorej na wrodzony, cięŜki
niedobór
odporności immunologicznej
(SCID)
powodowany brakiem aktywności
dezaminazy adenozyny (ADA)
wprowadzono zmodyfikowane ex vivo autologiczne limfocyty T z
wprowadzonym prawidłowym genem ADA. Pacjentka Ŝyje do dzisiaj,
wykazując 25% aktywność enzymu. 4 miesiące później taki sam
zabieg przeprowadzono u 9 - letniej dziewczynki Cindy Cutshall.
Jesse Gelsinger, 18 lat , pacjent
Institute for Human Gene
Therapy University of
Pensylwania zmarł 17 VII 1999r
z powodu powikłań po terapii
genowej przy uŜyciu
adenowirusa z genem OTC
Niedobór transkarbamylazy ornitynowej (OTC)
powoduje niezdolność do eliminacji z organizmu
amoniaku. J.G. cierpiał na łagodną postać choroby,
leczony na diecie bezbiałkowej miał w czasie choroby
trzy epizody śpiączki. Na drugi dzień po podaniu
adenowirusa z terapeutycznym genem zapadł w
śpiączkę i zmarł na 4 dzień z powodu obrzęku i
niewydolności płuc.
Terapia genowa X-SCID.
Dr Marina Cavazzana-Calvo z Hopital Necker w ParyŜu
Wprowadzono przy uŜycie retrowirusa genu
kodującego łańcuch gamma receptorów interleukin Il-2,
Il-4,IL-7,IL-9,IL-15 do komórek macierzystych szpiku
CD34+ .
Po upływie 30-60 dni stwierdzono oznaczalne miana
komórek NK i T.
Terapia genowa czerniaka złośliwego skóry
l
immunoterapia czynna (immunoterapia bierna - modyfikacja
TIL ( geny IL-2, TNFα )
lautoszczepionki) - modyfikacja genetyczna komórek
nowotworowych
doguzowa iniekcja genów cytokin: Il-2, IL4, Il-7, Il-12,
genu IFN gamma, GM -CSF, genu HLA-B7, E2F
iniekcja zmodyfikowanych in vitro komórek:
- autologicznego guza (gen B7/β-2 microglobulina, Il-4,, Il6, Il-6R )
- allogenicznego guza
- zmodyfikowanych genetycznie ksenogenicznych
komórek (komórki myszy z TK, Vero z IL-2)
iniekcja komórek guza łącznie ze zmodyfikowanymi
genetycznie fibroblastami
Andrzej Mackiewicz. - Wielkopolskie Centrum Onkologii,
Poznań
Metoda transferu - retrowirus DCCMV
Metoda znakowania - B-galaktozydaza (Lac Z)
Stosowane geny: IL-6, IL-6R
Protokół terapii:
• wycięcie guza
• hodowla komórek guza
• transfekcja terapeutycznym genem
• naświetlenie komórek promieniami Roentgena
• domięśniowa iniekcja transgenicznych komórek
Wyniki:: Ok. 200 pacjentów z czerniakiem w III/IV
stadium klinicznym. $0% reagowało na szczepionkę, z tego
60% przeŜyło 2 lata.