Struktura i replikacja DNA

Struktura i replikacja
DNA u bakterii
Wstęp
Makrocząsteczki odgrywające kluczową rolę w przepływie
informacji genetycznej u bakterii to DNA, RNA oraz białka.
W pierwszej części prezentacji przedstawiona jest struktura
chemiczna DNA.
Druga część prezentacji dotyczy opisu samego procesu
replikacji.
Część I
Struktura DNA
DNA jest polinukleotydem zbudowanym z serii powtarzających się
elementów strukturalnych. Elementami tymi są nukleotydy.
O
O
P
O
CH2
Pojedynczy nukleotyd
DNA
O
O
H
H
H OH H H
Nukleotyd DNA zawiera trzy składowe:
Grupa fosforanowa:
O
O
P
Dezoksyryboza:
5
O
CH3
H
H
O
H
O
+
Zasada azotowa
1
H
OH H
+
H
Cykliczny cukier pięciowęglowy.
Atomy węgla oznaczone są numerami 1’ do 5’
Grupa fosforanowa i dezoksyryboza występują w postaci
niezmienionej we wszystkich nukleotydach DNA, natomiast
zasady azotowe mogą się różnić. W DNA zasadami tymi mogą być:
Cytozyna (C)
Tymina (T)
H
CH3
NH2
H
H
N
N
H
H
O
N H
O
Pirymidyny
Guanina (G)
H
O
H N
Adenina (A)
N
H N
H
H
H
N
N
N
N
O
N
H N
H
N
H
N
H
Puryny
Zasady azotowe dzielą się na dwie grupy:
Pirymidyny są sześcioczłonowymi pierścieniami zawierającymi
atomy węgla i azotu. Do tej grupy należą: cytozyna i tymina, które
oznaczane będą następującym symbolem graficznym:
Puryny zbudowane są z dwóch sprzężonych pierścieni, sześcioi pięcioczłonowego, zawierających atomy węgla i azotu. Do tej
grupy należą adenina i guanina, które oznaczane będą
następującym symbolem graficznym:
Nukleotyd DNA powstaje w wyniku przyłączenia grupy fosforanowej
do atomu węgla 5’ dezoksyrybozy oraz jednej z czterech zasad
azotowych do atomu węgla 1’ dezoksyrybozy.
O
O
5
P
C
CH2
O
O
H
1
H
O
H
OH H
H
Pokazana struktura stanowi jeden nukleotyd. Nić DNA składa się z
wielu nukleotydów połączonych ze sobą wiązaniami
fosfodiestrowymi.
O
O
P
O
O
Wiązanie
fosfodiestrowe
O
P
O
O
CH2
O
H H H
OH H
A
H
Nukleotyd
O
CH2
O
H H
H
H
H
Nukleotyd
C
Wiązania te powstają między atomem
węgla 3’ dezoksyrybozy jednego
nukleotydu i grupą fosforanową
sąsiedniego nukleotydu. W efekcie
powstaje łańcuch naprzemiennie
położonych grup fosforonawych i reszt
cukrowych i odstających od niego
zasad azotowych.
Cząsteczka DNA składa się z dwóch nici splecionych wokół siebie,
tworząc podwójną helisę. Jej kształt przypomina skręconą drabinę,
w której poręcze stanowią łańcuchy cukrowo-fosforanowe, a zasady
azotowe są jej szczeblami.
Wiązania wodorowe miedzy zasadami utrzymują obie nici razem
ze sobą.
C G
A T
C G
T A
T A
G C
Łańcuch cukrowofosforanowy
Komplementarne
zasady
Wiązania
wodorowe
Cytozyna tworzy zawsze parę z guaniną, z trzema wiązaniami
wodorowymi pomiędzy nimi, a adenina sparowana jest zawsze z
tyminą za pomocą dwóch wiązań wodorowych.
Ta reguła znana jest jako reguła komplementarności. Zgodnie z nią
dwie nici DNA są wzajemnie komplementarne.
Nici DNA przebiegają w przeciwnych kierunkach względem siebie,
czyli są antyrównoległe.
kierunek 5’ do 3’
O
OH
koniec 3’
G C
T A
C G
A T
C G
T A
O
O
koniec 3’
OH
O
O
P
P
O
koniec 5’ O
koniec 5’
O
kierunek 3’ do 5’
Jedna nić DNA może przebiegać w kierunku 5’ do 3’ lub 3’ do 5’. W
cząsteczce DNA jeśli kierunek jednej nici jest od 5’ do 3’ końca,
druga nić musi mieć kierunek od 3’ do 5’ końca.
Określenie kierunku dla danej nici ustalane jest na podstawie tego
co znajduje się na jej końcu. Koniec nici zawierający grupę
fosforanową określany jest jako koniec 5’, ponieważ grupa ta
przyłączona jest do węgla 5’ reszty cukrowej. Koniec zawierający
grupę OH jest 3’ końcem, gdyż grupa ta przyłączona jest do węgla 3’
reszty cukrowej.
koniec 3’
Komplementarne
zasady
G
O
O
O
O
P
O
CH2
O
H H
H
A
O
koniec 3’
H
CH2
O
H H
H
H
OH H
H
O
O
T
P
O
T
O
P
H
O
Nukleotyd
O
H
O
H
Wiązanie fosfodiestrowe
A
CH
2
O
H H H
O
CH2
O
H H H
H
O
O
P
P
O
O
O
C
CH2
O
H H
H
H
H
O
CH
2
O
H H
H
H
OH H
Przegląd struktury DNA:
Łańcuch cukrowo-fosforanowy
Wiązania fosfodiestrowe
Zasady azotowe
koniec 5’
Nukleotyd
O
Wiązania wodorowe
O P O
Komplementacja
O
Koniec 5’
Koniec 3’
koniec 5’
Wiązania wodorowe
Termin gen odnosi się do odcinka DNA lub sekwencji nukleotydów,
która koduje jakiś funkcjonalny produkt białkowy. Termin
chromosom odnosi się do długiego łańcucha genów i związanych
z nim białek.
DNA
Chromosom bakteryjny
Gen = odcinek DNA kodujący
jakiś funkcjonalny produkt
Chromosom = łańcuch genów i białek
Plazmidy
Bakterie posiadają zazwyczaj pojedynczy kolisty chromosom
związany w jednym lub wielu miejscach z błoną plazmatyczną.
Jest on zbudowany z jednej cząsteczki kolistego DNA oraz białek.
Chromosom jest zwinięty i ściśle upakowany w komórce tak, że
zajmuje on zaledwie najwyżej 10% całkowitej objętości komórki.
Poza chromosomem bakterie mogą dodatkowo zawierać jeden
lub więcej plazmidów.
Część II
Replikacja
DNA u bakterii
Proces reprodukcji u bakterii ma charakter binarny.
Oznacza to, że jedna komórka dzieli się dając dwie identyczne
komórki potomne.
Większość informacji genetycznej u bakterii zawarta jest w
pojedynczym kolistym chromosomie zbudowanym z DNA i białek.
Ta informacja musi być rozdzielona równomiernie między dwie
komórki potomne.
Jest to możliwe ponieważ DNA jest cząsteczką zdolną do
samopowielania i może utworzyć dokładne kopie siebie przed
podziałem komórki.
Każda z takich dwóch kopii przekazywana jest do każdej z dwóch
komórek potomnych.
Struktura DNA odgrywa ważną rolę w procesie replikacji.
Jego dwie ważne cechy, o których należy pamiętać, to:
C G
A T
5’ do 3’
C G
3’ do 5’
•Komplementarność
Dwie nici DNA są wzajemnie komplementarne .
Adenina (A) zawsze sparowana jest przez
tyminę (T), a naprzeciwko guaniny (G) jest
zawsze cytozyna (C). Dwie nici DNA połączone
są ze sobą za pomocą wiązań wodorowych
utworzonych między komplementarnymi
zasadami azotowymi.
Komplementarne zasady
T A
T A
G C
Wiązania wodorowe
•Antyrównoległość
Dwie nici DNA są ukierunkowane antyrównolegle względem siebie.
Podczas gdy jedna ukierunkowana jest od końca 5’ do 3’, druga
przebiega w kierunku 3’ do 5’.
Proces replikacji rozpoczyna się w chromosomie bakteryjnym
w miejscu występowania specyficznej sekwencji nukleotydowej,
określanej jako origin. Enzymy zwane helikazami rozpoznają tę
sekwencję i wiążą się z tym miejscem.
Origin
A
C G
A
C
T
G
Widełki replikacyjne
T
G
C
T
G
A
C
Chromosom bakteryjny
Helikazy rozplatają dwie nici DNA poprzez rozerwanie wiązań
wodorowych, które je spinają. Miejsce, w którym nici DNA są
rozplatane i zasady azotowe stają się dostępne, zwane jest
widełkami replikacyjnymi. Białka stabilizujące taką jednoniciową
postać DNA wiążą się do każdej z rozdzielonych nici zapobiegając
ich ponownemu spontanicznemu spleceniu.
Wolne trójfosforany nukleozydów występujące w cytoplazmie
komplementarnie przyłączają się do odpowiadających im zasad
wchodzących w skład pojedynczej nici macierzystej.
A
C
A
C
3’
P
T
G
C
T
G
A
C
P P
T
G
G
Wiązanie
fosfodiestrowe
P
G
G
P
A C
A
T
T
P
5’
C
3’
5’
Trójfosforan nukleozydu różni się od nukleotydu tylko tym, że posiada
trzy grupy fosforanowe zamiast jednej. To czyni go bardzo reaktywną
cząsteczką z powodu dużego nagromadzenia ładunków ujemnych. Kiedy
dopasuje się we właściwy sposób do komplementarnej zasady, zostaje
wbudowany do nowo tworzonej nici przez enzym zwany polimerazą DNA.
Ten enzym katalizuje hydrolizę dwóch reszt fosforanowych podczas
dodawania nukleotydu do nowej nici, tworząc jednocześnie wiązanie
fosfodiestrowe.
Polimeraza DNA posiada dwie istotne cechy charakterystyczne:
1. Sama nie może inicjować syntezy nowej nici DNA. Enzym ten
może jedynie dodawać kolejny nukleotyd do końca 3’ już istniejącej
nici. A zatem nie jest w stanie połączyć dwóch pierwszych
trójfosforanów nukleozydowych rozpoczynających syntezę nowej
nici.
P
P
P
P
P
Ligaza
DNA
RNA Primer
C
P
A
3’
5’
T
G
C
T
G
A
C
A
C
G
A
C
T
G
Nić macierzysta
5’
3’
Aby rozpocząć syntezę polimeraza DNA dodaje pierwszy
nukleozyd do tzw. primera. Jest to krótki fragment RNA powstały
przy udziale enzymu primazy. Primer RNA stanowi łańcuch kilku
nukleotydów komplementarnych do nici macierzystej. Polimeraza
DNA może wówczas przyłączyć trójfosforan nukleozydu do końca
3’ primera. W dalszym etapie primer zostanie zastąpiony przez
analogiczny odcinek DNA, połączony z resztą replikowanej nici
przez enzym ligazę DNA.
2. Drugą szczególną cechą jest to, że polimeraza DNA może
syntetyzować nową nić tylko w kierunku od 5’ do 3’ końca.
Oznacza to, że kolejne nukleotydy mogą być przyłączone jedynie
do wolnego końca 3’. Ma to istotne następstwa w procesie
replikacji na dwóch antyrównoległych niciach (skierowanych w
przeciwnych kierunkach).
Należy pamiętać, że syntetyzowana nić musi być skierowana
antyrównolegle do matrycowej nici macierzystej. Przebieg syntezy
zachodzi łatwo jeśli macierzysta nić ukierunkowana jest od końca
3’ do 5’, gdyż wtedy synteza biegnie w kierunku 5’ do 3’. W tym
przypadku polimeraza DNA może w sposób nieprzerwany dołączać
kolejne trójfosforany nukleozydów. Taka nić, syntetyzowana od
końca 5’ do 3’ określana jest jako nić wiodąca (leading strand).
3’
5’ tylko od 5’ do 3’
Nić wiodąca
3’
Nić macierzysta 5’
RNA Primer
ligaza
DNA
T
G
C
T
G
A
C
A
C
G
A
C
T
G
5’
3’
Problem pojawia się przy macierzystej nici ukierunkowanej od 5’
do 3’ końca, gdyż nowa, komplementarna do niej nić musi
przebiegać w kierunku od 3’ do 5’ końca. Polimeraza DNA nie może
przyłączać trójfosforanów nukleozydów w tym kierunku. Musi
zatem działać w kierunku przeciwnym do kierunku rozwidlenia nici
macierzystych.
5’
C G
A
A
C
T
G
T
G
3’
5’ Nić wiodąca
3’
5’
T
3’
G
C
A
C
3’ Nić opóźniona
5’
Ta replikowana nić nazywana jest nicią opóźnioną (lagging
strand), ponieważ jest syntetyzowana w sposób nieciągły w
kierunku przeciwnym do kierunku rozwijania się widełek
replikacyjnych.
Spójrzmy jak przebiega synteza nici opóźnionej.
Na wstępie primaza syntetyzuje krótkie primery RNA,
komplementarne do fragmentów macierzystej nici 5’-3’. Następnie
polimeraza DNA wydłuża odcinki primerów przez dołączanie
wolnych trójfosforanów nukleozydów w powstającej nici, w
kierunku od końca 5’ do 3’. Kompleks złożony z primeru RNA i
dołączonych do niego dezoksyrybonukleotydów nazywany jest
fragmentem Okazaki (od nazwiska ich odkrywcy).
Fragment Okazaki
ligaza DNA
Nić opóźniona
Nić macierzysta
5’
3’
G
C
A
T
C
G
A
C
T
G
C
G
T
A
G
C
T
G
A
C
3’
5’
Primer zostaje strawiony przez polimerazę DNA i zastąpiony
analogicznym odcinkiem DNA. Wszystkie fragmenty Okazaki są
następnie połączone przez ligazę DNA.
W efekcie powstaje kompletna nowa nić biegnąca w kierunku 3’-5’.
Każda z replikowanych nici splata się z nicią macierzystą, tworząc
z nią podwójną helisę. W ten sposób każda nowa cząsteczka DNA
zawiera jedną nić macierzystą i jedną świeżo zsyntetyzowaną.
Dlatego ten proces nazywany jest replikacją semikonserwatywną.
Replikacja semikonserwatywna
Chromosom bakteryjny ma kolisty kształt. Proces replikacji
rozpoczyna się w miejscu zwanym origin. Lecz zamiast syntezy w
jednym kierunku wokół całego chromosomu, proces ten zachodzi
jednocześnie w obu kierunkach. Określa się to jako replikację
dwukierunkową, gdyż w istocie generowane są dwa widełki
replikacyjne przesuwające się w przeciwnych kierunkach od miejsca
origin. Widełki te spotykają się w końcu, każdy po przejściu przez
swoją część chromosomu. Proces replikacji kończy się kiedy dwa
identyczne chromosomy potomne się rozdzielą.
Na chromosomie bakteryjnym może zostać zainicjowanych wiele
widełek replikacyjnych co znacznie skraca czas całego procesu
replikacji.
Dziękuję za uwagę