Sekwencjonowanie - 7 - marta.jarosinska

Sekwencjonowanie.doc
(41 KB) Pobierz
Sekwencjonowanie DNA
Sekwencjonowanie jest techniką umożliwiającą określenie kolejności nukleotydów w
analizowanym fragmencie DNA. Przełom nad pracami przyniósł rok 1977, w którym opublikowano
dwie metody:

chemicznej degradacji DNA znanej jako metoda Maxama i Gilberta

kontrolowanej terminacji replikacji (zwana również metodą dideoksy) Sangera i Coulsona
Metoda opracowana przez Maxama i Gilberta, polega na degradacji wyznakowanych na końcu 5’
cząsteczek DNA odczynnikami atakującymi specyficznie wiązania fosfodiestrowe za nukleotydem
odpowiadającym odpowiedniej zasadzie azotowej. Warunki reakcji są tak ustalone, że w
poszczególnych cząsteczkach zostaje przecięte tylko jedno lub dwa wiązania, przez co otrzymuje się
zbiór fragmentów DNA o różnej długości. Równolegle w czterech reakcjach prowadzi się
modyfikacje dla każdej próbki: G, A + G, T + C i C. Stosuje się tutaj reakcje A + G, T + C, ponieważ
uzyskanie specyficznej degradacji w pozycji A i T jest bardzo trudne. Uzyskane fragmenty
rozdzielane są w żelach poliakrylamidowych i poddawane autoradiografii. Na autoradiogramie
widoczne są tylko prążki, odpowiadające fragmentom zaczynającym się od wyznakowanego końca
5’ ułożone w postaci drabinki, której każdy kolejny szczebel odpowiada fragmentom różniącym się
od otaczających go o jeden nukleotyd.
Drugą, częściej obecnie stosowaną metodę sekwencjonowania DNA opracował zspół F. Sangera.
Metoda ta polega na analizie produktów syntezy in vitro DNA na jednoniciowej matrycy, począwszy
od przygotowanego oligonukleotydowego startera, komplementarnego do końca 3’ matrycy.
Równolegle stosuje się cztery różne mieszaniny reakcyjne, przy czym każda zawiera tylko jeden z
czterech 2’,3’-dideoksynukleotydów. Gdy 2’,3’-dideoksynukleotyd zostanie wbudowany w
cząsteczkę DNA (w miejsce odpowiedniego nukleotydu) następuje terminacja syntezy w pozycji, w
której został włączony do rosnącej nici. Cztery zbiory fragmenów o zakończonym łańcuchu poddaje
się następnie elektroforezie i odczytuje sekwencję zasad DNA z czterech ścieżek na autoradiogramie.
Alternatywą autoradiografii jest metoda polegająca na znakowaniu DNA znacznikami
fluorescencyjnymi. Do oligonukleotydu pełniącego rolę startera zostaje przyłączony znacznik
fluorescencyjny o innej barwie dla każdej z czterech reakcji terminacji. Mieszaniny reakcyjne zostają
następnie połączone i wspólnie poddane elektroforezie. Na podstawie komputerowego odczytu z żelu
generuje się kolorowy obraz, gdzie każdy kolor odpowiada konkretnej zasadzie. Następnie
intensywności są przekładane na piki, reprezentujące sekwencję.
Obecnie metoda Sangera i jej różne modyfikacje jest stosowana najczęściej, ze względu na możliwość
automatyzacji jak i mniejszej toksyczności odczynników tu stosowanych.
Zautomatyzowane metody odczytu sekwencji pozwoliło na szybki postęp w dziedzinie
sekwencjonowania całych genomów. W 1995 poznano pierwsze genomy bakterii (Haemophilus
influenzae i Mycoplasma genitalium), w 1997 genom pierwszego eukarionta - drożdży piekarskich
(Saccharomyces cerevisiae), w 1998 genom pierwszego organizmu wielokomórkowego nicienia
Caenorhabditis elegans, w 2000 genom muszki owocowej (Drosophila melanogaster). W lutym 2001
niezależnie Human Genome Project i Celera Genomics opublikowali sekwencję ok. 3 miliardów
nukleotydów genomu ludzkiego (tj. ok. 90% genomu ludzkiego). W roku 2003 opublikowano
dokument stwierdzający zakończenie sekwencjonowania 99% genomu ludzkiego.
Przebieg ćwiczenia:
Odczytywanie sekwencji z autoradiogramu.
Zagadnienia do przygotowania
Etapy reakcji sekwencjonowania.
Modyfikacje nukleotydów stosowane w metodzie Maxama i Gilberta.
Modyfikacje klasycznych metod sekwencjonowania oraz alternatywne techniki.
Znaczniki fluorescencyjne oraz pierwiastki radioaktywne najczęściej stosowane w znakowaniu
starterów lub dNTPs.
Na czy polega strategia „shotgun sequencing”(sekwencjonowanie losowe).
Korzyści wynikające z poznania ludzkiego genomu.
Sposoby uzyskania jednoniciowego DNA w przypadku sekwencjonowania metodą terminacji
łańcucha.
Wektory służące do klonowania dużych fragmentów DNA (pochodne bakteriofaga P1, BAC, PAC,
fosmidy).
Literatura
Brown T. A. Genomy. Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa 2003
Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc
Natl Acad Sci U S A, 74(12): 5463–5467.
International Human Genome Sequencing Consortium (2001) Nature 409, 860-921.
Venter J. C., Adams M. D., Myers E. W., Li P. W., Mural R. J., Sutton G. G., Smith H. O., Yandell
M., Evans C. A., Holt R. A., et al. (2001) Science 291, 1304-1351.
L. Stryer Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa 2003
Praca zbiorowa pod redakcją Piotra Węgleńskiego Genetyka molekularna. Wydawnictwo Naukowe
PWN Warszawa 2000
Dlaczego badania nad ludzkim genomem są tak ważne? PERSPEKTYWY
WYKORZYSTANIA
1.Rozwój bioinformatyki- dział informatyki zajmujący się badaniem DNA
2. Opracowanie mikromacierzy. Płytka szklana lub plastikowa z naniesionymi w regularnych
pozycjach mikroskopowej wielkości polami, zawierającymi różniące się od siebie sekwencją
fragmenty DNA. Fragmenty te są sondami, które wykrywają przez hybrydyzację komplementarne do
siebie cząsteczki DNA lub RNA.
Różnego typu mikromacierze mają wiele zastosowań, z których najczęstsze to badanie ekspresji
genów. Dzięki miniaturyzacji możliwe jest jednoczesne badanie wielu genów w próbce. Na
powierzchni kilku cm2, w mikrometrowych odstępach, umieszczone są sondy pozwalające badać
ekspresję nawet kilkudziesięciu tysięcy sekwencji jednocześnie.
Podobny format (bardzo wiele różnych odczynników testujących na niewielkiej powierzchni) do
mikromacierzy DNA mają inne mikromacierze stosowane w badaniach biologicznych, medycznych
i chemicznych (mikromacierze tkankowe, białkowe, przeciwciał, związków chemicznych).
Mikromacierze mogą być stosowane w diagnostyce medycznej.
3. Rozwój biologii ewolucyjnej- możliwość porównywania genomu ludzkiego z genomami innych
organizmów.
4. Rozpoznanie jakie geny są odpowiedzialne za powstawanie, powiązanie i utrzymanie systemu
nerwowego- leczenie chorób neurologicznych.
5. Leczenie nowotworów.
Nowotwory są najczęściej spowodowane akumulacją kilku mutacji genowych, które aktywują
onkogeny. Zidentyfikowanie do tej pory ponad 100 onkogenów obrazuje zmiany powodujące rozwój
nowotworu. Niektóre nowotwory, choć wizualnie podobne mają inny rozkład ekspresji genówpoznanie ułatwia wybranie terapii.
6. Wprowadzenie metody „fingerprinting”. Metodę stosuje się w diagnostyce chorób dziedzicznych
(np. hemofilii, anemii sierpowatej, choroby Alzheimera, choroby Huntingtona), w kryminalistyce do
identyfikacji przestępców na podstawie pozostawionych przez nich śladów biologicznych. Pobrane z
komórek DNA izoluje się, następnie trawi odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, które tną DNA
w specyficznych miejscach. Pocięte fragmenty DNA sortuje i rozdziela się elektroforetecznie.
Rozdzielone fragmenty DNA przenosi się na filtr nitrocelulozowy i hybrydyzuje się z radioaktywnymi
sondami, następnie fotografuje. Uzyskany obraz jest charakterystyczny dla danego osobnika.
7. Rozwój badań nad uzależnieniami od narkotyków- kokaina wpływa na transportery dopaminy,
które różnią się u różnych ludzi.
ZNAKOWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH
W pracach biologii molekularnej często zachodzi konieczność używania znakowanych cząsteczek
kwasów nukleinowych, czyli takich, które zawierają wbudowany radioaktywny izotop lub znacznik
nieradioaktywny, np. biotynę. Znakowany DNA lub RNA wykorzystywany jest w takich technikach
jak: testy hybrydyzacj, primer extension, foot-printing, EMSA, RNA protection, sekwencjonowanie
i wiele innych.
1. Najczęściej wykorzystywanymi znacznikami kwasów nukleinowych są radioaktywne izotopy
32
P i 35S, 3H oraz związki nieradioaktywne, takie jak: biotyna, digoxigenina, fluoresceina,
rodamina, kumaryna. Wybór znacznika zależy głównie od czułości i rozdzielczości testu, do
którego zostanie użyty znakowany DNA a także od trwałości znacznika i bezpieczeństwa
pracy.
a. Czułość oznacza najmniejszą ilość kwasu nukleinowego, jaką można zidentyfikować z
wykorzystaniem danego znacznika. Najczulszym ze stosowanych obecnie znaczników jest izotop 32P,
który umożliwia detekcję nawet 10fg DNA. Mniejszą czułość reakcji można natomiast uzyskać
wykorzystując izotop 35S. Parametry pośrednie wykazuje natomiast izotop 33P.
b. Rozdzielczość oznacza najmniejszą odległość pomiędzy dwoma sygnałami, jaką można uzyskać
dla danego znacznika. Izotopy radioaktywne o wysokiej aktywności promieniowania (wysoka czułość
detekcji), np. 32P, charakteryzują się niższą rozdzielczością niż izotopy o mniejszej aktywności, np.35S.
Najwyższą rozdzielczość uzyskuje się jednak przy wykorzystaniu technik znakowania
nieradioaktywnego, które pozwalają na lokalizację kw. nukleinowych in situ – w preparatach
mikroskopowych.
c. Trwałość znacznika. Izotopy radioaktywne, ze względu na okres półrozpadu, charakteryzują się
ograniczonym okresem trwania, np. 32P-14 dni, 33P-25 dni, 32S-87 dni. Zestawy do znakowania
nieradioaktywnego, nie ulegają tak szybkiemu starzeniu i mogą być przechowywane przez długi okres
czasu.
d. Bezpieczeństwo pracy. Izotopy radioaktywne emitują różne typy promieniowania, tj. α, β, γ.
Izotopy ww. emitują promieniowanie β, które może być potencjalnie niebezpieczne dla zdrowia.
Ulegają one jednak stosunkowo łatwo ekranowaniu przez takie materiały jak ołów
( służy do
przechowywania prób) czy pleksi (ekrany ochronne), praca z nimi jest bezpieczna przy zachowaniu
odpowiednich środków ostrożności. Znaczniki nieradioaktywne nie są szkodliwe dla zdrowia.
e. Nukleotydy zawierające znaczniki. Większość technik znakowania wykonuje się syntetyzując nową
nić DNA na wybranej matrycy, z wykorzystaniem nukleotydów dNTP, zawierających określony
znacznik. Ponieważ podczas wbudowywania nukleotydów do DNA następuje odłączenie reszt
fosforanowych z pozycji α, β, γ, do znakowania radioaktywnego stosuje się izotopy obecne w pozycji
αdNTP, np. α[32P], α[35S] . Znaczniki nieradioaktywne przyłączane są do C5 UTP.
2. Detekcja znaczników.
a. Znaczniki radioaktywne. Identyfikacja opiera się na detekcji promieniowania β.
Promieniowanie to można zlokalizować wykonując ekspozycję sygnału do na błonie
radiologicznej lub z wykorzystaniem specjalistycznego sprzętu-licznik scyntylacyjny.
b. Znaczniki nieradioaktywne. Obecność tych znaczników można zidentyfikować na podstawie
ich aktywności własnej (bezpośrednie) lub aktywności enzymów połączonych ze znacznikiem
(pośrednie)
- bezpośrednie. Związki wbudowane do DNA, takie jak rodamina, kumaryna, fluoresceina,
charakteryzują się zdolnością do emisji światła o określonej długości fali w świetle UV. Ich
detekcja odbywa się przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego.
-pośrednie. Oparte na technikach enzymatycznych. Znaczniki rozpoznawane są przez
specyficzne przeciwciała (ew. streptavidynę w przypadku biotyny) sprzężone z enzymami
takimi jak alkaliczna fosfataza, peroksydaza. Enzymy te po przyłączeniu się do znacznika
katalizują reakcje, które prowadzą do luminescencji lub powstania barwnych produktów.
Rodzaje promieniowania emitowane przez izotopy radioaktywne.
α- jądra helu
β- elektrony
γ- fotony (fale elektromagnetyczne)
Plik z chomika:
marta.jarosinska
Inne pliki z tego folderu:

 cw 7.pdf (66551 KB)
Sekwencjonowanie.doc (41 KB)
Inne foldery tego chomika:


Zgłoś jeśli naruszono regulamin





Strona główna
Aktualności
Kontakt
Dział Pomocy
Opinie


Regulamin serwisu
Polityka prywatności
Copyright © 2012 Chomikuj.pl
mmol
mutacje