cwiczenie_2

MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
HODOWLA DROBNOUSTROJÓW W WARUNKACH
LABORATORYJNYCH
POŻYWKI
Badanie i obserwacja drobnoustrojów w warunkach sztucznych, laboratoryjnych, jest
możliwa dzięki hodowli mikroorganizmów na pożywkach, zwanych inaczej podłożami.
Wzrost i rozwój drobnoustrojów na pożywkach pozwala na wyosobnienie czystych
kultur, na prowadzenie badań morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych,
diagnostycznych oraz wszelkiego rodzaju hodowli doświadczalnych.
Pożywka jest mieszaniną roztworów odpowiednio dobranych składników
Pożywka powinna spełniać następujące warunki:
 zapewnić odpowiednią ilość przyswajalnych składników pokarmowych, zarówno
organicznych, jak i nieorganicznych (energetycznych i budulcowych),
 zawierać określone czynniki wzrostowe,
 mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne,
 zapewniać optymalny dla rozwoju dostęp do tlenu,
 wykazywać właściwą temperaturę i pH.
Nie ma uniwersalnej pożywki dla wszystkich drobnoustrojów
Podłoża dla autotrofów są nieskomplikowane, zawierają tylko związki mineralne.
Heterotrofy mają już większe wymagania, które można zaspokoić dodając kompleksowe
substancje np. ekstrakt mięsny, pepton, ekstrakt drożdżowy, brzeczkę.
Obecnie na rynku dostępne są gotowe podłoża i składniki do pożywek, w formie odwodnionej
lub proszku o wystandaryzowanym składzie (np. firmy BBL, Difco, Oxoid) – zapewnia to
powtarzalność warunków hodowli, a co za tym idzie pozwala na porównywanie wyników
doświadczeń prowadzonych w różnym czasie lub różnych laboratoriach. Ponadto znacznie
skraca czas przygotowania do doświadczeń. Własnoręczne komponowanie pożywek
wymaga stosowania składników i związków chemicznych o najwyższym stopniu czystości.
Czysta kultura – kultura drobnoustrojów wyprowadzona z 1 komórki (monokultura).
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
1
MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
SKŁADNIKI POŻYWEK DLA HETEROTROFÓW
1. Substancje odżywcze
Źródło węgla
Najłatwiej przyswajalnym źródłem węgla i energii dla drobnoustrojów są cukry (gł. glukoza,
laktoza, maltoza, skrobia, celuloza). Dodatek cukru do pożywki może służyć celom
diagnostycznym lub wybiórczym, gdyż dany gatunek mikroorganizmów wykorzystuje
określony rodzaj cukru. Zawartość cukru w pożywce waha się w ilości 0,5 do 2%.
Oprócz cukrów drobnoustroje mogą też wykorzystywać glicerol i mannitol oraz niektóre
kwasy organiczne.
Źródło azotu
Większość drobnoustrojów wykorzystuje azot z połączeń nieorganicznych (sole amonowe,
wodorotlenek amonu, azotany). Jon amonowy stanowi podstawowy związek w przemianach
azotowych. Niektóre drobnoustroje mogą pobierać wolny azot atmosferyczny. Poza tym,
drobnoustroje czerpią azot również ze związków organicznych, niekiedy bardzo
skomplikowanych. Należy tu wymienić przede wszystkim ekstrakty (wyciągi) z tkanek
roślinnych i zwierzęcych oraz różnego typu hydrolizaty białek zwierzęcych i roślinnych.
Wszystkie te składniki są dostępne już jako preparaty handlowe, w postaci proszków lub past.
Dodatek związków białkowych do pożywek wynosi 0,5-2%.
Do źródeł azotu organicznego zaliczamy:
 ekstrakty mięsne – wodne wyciągi z tkanki mięsnej, ale także ekstrakty z serc
i wątroby; zawierają one substancje azotowe oraz węglowodany i witaminy
rozpuszczalne w wodzie;
 ekstrakty drożdżowe – obok związków azotu i węgla organicznego są bogatym
źródłem witamin z grupy B;
 peptony – to specyficzne produkty częściowej, enzymatycznej hydrolizy białka, są
bardzo częstym źródłem azotu organicznego w pożywce; zawierają liczne wolne
aminokwasy i krótkie łańcuchy peptydowe, pewne witaminy, czasami węglowodany;
 hydrolizaty enzymatyczne lub kwasowe białek mięsa, kazeiny, jaj, nasion soi –
bogate źródło aminokwasów, jedno z najczęściej wykorzystywanych źródeł azotu
organicznego w pożywce;
 czyste białka (żelatyna, kazeina) oraz białka rodzime (np. białka jaja, surowicy krwi)
– opcjonalne źródło azotu wykorzystywane przez bakterie proteolityczne;
 wolne aminokwasy – czasami dodawane do podłoża.
Czynniki wzrostowe
Wprowadza się je do podłoża w postaci roztworów syntetycznych witamin (kosztowne) lub w
formie wspomnianych wyżej wyciągów mięsnego, wątrobowego i drożdżowego, a także
wyciągów roślinnych (sok pomidorowy, brzeczka słodowa, ekstrakt glebowy lub
ziemniaczany).
Sole mineralne
Dodawane do pożywek w niewielkich ilościach, są źródłem składników nieorganicznych:
fosforu, siarki, potasu, sodu, magnezu, manganu, żelaza i in. Drobnoustroje pobierają je w
postaci odpowiednich soli, najczęściej KH2PO4, K2HPO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaCl,
siarczanów i chlorków żelaza, magnezu. Niektóre z tych soli regulują ciśnienie osmotyczne,
np. NaCl, dodawane w ilościach 3-5 g/l pożywki. Inne, np. fosforany potasu, działają
buforująco i utrzymują właściwy odczyn pożywki.
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
2
MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
Związki korygujące pH
Większość bakterii rośnie w pH obojętnym lub lekko alkalicznym (6,8-7,4). Grzyby preferują
środowisko lekko kwaśne (pH 5-6,0). Korektę pH pożywek przeprowadza się najczęściej za
pomocą 1-5 M roztworów NaOH i HCl.
Substancje różnicujące i wybiórcze
Wprowadzone do podłoża czynniki różnicujące ulegają pod wpływem mikroorganizmów
modyfikacji lub rozkładowi, co uwidacznia się zmianą barwy kolonii lub podłoża, lub
powstaniem strefy przejaśnienia.
Czynniki wybiórcze (sole kwasów żółciowych, niektóre barwniki np. zieleń brylantowa,
fiolet krystaliczny, związki chemiczne np. azydek sodu) hamują rozwój pewnych grup
bakterii umożliwiając rozwój tylko określonej grupie drobnoustrojów.
2. Czynniki zestalające
Pozwalają one na uzyskanie pożywek w formie stałej.
Agar-agar
Jest to, dostępny handlowo w formie proszku lub włókien, wielocukier otrzymywany z
glonów morskich. Odznacza się właściwościami żelującymi, silnie chłonie wodę i w
zależności od stopnia oczyszczenia upłynnia się w temperaturze 90-100ºC, a zestala w 4548ºC. Chemicznie agar jest polisacharydem – galaktonem (zawiera m.in. galaktozę), który nie
jest wykorzystywany przez drobnoustroje jako składnik odżywczy, a tylko przez niektóre
drobnoustroje może być rozkładany. W celu zestalenia podłoża wystarczy 1,5-3% agaru.
Żelatyna
Jest to substancja białkowa, z odpadów rzeźnych, która powstaje w wyniku hydrolizy
kolagenu, może być zużywana przez drobnoustroje zawierające enzymy proteolityczne,
następuje wówczas upłynnienie pożywki (nie należy przechowywać płytek z takimi
hodowlami do góry dnem). Żelatyna upłynnia się w temperaturze 25-27ºC (co pozwala na
hodowlę w znacznie węższym przedziale temperatur niż agar), a zestala w 18-20ºC, przy
czym ogrzewana kilkukrotnie do 100ºC traci własności żelujące. Jako czynnik zestalający
pożywkę dodaje się w ilości 12-15%.
Inne czynniki zestalające są stosowane rzadko, należą tu m.in. żel krzemionkowy (do
pożywek mineralnych dla autotrofów), jaja i surowica krwi (w badaniach specjalnych).
RODZAJE POŻYWEK
Kryteria podziału pożywek:
A) skład chemiczny i pochodzenie składników,
B) zawartość składników,
C) cel hodowli (zastosowanie i funkcja podłoża),
D) konsystencja.
1. Podział w zależności od składu podłoża
Naturalne – przygotowane wprost z surowca roślinnego lub zwierzęcego, w sposób
zapewniający jego jałowość, np. mleko, serwatka, mięso, bulion, brzeczka, owoce i warzywa
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
3
MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
itp. Do tej grupy zalicza się także podłoża przygotowane z wyciągów naturalnych, w których
surowiec zatracił już swoje cechy zewnętrzne (wyciągi i ekstrakty, stanowiące podstawę
przygotowania podłoża, np. bulion zwykły, brzeczka słodowa).
Syntetyczne – wykonane z dokładnie określonych związków chemicznych, o znanym
składzie jakościowym i ilościowym. Należą tu podłoża mineralne dla autotrofów.
Półsyntetyczne – to podłoża syntetyczne z dodatkiem wyciągów z tkanek roślinnych lub
zwierzęcych, np. mleko z lakmusem, agar ziemniaczany z tiaminą.
2. Ze względu na zawartość składników rozróżnia się podłoża
Podstawowe (zwykłe) – stanowią bazę do przygotowania innych pożywek, np. bulion
zwykły, brzeczka.
Wzbogacone – to podłoża podstawowe wzbogacone dodatkowymi składnikami odżywczymi
np. bulion odżywczy, bulion tryptofanowy, agar z krwią itp. Podłoża wzbogacone
umożliwiają wzrost większości drobnoustrojów.
3. Ze względu na zastosowanie wyróżniamy podłoża
Ogólne – stwarzają warunki do wzrostu większości drobnoustrojów, najczęściej są to podłoża
na wyciągach naturalnych, np. bulion odżywczy dla bakterii czy brzeczka słodowa dla
grzybów.
Wybiórcze – umożliwiają wzrost określonych grup, podczas gdy wzrost niepożądanych
drobnoustrojów zostaje zahamowany na stałe lub częściej okresowo. Przygotowuje się je
dodając do pożywki składnik eliminujący daną grupę drobnoustrojów lub usuwając z podłoża
składnik odżywczy niezbędny do wzrostu niepożądanej grupy drobnoustrojów.
4. Biorąc pod uwagę funkcję, jaką ma pełnić pożywka wyróżnia się:
- namnażające lub namnażająco-wybiórcze – stosujemy wówczas, gdy liczba
drobnoustrojów w badanej próbie jest niewielka lub poszukiwany drobnoustrój
występuje z inną mikroflorą towarzyszącą. Są to zwykle podłoża płynne, np.
zbuforowana woda peptonowa dla pałeczek Salmonella, pożywka KessleraSwenartona dla pałeczek z grupy coli,
- selektywne – zawierają składniki wybiórcze (oprócz składników odżywczych),
hamujące wzrost drobnoustrojów przeszkadzających bez wpływu na pożądane,
- różnicujące – zawierają składniki wpływające na rodzaj wzrostu lub wywołują taką
zmianę, która pozwala na zróżnicowanie pomiędzy poszczególnymi grupami (typami)
bakterii, często pełnią rolę podłóż wybiórczych i wzbogaconych. Są to podłoża stałe,
np. agar z krwią, agar SS, Endo,
- testowe – służą do oznaczania witamin, aminokwasów i antybiotyków przy pomocy
mikroorganizmów; zwykle mają bardzo złożony i specyficzny skład, a testowany
czynnik nie występuje w podłożu co jest podstawą oznaczenia,
- do oznaczania ilości bakterii, np. w mleku lub w wodzie,
- identyfikacyjne (diagnostyczne) – na nie przesiewa się kolonie drobnoustrojów z
poprzednich podłoży, umożliwiają identyfikację wyizolowanych szczepów w
zależności od potrzeb gatunku, rodzaju czy określonej grupy, na podstawie
określonych reakcji biochemicznych zachodzących pod wpływem danego
mikroorganizmu. Na przykład I szereg identyfikacyjny dla drobnoustrojów z rodzaju
Salmonella jest następujący:
a) woda peptonowa z tryptofanem
b) podłoże z mocznikiem
c) podłoże Kliglera
d) podłoże z 10% laktozą.
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
4
MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
5. Podłoża pod względem konsystencji dzielimy na:
- płynne – powinny być klarowne, a więc składniki muszą być całkowicie rozpuszczone, np.
brzeczka, bulion płynny,
- półpłynne – z dodatkiem 0,1-0,8% agaru,
- stałe – zestalone za pomocą agaru lub żelatyny na płytce Petriego w postaci jednolitej,
przejrzystej, gładkiej warstwy bądź też w probówce w postaci słupka lub skosu.
Przygotowanie skosu agarowego
Sposób wylewania pożywki na płytkę Petriego
6. Przykłady pożywek stosowanych w mikrobiologii
Pożywki ogólnego zastosowania:
 bulion zwykły i odżywczy,
 bulion z agarem,
 brzeczka słodowa,
 agar zwykły i odżywczy,
 żelatyna.
Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli bakterii:
 podłoża dla beztlenowców (podłoże Wrzoska, Wilsona-Blaira),
 podłoża dla pałeczek z grupy coli (z żółcią i zielenią brylantową, KessleraSwenartona, Endo),
 podłoże do wykrywania enterokoków (z azydkiem sodu),
 podłoże do wykrywania gronkowców (Chapmanna z mannitolem).
Pożywki wybiórcze stosowane do hodowli grzybów pleśniowych i drożdży:
 brzeczka agarowa,
 pożywka Czapka – Doxa,
 podłoże Wikena i Richardsa do izolacji drożdży.
PRZYGOTOWYWANIE POŻYWEK
 Znając skład jakościowy i ilościowy pożywki, dodaje się do wody destylowanej
poszczególne składniki zgodnie z podaną recepturą, następnie ogrzewa na gazie do
momentu uzyskania klarowności płynu i koryguje pH (jeżeli jest różne od
oczekiwanego).
 W zależności od rodzaju pożywki i wymaganych temperatur sterylizacji wyjaławia się
rozpuszczoną pożywkę w aparacie Kocha lub w autoklawie w określonym czasie. Po
sterylizacji i ostygnięciu pożywki należy również sprawdzić i ewentualnie skorygować
pH za pomocą roztworów NaOH lub HCl.
 Dodatek witamin (jeśli potrzebne) oraz przesączenie pożywki wykonuje się po jej
ostudzeniu.
 Ostudzoną (nie za bardzo!) pożywkę o odpowiednim składzie rozlewa się do naczyń
hodowlanych w zależności od potrzeb, do jakich ma służyć przygotowane podłoże. Jeżeli
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
5
MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
potrzebujemy podłoża stałe to możemy je rozlać na płytki Petriego lub do probówek,
gdzie zestala się je w formie skosu lub słupka (rozlewane podłoże nie może mieć
temperatury niższej od 45°C, gdyż nie będzie się równo zestalało). Pożywki płynne
rozlewa się do probówek lub kolbek.
POSIEWY
Posiew mikrobiologiczny jest to przeniesienie drobnoustrojów z hodowli lub badanego
materiału do jałowej pożywki
Zaszczepioną pożywkę umieszcza się w cieplarce, w określonych stałych warunkach
temperatury i natlenienia, zapewniających rozwój wprowadzonym drobnoustrojom.
Celem posiewu może być:
 odświeżenie hodowli drobnoustrojów (przesiewy szczepów muzealnych w celu
utrzymania ich żywotności i aktywności),
 izolacja czystych kultur z badanego materiału,
 diagnostyka wyizolowanych szczepów w celu określenia ich przynależności do
gatunku, rodzaju lub określonej grupy (posiewy diagnostyczne obejmują badania
morfologiczne, fizjologiczne, biochemiczne, prowadzone na różnych podłożach),
 stwierdzenie stanu mikrobiologicznego produktu (jałowości, jakości mikroflory),
 oznaczenie liczby drobnoustrojów w badanym materiale,
 przygotowanie inokulatów do prowadzenia hodowli w warunkach doświadczalnych
lub do celów przemysłowych.
Należy zachować warunki jałowości – posiew wykonywany z użyciem jałowego szkła,
sprzętu, pożywek i pomieszczeń (boks laminarny), przy zapalonym palniku gazowym,
opalając wyloty probówek i pipet w płomieniu, wyżarzając ezy i igły.
Posiewu drobnoustrojów wykonuje się ezą, igłą lub pipetą, niekiedy jałowymi tamponami z
waty, gazy, szklanymi głaszczkami.
W zależności od konsystencji materiału posiewanego i podłoża, które należy przeszczepić,
dobiera się odpowiedni sposób posiewu wg schematów:
z pożywki płynnej
na pożywkę płynną
na skos
na płytkę
z pożywki stałej (skos
lub płytka Petriego)
na pożywkę płynną
na skos
na płytkę
pipeta, eza
eza, pipeta
powierzchniowo (pipeta, eza),
wgłębnie (pipeta)
eza
eza
eza
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
6
MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
Przeszczepianie z pożywki płynnej
A)
B)
)
C)
)
D)
)
E)
)
A) wyżarzanie ezy
B) otwieranie
probówki
C) opalanie wylotu
probówki
D) pobieranie
hodowli
bakteryjnej ezą
E) ponowne
opalenie wylotu
probówki
F) zamykanie
probówki
F)
)
Uwaga: otwartą probówkę trzymamy jak najbardziej poziomo – aby zapobiec zakażeniom z
powietrza.
Igłę wkłuwamy w słupek zestalonego podłoża. Materiał na ezie wypłukujemy w pożywce
płynnej lub posiewamy na podłoże stałe (na skos ruchem zygzakowatym, na szalkę wg
schematu).
Sposób posiewu na słupek igłą
Posiew na skos agarowy
Posiewy powierzchniowe ezą
(posiew redukcyjny)
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
7
MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
W metodzie powierzchniowej (1) zawiesinę drobnoustrojów rozprowadzamy po
powierzchni wystudzonego podłoża głaszczką lub za pomocą ezy. Przeszczepianie na podłoże
stałe na płytce Petriego metodą wgłębną (zalewową) (2) polega na wylaniu pipetą (w sposób
jałowy) na dno płytki określonej ilości pobranego materiał, a dopiero potem odpowiedniego
podłoża (schłodzone do temperatury 45-50C). Zawartość miesza się poruszając płytkę
(zamkniętą) ruchem kolistym.
Posiewy z powierzchni (ze stołów, naczyń, powierzchni, opakowań) polegają na dokonaniu
wymazu (jałowym tamponem), a zebraną mikroflorę przenosi się na zestaloną pożywkę.
Można też drobnoustroje wypłukać w rozcieńczalniku i wykonać posiew bezpośredni z
zawiesiny lub rozcieńczeń.
Do sporządzania rozcieńczeń stosuje się płyn Ringera lub 0,85% roztwór NaCl (sól
fizjologiczna). Są to roztwory izotoniczne dla drobnoustrojów.
CHARAKTERYSTYKA WZROSTU MIKROORGANIZMÓW NA POŻYWKACH
Obserwacja wzrostu drobnoustrojów na pożywkach należy do ważnych informacji
diagnostycznych przy identyfikacji drobnoustrojów. W zależności od rodzaju podłoża w
diagnostyce uwzględnia się różne cechy.
Cechy diagnostyczne wzrostu mikroorganizmów na różnych podłożach











Bulion płynny
Występowanie błonki
Charakter błonki
Zmętnienie lub osad
Charakter zmętnienia
Stopień zmętnienia
Charakter osadu
Zapach
Skośny agar
Intensywność wzrostu
Charakter brzegu linii wzrostu
Konsystencja
Barwa











Płytka Petriego
Wymiary kolonii
Kształt kolonii
Brzeg kolonii
Powierzchnia kolonii
Konsystencja
Barwa kolonii lub podłoża
Wyniosłość - profil
Słupek żelatynowy
Powierzchniowy
Wzdłuż linii kłucia
W dolnej części słupka
Upłynnienie żelatyny
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
8
MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
Wzrost i charakterystyka drobnoustrojów w pożywkach płynnych
Charakter wzrostu na podłożu płynnym pozwala na określenie zapotrzebowania bakterii na
tlen.
 Bezwzględne tlenowce rosną na powierzchni pożywki w postaci pierścienia, błonki
lub kożucha utworzonych z komórek. W zależności od gatunku bakterii kożuch może
być biały, zabarwiony, suchy, sfałdowany, jednolity lub rozpadający się, kłaczkowaty,
wznoszący się po ściankach;
 Względne beztlenowce charakteryzuje wzrost dyfuzyjny, objawiający się jednolitym
zmętnieniem całej objętości pożywki;
 Bezwzględne beztlenowce rosną w postaci osadu na dnie probówki. Po wstrząśnięciu
osad unosi się w sposób pylisty, osiadający, kłaczkowaty lub ziarnisty;
 Mikroaerofile rozwijają się w postaci pierścienia w pewnym oddaleniu od
powierzchni pożywki.
Wymienione typy wzrostu na podłożach płynnych można obserwować w różnych
kombinacjach, np. zmętnienie i osad, zmętnienie i kożuszek.
Wzrost bakterii w hodowlach płynnych:
a) wzrost na powierzchni w postaci
(kożuszka),
b) wzrost dyfuzyjny,
c) częściowe zmętnienie i osad,
d) wzrost podpowierzchniowy.
pierścienia
Wzrost i charakterystyka mikroorganizmów na podłożach stałych
Ma zastosowanie w diagnostyce, przy otrzymywaniu czystych kultur oraz w analizach
ilościowych.
Charakterystyka wzrostu kolonii bakterii na płytce Petriego
Kolonia to skupisko bakterii widoczne gołym okiem, wyrosłe najczęściej z jednej
komórki. W standardowych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się
stałymi cechami, uwzględnianymi w diagnostyce. Obserwacje koloni przeprowadza się
przy pomocy lupy lub binokularu biorąc pod uwagę:
o wielkość ( w milimetrach)
o kształt koloni, np. okrągły, owalny, soczewkowaty (wrzecionowaty), nieregularny,
rozgałęziony (rizoidalny, jak mróz na szybie), nitkowaty (włóknisty, strzępiasty).
Niektóre bakterie mogą nie tworzyć pojedynczych kolonii, lecz zarastać całe podłoże,
dając wzrost mgławicowy (punkcikowaty) (np. Proteus), inne tworzą kolonie
rozpełzające się po powierzchni podłoża (Bacillus).
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
9
MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
o brzeg koloni: gładki, falisty regularny lub nieregularny, płatowaty regularny lub
nieregularny, ząbkowany regularny lub nieregularny, nitkowaty:
o powierzchnia koloni: gładka, pomarszczona, szorstka, skórzasta, pylista; może być
lśniąca (błyszcząca) lub matowa,
o barwa koloni i jej przejrzystość: przeźroczysta, mętna, opalizująca, nieprzeźroczysta
oraz zdolność do wytwarzania pigmentu zabarwiającego otoczenie koloni:
zabarwione, niezabarwione.
Na przykład Sarcina lutea i Pseudomonas herbicola – tworzą kolonie żółte,
Staphylococcus aureus – pomarańczowo-złote; Serratia marcescens – krwistoczerwone; Azotobacter – ciemno brązowe, Pseudomonas fluorescens – seledynowe
fluoryzujące. Ponadto wytwarzane przez pseudomonady barwniki dyfundują do
podłoża zmieniając kolor na zielonkawy, niebieskawy, fioletowy, niekiedy
fluoryzujący;
o konsystencja (struktura): zwarta, drobnoziarnista, gruboziarnista, luźna, mazista;
o profil koloni ponad powierzchnię pożywki: płaski; wyniosły (wypukły);
pęcherzykowaty niski, pęcherzykowaty wysoki (soczewkowaty); pępkowaty
(brodawkowaty), kraterowaty.
Z praktycznego punktu widzenia rozróżnia się następujące typy kolonii powierzchniowych:
• „S” (smooth – gładki) – o gładkim brzegu, powierzchni wypukłej bez wzniesień i
wgłębień. Jest to cecha charakterystyczna dla kolonii młodych i prowadzonych na agarze
odżywczym, a także zjadliwych form bakterii chorobotwórczych,
• „R” (rought – szorstki) – o brzegu nierównym, płatowatym lub nitkowatym i
szorstkiej powierzchni. Bakterie tworzące takie kolonie układają się w długie nici lub
łańcuszki. Kolonie takie tworzą niezjadliwe formy bakterii, chociaż te same bakterie
wytwarzające kolonie gładkie, są chorobotwórcze,
• „G” (gonidial – gonidialny) – kolonie bardzo drobne o średnicy 1 mm tworzone
przez drobne bakterie,
• „M” (mucoid – śluzowaty) – kolonie gładkie o powierzchni śluzowatej, błyszczącej,
wytwarzane przez bakterie ze śluzową otoczką,
• „L” (L-formy) – powstają spontanicznie lub w niesprzyjających warunkach
środowiskowych. Kolonia taka składa się z komórek bardzo drobnych – przesączalnych,
poprzez formy ziarniste i pałeczkowate, do form olbrzymich o średnicy dochodzącej do 10
µm.
Uwaga: Kolonie bakterii tego samego gatunku znajdujące się w różnych fazach wzrostu mogą
być typu S lub R. Przejściu z fazy S do R towarzyszy zmiana składu polisacharydów. Bakterie
w fazie S są zwykle zjadliwe, tracą zjadliwość w fazie R (są łagodne).
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
10
MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
Wzrost i charakterystyka hodowli na skosie agarowym
Przy posiewie rysowym na skosie bakterie najczęściej nie tworzą wyodrębnionych
kolonii, jednak sposób wzrostu jest również ważną cechą diagnostyczną. Wzrost bakterii na
skosie opisujemy uwzględniając następujące cechy:
o charakter wzrostu: jednolity (w postaci zwartego nalotu komórek); perlisty (tworzą się
oddzielne, niezlewające ze sobą kolonie) o brzegach gładkich, ząbkowanych,
kolczastych, ziarnistych; krzewiasty, nieregularny, itp.;
o powierzchnia rysy: lśniąca, matowa, czasem cienka, sucha błonka;
o struktura: gładka, ziarnista, pofałdowana;
o barwa i przeźroczystość.
Typy wzrostu bakterii w hodowlach rysowych:
1 – drzewiasty
2 – mgławicowy
3 – pierzasty
4 – korzonkowy
5 – perlisty
6 – jednolity
Wzrost drobnoustrojów na słupku w hodowli kłutej
Opisujemy uwzględniając następujące cechy:
o ruchliwość,
o upłynnianie żelatyny (w przypadku bakterii proteolitycznych), a także charakter
upłynnienia wzdłuż nakłucia,
Wzrost bakterii na żelatynie kłutej:
1 – brak upłynnienia
2 – upłynnienie kraterowate
3 – upłynnienie workowate
4 – upłynnienie lejkowate
5 – upłynnienie walcowate
6 – upłynnienie kielichowate
o zależność bakterii od zapotrzebowania na tlen. Określenie stosunku bakterii do
wolnego tlenu polega na badaniu wzrostu na słupku agarowym zaszczepionym igłą
do dna probówki. Bezwzględne tlenowce rosną tylko na powierzchni pożywki;
bezwzględne beztlenowce rosną tylko w dolnych partiach pożywki; względne
beztlenowce rosną na całej wysokości słupka; mikroaerofile rosną tuż pod
powierzchnią pożywki.
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
11
MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI
Ćwiczenie 2
WTŻ II rok
___________________________________________________________________________
Izolacja bakterii Bacillus z gleby
1. Napełnić łaźnię wodną do połowy objętości i podgrzewać na palniku aż do momentu
zagotowania.
2. Dodać w warunkach jałowych (przy palniku) około 1-2 gramów gleby (około pół
łyżeczki) do podpisanej probówki z bulionem odżywczym.
3. Zatkać probówkę i zawartość wymieszać (ostrożnie by nie zabrudzić korka bulionem i
ziemią) i umieścić ją we wrzącej łaźni wodnej na 10-12 minut (uwaga: upewnić się, że
poziom wody w łaźni znajduje się ponad powierzchnią bulionu odżywczego, tak aby
całość probówki uległa jednakowemu podgrzaniu).
4. Wyciągnąć probówkę z łaźni wodnej i schłodzić ją.
5. Inkubować probówkę w temperaturze 32°C przez tydzień.
6. W warunkach jałowych, pobrać oczko ezy bulionu odżywczego i wykonać posiew
redukcyjny na płytkę z agarem odżywczym.
7. Inkubować płytkę tydzień w temperaturze 32°C, aż do uformowania kolonii.
8. Przeszczepić materiał bakteryjny z pojedynczych kolonii na skosy z agarem
odżywczym.
http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/
12