Synteza i charakterystyka DNAzymów z kowalencyjnie przyłączoną
advertisement
Synteza i charakterystyka modyfikowanych DNAzymów opartych na sekwencji ludzkiego telomerowego DNA Anita Nawrocka promotor: prof. dr hab. Bernard Juskowiak, opiekun naukowy: dr Joanna Kosman Pracowania Chemii Bioanalitycznej, Wydział Chemii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza, ul. Umultowska 89b, 61-614 Poznań, e-mail: [email protected] Projekt finansowany z Grantu Narodowego Centrum Nauki nr 2013/10/M/ST4/00490 W ostatnich latach ciekawymi dla naukowców układami stały się DNAzymy o aktywności peroksydazowej. Katalizują one reakcje między nadtlenkiem wodoru a substratami organicznymi [1]. Są to kompleksy złożone z cząsteczki heminy oraz upakowanych w Gkwadrupleks łańcuchów oligonukleotydowych. G-kwadrupleks to złożona struktura występująca u sekwencji bogatych w nukleotydy guaninowe. G-kwadrupleks może przyjmować różne topologie, m.in.: równoległą, antyrównoległą, hybrydową. Możliwa jest również obserwacja układów mieszanych. Wykazano, że najbardziej aktywnymi DNAzymy o aktywności peroksydazowej są te posiadające topologię równoległą. DNAzym posiadający w swym składzie łańcuch telomerowy (5’-AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G-3’) charakteryzuje się topologią hybrydową i niską aktywnością peroksydazową. Celem prowadzonych przez mnie badań jest próba podwyższenia aktywności DNAzymu o aktywności peroksydazowej złożonego z łańcucha telomerowego po przez jego modyfikację grupami LNA oraz przyłączenie niezmodyfikowanego łańcucha w sposób A) LNA to jedna z najsilniej stabilizująca modyfikacja dupleksu DNA/RNA lub DNA/DNA. Zmiana już jednego nukleozydu w sekwencjimoże powodować wzrost trwałości termodynamicznej dupleksów o 3-11oC. Efekt ten spowodowany jest przejściem konformacyjnym części cukrowej nukleotydu będącego w sąsiedztwie z modyfikowanym.Dzięki temu możliwe jest wymuszenie na sekwencji telomerowej zmiany topologii z hybrydowej na równoległą [4]. B) Rys. 1. A) DNAzym o aktywności peroksydazowej, B) Reakcja utlenienia ABTS [2,3]. kowalencyjny do cząsteczki heminy. Rys.2. Porównanie struktur DNA, RNA i LNA [5]. Tab. 1 Sekwencje używane w badaniach Nazwa Sekwencja HT22 5’-AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G-3’ 5’-DBCO-HT22 5’-DBCO-AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G-3’ HT22-DBCO-3’ 5’-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGT-DBCO-3’ HT22-DBCO-pętla 5’-AGGGTT(DBCO)AGGGTTAGGGTTAGGG-3’ LNA1 5’-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGLGG-3’ LNA2 5’-AGGGTTAGLGGTTAGGGTTAGLGG-3’ LNA3 5’-AGLGGTTAGLGGTTAGGGTTAGLGG-3’ Wykonano trzy syntezy, w których przyłączenia heminy dokonano kolejno w trzech różnych miejscach sekwencji: w miejscu 5’, 3’ i w pętli. Kowalencyjne połączenie heminy do DNA sprzyja podwyższeniu trwałości związku podnosząc ich temperaturę topnienia nawet o 20°C. Wykazują również wyższą aktywność. Zdolności katalityczne telomerowych DNAzymów po syntezie wzrastają 10-krotnie w porównaniu do aktywności zwykłych kompleksów. Innym ciekawym faktem związanym z kowalencyjnie złożonymi DNAzymami jest tworzenie się aktywnych struktur mimo braku tradycyjnie potrzebnych do stabilizacji kationów najlepiej jednowartościowych metali. Rys. 3. Koniugat HT22-Hemina Tab. 3. Porównanie pKa wszystkich związków badanych w różnych stężeniach surfaktantu: A) z modyfikacjami LNA, B) z kowalencyjnie przyłączoną heminą. A) pKa B) Rys. 6. Zestawienie maksymalnych absorbancji kompleksów i koniugatów bazujących na sekwencji telomerowej w różnych środowiskach reakcji. Tab. 2. Porównanie temperatur topnienia sekwencji telomerowej, z kowalencyjnie przyłączoną heminą oraz zmodyfikowanych grupami LNA. Substancja badana Rys. 5. Widma CD DNAzymów otrzymanych na podstawie sekwencji telomerowej. Pomiarów dokonywano przy λ=295 nm. Literatura 1. Kosman J., Juskowiak B., Anal. Chim. Acta 2011, 707:7. 2. D. Sen, L.C.H. Poon, Crit. Rev.Biochem. Mol., 2011; 46(6): 478–492. 3. X. Yang, T. Li, B. Li, E. Wang, Analyst 135 (2010) 71-75. 4.Pasternak A., Kierzek R. Na pograniczu chemii i biologii. 2007. Tom XVIII, UAM 41-87. 5.A. Randazzo, V. Esposito, O. Ohlenschlager, R. Ramachandran, A. Virgilio, L. Mayol, 24 (5 – 7):795–800, (2005) Copyright D Taylor & Francis. Potas Sód Bez kationów Amon HT22 64.0±0.4 54.8±0.2 poniżej 20 48.2±0.4 HT22+Hemina 64.9±0.5 57.8±0.5 poniżej 20 - HT22 5’-Hemina - - - - HT22 3’-Hemina 73.8±0.2 71.6±0.2 38.15±.9 - Ht22 P-Hemina powyżej 80 69.7±1.2 41.0±0.1 - LNA1 66.1±0.9 52.7±0.1 poniżej 20 39.7±0.7 LNA2 71.5±4.0 45.5±3.5 poniżej 20 32.8±0.2 LNA3 75.2±1.8 48.0±2.0 poniżej 20 51.7±0.2 Surfaktant LNA1 LNA2 LNA2 HT22 8,1±0,2 pH>10 pH>10 7,6±0,1 HT22/Hemina HT22 5’-Hemina HT22 3’-Hemina HT22 P-Hemina Bez Tritonu x100 7,7 pH>10 pH>10 pH>10 0,0137% Triton x100 7,6 brak brak brak 0,0016% Triton x100 7,5 brak brak Brak Wnioski: -Potwierdzono zależność między ilością wprowadzonych modyfikacji LNA oraz wzrostem aktywności katalitycznej tworzonego DNAzymu. Wprowadzenie modyfikacji oddziałuje na cząsteczkę zmuszając ją do zmiany jej topologii z hybrydowej na równoległą. -Najwyższą aktywność zauważono w przypadku sekwencji LNA3, która przyjmuje topologię równoległą niezależnie od środowiska w którym się znajduje. -Z powodzeniem dokonano kowalencyjnego przyłączenia heminy do oligonukleotydu o sekwencji telomerowej stosując chemię „click”. Otrzymane koniugaty charakteryzują się większą stabilnością i aktywnością. Układy te mogą być wykorzystane w opracowaniu nowych i czułych metod bioanalitycznych. W szczególniości tyczy się to koniugatu HT22 P-Hemina charakteryzujący się najlepszymi parametrami.
