PPS

Uniwersytet Warszawski
Wydział Fizyki
Instytut Fizyki Doświadczalnej
Zakład Biofizyki
VI FESTIWAL NAUKI
Fizyka wyjaśnia podstawy zjawisk biologicznych
Borys Kierdaszuk
Tel.: 55 40 715
Fax: 55 40 001
[email protected]
Jaka dziedzina fizyki bada zjawiska biologiczne?
str. 588
PWN, 1972
Fizyka,
nauka o formach materii (zw. czasami
formami pierwotnymi lub uniwersalnymi)
właściwych wszystkim prostym
i złożonym układom materialnym,
o oddziaływaniu tych form oraz ich ruchu.
(...) bada cząstki elementarne, jądra
atomowe, atomy i cząsteczki (wraz z
makrocząsteczkami), zbiory
makroskopowe cząstek materialnych –
ciała stałe (kryształy), ciecze i gazy (...),
pola wiążące cząstki – pola
elektromagnetyczne, grawitacyjne, ...
(...) dzieli się na szereg działów (f. cząstek elementarnych, f. jądra
atomowego, f. atomu, f. cząsteczki, f. ciała stałego,...
Związek fizyki z innymi naukami przyrodniczymi
doprowadził do powstania dyscyplin pogranicznych –
biofizyki, astrofizyki, geofizyki, chemii fizycznej, ...
str. 192 Biofizyka,
dział nauki rozwijający się od
niedawna, zajmujący się podstawami
fizycznymi makroskopowych i
molekularnych procesów życiowych
(...) oraz oddziaływaniami
zewnętrznych czynników fizycznych
na te układy.
PWN, 1972
Jest typową międzydyscyplinarną
dziedziną nauki.
Niektóre składniki molekularnych i
makroskopowych procesów życiowych
Tkanki Mięśnie, . . .
Komórki K. Mięśniowe, K. Macierzyste,...
Organizmy zakaźne
Bakterie, pasożyty, . .
Cząstki zakaźne
Wirusy, wirusoidy, wiroidy, . . .
Makrocząsteczki
Białka, kwasy nukleinowe, . . .
Cząsteczki
Jony
Atomy
Protony, neutr., elektrony
Aminokwasy, nukleozydy, lipidy
+2Ca, +Na, +K,
C, N, O, S, H, . . .
+
-
Wszystkie organizmy używają do budowy swoich
makrocząsteczek (np. białek, kwasów nukleinowych, ...)
tych samych elementów konstrukcyjnych
Te same oddziaływania molekularne stanowią o istocie
odwracalnych reakcji molekularnych będących
przejawem wszystkich form życia:
• oddziaływania elektrostatyczne:
F = q1q2/(r2),  - stała dielektryczna
• wiązania wodorowe:
X-H . . . Y, gdzie X, Y = O, N
• oddziaływania van der Waalsa.
Celem Biofizyki jest zbadanie
fizycznych podstaw procesów życiowych za pomocą
metod doświadczalnych, między innymi:
rentgenograficznych,
spektrofotometrycznych,
jądrowego rezonansu magnetycznego,
elektronowego rezonansu paramagnetycznego,
(. . .)
oraz teoretycznych:
mechaniki kwantowej cząsteczek
elektrodynamiki, termodynamiki, (. . .)
Podejście to powinno zaowocować poznaniem
wspólnych praw dla różnych przejawów życia
Działy biofizyki z pogranicza fizyki, biochemii,
fizjologii i anatomii
• Biomechanika
• Fizyka narządu słuchu
• Optyka oka i procesów widzenia
• Fizyka krwiobiegu
• Bioenergetyka (termodynamika układów otwartych)
• Procesy życiowe na poziomie molekularnym:
- budowa biopolimerów,
- przetwarzanie informacji genetycznej,
- kataliza enzymatyczna,
- fotosynteza,
Intensywny rozwój kontaktów między fizyką i biologią
nastąpił z chwilą wejścia zarówno fizyki jak i biologii
w badania struktur cząsteczkowych
Terminu Biofizyka użyto po raz pierwszy w 1892 r.
Szczególnie stymulujący wpływ na zainteresowanie
fizyków problematyką zjawiska życia wywarła książka
jednego z twórców mechaniki kwantowej, Erwina
Schrödingera pt. Co to jest życie – fizyczne podstawy życia
komórki.
Dynamiczny rozwój biologii w drugiej połowie ubiegłego
stulecia zawdzięczamy w znacznym stopniu fizykom.
Zwraca uwagę na trudną do
wyjaśnienia sprzeczność
między konserwatywnym
uporządkowaniem procesów
życiowych, a prawami fizyki
statystycznej ?
Wkrótce fizycy przyczynili się do
odkrycia mechanizm przekazywania
informacji genetycznej.
Sprzeczność ta okazała się pozorna, bo
w komórce istnieją zespoły enzymów,
które zapobiegają niedokładnościom
procesu replikacji DNA, oraz inne
zespoły enzymatyczne, które
naprawiają większość błędów.
Decyzję o utworzeniu Katedry Biofizyki
na Wydziale Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego
podjęto w 1967 r., a jej organizację powierzono
Prof. Davidowi Shugarowi
Była to pierwsza Katedra Biofizyki na Wydziale Fizyki
Jej powstanie było możliwe dzięki poparciu
Wydziału Fizyki UW, Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN
oraz wielu współpracowników z innych ośrodków
naukowych
Białko jest jednym z głównych składników
żywych organizmów na Ziemi

Białko (ang. Protein, gr. Proteios – pierwszorzędny)
termin wprowadzony przez J.J. Berzeliusa w 1883 r.

Ponad milion organizmów żyjących na Ziemi
zawiera około 10 miliardów (1010) różnych rodzajów
cząsteczek białkowych.

Wszystkie białka to polimery liniowe.
 Składniki polimerów białkowych:
tylko 20 różnych aminokwasów, które różnią się
własnościami chemicznymi i fizycznymi.
Odmienna ilość i kolejność ułożenia aminokwasów w
liniowych łańcuchach polimerowych stwarza
niewiarygodną różnorodność trójwymiarowych struktur
Polimer 100-aminokwasowy:
Możliwe są 20100 (~10130) różne sekwencje
Struktura przestrzenna białka:
Sekwencja
+
Środowisko
Struktura
Funkcja
Polimer liniowy
N mieszany
C
Lokalnie
Pofałdowana
Kartka 
20 typów ogniw
(20 aminokwasów)
Helisa 
Białko natywne
Modele prawoskrętnej helisy 
skok 0.15
nm rotacja
100o
A
B
0.5 nm
C
Antyrównoległa pofałdowana Kartka 
Metody badania struktur przestrzennych
białek
I. Krystalografia:
 Rentgenografia i neutronografia:
wyznaczenie położenia jąder atomów w białku
- Jedna z wielu możliwych konformacji.
II. Metody spektroskopowe:
 Wielowymiarowy magnetyczny rezonans jądrowy (NMR):
struktura trójwymiarowa
 Spektroskopia absorpcyjna w zakresie podczerwieni (IR):
względny udział struktur lokalnych
 Metody teoretyczne: struktura trójwymiarowa.
 Spektroskopia absorpcyjna i emisyjna w zakresie UV i Vis:
odległości między cząsteczkami
 Spektroskopia dichroizmu kołowego (CD):
konformacja cząsteczek
 Metody hydrodynamiczne (ultrawirowanie w gradiencie gęstości):
masy i kształty cząsteczek
Krystalograficzna struktura na poziomie atomowym
promienie rozproszone
wiązka
Źródło prom. X
kryształ
dyfrakcja
Rozpraszanie jest
proporcjonalne do liczby
elektronów.
rentgenogram
Fale rozproszone
nakładają się.
Nakładanie się fal zależy
wyłącznie od rozkładu
przestrzennego atomów.
struktura
białka
Zasada spektroskopii NMR
częstotliwość rezonansowa o = (Ho+Hlok)/2
spin 
E
Jądro
(J = ½)
przejście między
stanami spinowymi
daje linie NMR
spin 
wzrost Bo
napromieniowanie
Jednowymiarowe widmo NMR białka wiążącego
wapń (kalmoduliny)
przesunięcie chemiczne (ppm)
protonowe przesunięcie
chemiczne (ppm)
Oddziaływanie sąsiednich jąder (efekt Overhausera)
umożliwia identyfikację sąsiadujących par protonów
i pomiar odległości między nimi
0.5 nm
protonowe przesunięcie
chemiczne (ppm)
Porównanie struktury białka (plastocjaniny)
wyznaczonej za pomocą rentgenografii (niebieski) i NMR
(czerwony)
1 nm
Dichroizm kołowy zawiera informację
o konformacji białka
 (cm –1 M -1)


Kłębek statystyczny
Długość fali, nm
Struktury przestrzenne białek
HEMOGLOBINA
IZOMERAZA FOSFPORANÓW
IMMUNOGLOBULINA
DEHYDROGENAZA
ALKOHOLOWA
Jedną z kluczowych funkcji białek jest
aktywność katalityczna
Katalizatory białkowe (enzymy) umożliwiają zachodzenie
w żywych komórkach reakcji chemicznych, które
zachodziłyby w ich nieobecności z niezauważalną
szybkością lub nie zachodziłyby w ogóle.
Najważniejszymi cechy enzymów są:
(a) wysoka specyficzność zarówno wobec typu reakcji
jak i związków chemicznych (substratów)
ulegających przemianie w produkty,
(b) zależność aktywności od fazy rozwoju komórki
(organizmu) realizowanej między innymi poprzez
oddziaływanie z produktami przemiany materii
zwanych inhibitorami.
Działanie enzymu –
fosforylazy nukleozydów purynowych (PNP)
PNP
PNP
+
nukleozyd
purynowy
fosforan
PNP
+
rybozo-1-fosforan
zasada purynowa
Dlaczego badamy ten enzym?
1. Całkowity brak jego aktywności jest przyczyną
upośledzenia odporności immunologicznej; jest
śmiertelny.
2. Z drugiej strony, kontrolowane zmniejszenie jego
aktywności może zapobiegać:
odrzutom przeszczepów organów, np. serca,
chorobom autoimmunologicznym,
niektórym rodzajom nowotworów (białaczek),
degradacji aktywności terapeutycznej niektórych
pochodnych jego substratów, np. w leczeniu AIDS.
3. Różnice między enzymami z różnych organizmów
(np. bakterii i człowieka) mogą być wykorzystane w
”samobójczej” terapii genowej nowotworów.
Struktura enzymu z parami (substrat + inhibitor) w
jego miejscach aktywnych
substrat
inhibitor
Poznanie struktury przestrzennej jest jednym z elementów
strategii konstruowania bardzo dobrych substratów i inhibitorów
Struktura krystalograficzna kompleksu
PNP (E.coli) z Formycyną B
Asp204
Arg217
H
Ser90
W61
H
W62
W60
Met180N
His4
(neighbour)
W63
Tyr160
Phe159
Identyfikacja protonów (tzw. form tautomerycznych) za
pomocą badań rentgenograficznych nie jest możliwa
Oddziaływanie PNP z inhibitorem – formycyną A ?
H
H
N
N
N
N
N
H
O
HO
HO
H
OH
O
HO
C H
C
N
HO
C
forma 1
85%
N
N
O
HO
C
OH
HO
forma 2
15%
C
OH
substrat PNP
0.10
-0.13
-0.51
-0.48
N
N
N H
C
N
H
H
N
H
N
N
H
H
-0.08
0.09
Mapa
gęstości
elektronowej
i ładunki netto
Zjawisko absorpcji i emisji fotonów


absorpcja
emisja
Długość fali światła ()
Badamy różnicę między absorpcją fotonów
substratu i produktu w zależności od czasu
ABSORPCJA
0.3
Substrat
0.2
0.1
Produkt
0.0
240
260
280
300
DŁUGOŚĆ FALI, nm
PRODUKT, %
100
80
60
40
20
0
320
100 % Substratu
0
5
10
CZAS, min
15
Badamy różnicę między emisją fotonów
substratu i produktu w zależności od czasu
12
380
Substrat
EMISJA
10
8
6
4
342
2
0
350
Produkt
400
450
500
DŁUGOŚĆ FALI
PRODUKT, %
100
80
60
40
100 % substratu
20
0
0
5
10
CZAS, min
15
Szybkość reakcji enzymatycznej, %
Opis reakcji enzymatycznej: Vmax, Km, Ki
Szybkość maksymalna
100
Hyperbola
80
60
Połowa szybkości
40
Km
20
0
0
10
20
30
40
50
Stężenie substratu, M
60
Widma absorpcji i emisji PNP i FA
Fluorescencja
341
408 428
FA
PNP
278 294 305
Fosforescencja
FA
WZGLĘDNE NATĘŻENIE
1.2
PNP
1.4
FA
PNP
Absorpcja
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
250
300
350
400
DŁUGOŚĆ FALI, nm
450
500
Względne natężenie fosforescencji dla formy N(2)-H
jest znacząco mniejsze niż dla formy N(1)-H
442
1.2
WZGLĘDNE NATĘŻENIE
347 353
1.0
370
0.8
exc 302 nm
1
m FA
0.6
0.2
0.0
300
exc 306 nm
470
0.4
2
m FA
350
400
450
500
DŁUGOŚĆ FALI, nm
550
600
Równowaga tautomeryczna FA w kompleksie z
enzymem jest przesunięta na korzyść formy N(2)-H
Kierdaszuk et al., BBA, 1476, 109-128 (2000)
WZGLĘDNE NATĘŻENIE
Powstanie kompleksu enzym-FA jest przyczyną
znacznie większego wzrostu fluorescencji niż
fosforescencji FA
2.0
180 K
exc 294 nm
429
5
mM
P
i
1.5
338
FA
370
1.0
MIX
0.5
MIX
exc320 nm
0.0
300
350
400
450
500
DŁUGOŚĆ FALI, nm
550
Włodarczyk et al., 2002
Komplementarność badań spektralnych (w
roztworze) i krystalograficznych (w ciele stałym)
Asp204
Arg217
W61
Ser90
H
W62
W60
Met180N
His4
(neighbour) Phe159
W63
Tyr160
Spectroskopowa identyfikacja form tautomerycznych
usunęła niepewności w badaniach krystalograficznych
Wnioski:
1. Identyfikacja preferowanej struktury inhibitora
(różniącej się od innych położeniem wodoru),
preferowanej przez enzym.
2. Rozszerzenie wiedzy o mechanizmie działania PNP.
3. Możliwe wykorzystanie tej wiedzy w racjonalnym
planowaniu leków o lepszej i bardziej selektywnej
aktywności terapeutycznej.
(Bio)fizyka wobec chorób XXI wieku
Na przykładzie chorób neurodegeneracyjnych,
(encefalopatii gąbczastych: CJD, vCJD, Kuru, FFI)
Mikroskopowy obraz histopatologiczny
M. elektronowy
M. fluorescencyjny
Podobne objawy:
• Utrata percepcji
• Otępienie
• Degeneracja szarych
komórek mózgu
Śmiertelne encefalopatie gąbczaste
Zwierząt:
Scrapie owiec – Leopoldt, Podręcznik Weterynarii, 1759
przypadkowa lub zakaźna
Gąbczasta encefalopatia bydła (BSE), tzw. Choroba
szalonych krów –znana od 1986 r.
zakaźna
Człowieka:
Choroba Creutzfelda-Jacoba (CJD) – 1920 r.
zakaźna, dziedziczna lub przypadkowa
Nowa wersja CJD (vCJD) – od 1996 r.
Choroba Kuru – od 1957 r.
zakaźna
tylko zakaźna
Śmiertelna dziedziczna bezsenność (FFI) tylko dziedziczna
Liczba chorych krów
Krowy zostały zakażone chorobą podobną do
Scrapie owiec, karmą zawierającą resztki
chorych owiec
10 000
8000
Zakaz używania resztek
zwierząt (owiec)
do produkcji pasz
6000
4000
2000
1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996
Wpływ zakazu używania resztek zwierząt (owiec) do
produkcji pasz (1988 r.) na liczbę przypadków choroby
szalonych krów (BSE) w Wielkiej Brytanii.
Encefalopatie gąbczaste mózgu budziły
wątpliwości co do możliwości ich wyjaśnienia
za popmocą znanych czynników zakaźnych
Dlaczego?
Czynnik zakaźny choroby Scrapie owiec:
Masa cząsteczkowa ~105, typowa dla białek(!), znacznie
mniejsza niż znanych wirusów.
Odporny na czynniki degradujące materiał genetyczny
(promieniowanie jonizujące, nadfioletowe ~254 nm).
Podatny na czynniki chemiczne degradujące białka.
Odporny na temperatury do 130 oC, znacznie bardziej
niż typowe białka.
Alper et al.., (1966) BBRC, 22,
278-284.
Griffith (1967) Nature, 215, 1043-
Poxvirus
150
HSV
fag 
Adenovirus
15
Paramyxovirus
+
+
Flaviviruses
1.5
104
d/s DNA
Scrapie
30
Polyomavirus
174
TMV +
+
s/s RNA
3
+
105
106
Dawka promieniowania (rad)
107
Genom s/s RNA (x10-3 par zasad)
Genom d/s DNA (x10-3 par zasad)
Dawka promieniowania wymagana dla likwidacji
infekcyjności czynnika zakaźnego zależy od
wielkości jego genomu
Jeśli kwas nukleinowy, to o długości < 80 nukleotydów
Griffith (1967) sugerował, że czynnikiem
zakaźnym może być wyłącznie białko
Białko to nazywane jest obecnie
PRION (PROteinacious Infectious Agent)
Białkowy czynnik infekcyjny
S.B. Prusiner, 1982
(Nagroda Nobla, 1997)
Krowy mogły być zakażone chorobą Scrapie
owiec, a człowiek – chorobą BSE krów
Zakażenie człowieka chorobą owiec jest raczej wątpliwe,
ze względu na różnice między genami kodującymi białko
podejrzane o wywołanie infekcji
Przykładowe różnice między genami
Owcy i krowy
7 aminokwasów
_
3 (%)
Myszy i chomika
16
„
6
Człowieka i krowy
30
„
12
Człowieka i myszy
28
„
11
104
„
41
Człowieka i kury
Badania Biotechnologiczne
Wyodrębniono białko zakaźne.
Dokonano identyfikacji jego genu.
Okazało się, że ten sam gen koduje zarówno białko
zakaźne jak i . . . . białko normalne (!).
Z nieznanych przyczyn, białko zakaźne dodane do
roztworu białka normalnego przekształca je w agregaty
białka zakaźnego. Podobnie zachowują się białka
pomocnicze, tzw. ”chaperones”.
Białka normalne i chorobotwórcze nie różnią się pod
względem składu chemicznego.
Wyjaśnienia infekcyjnych własności należy zatem szukać
w różnicach strukturalnych między białkiem normalnym i
zakaźnym.
Spektroskopia absorpcyjna w zakresie IR
Wpływ oddziaływań elektrostatycznych (wiązań
wodorowych) na stany oscylacyjne grup C=O i N-H:
Białko natywne:
C=O    H-N
Chaotyczny kłębek:
brak wiązań wodorowych
Agregaty białka zakaźnego
Korzystamy ze spektroskopii absorpcyjnej modelowych
struktuyr II-rzędowych:
(a) helisa  i kartka : 1685 i 1625 cm-1,
(b) kłębek, skręt: 1641 i 1672 cm-1,
(c) Agregaty białka zakaźnego
Dichroizm kołowy zawiera informację
o konformacji białka
 (cm –1 M -1)


Kłębek statystyczny
Długość fali, nm
Najważniejsze wyniki zastosowania spektroskopii
absorpcyjnej w podczerwnieni i CD
Udział (%) struktur przestrzennych w formie normalnej
i zakaźnej białka prionowego
Białko
Kartka

Normalne
3
Zakaźne
43
Helisa

42
30
Skręt
Kłębek
32
23
11
16
Błąd względny: 10 %.
Pan K.-M. et al., PNAS, 90, 10962 (1993)
Struktura białka prionowego naturalnego z myszy
(fragment 121-231)
Trzy helisy  ułożone w strukturę V
Dwuniciowa antyrównoległa kartka 
Potencjał
elektrostatyczny
na powierzchni
Dokłądność
położenia C
Riek R. et al., Nature
382, 180-182 (1996)
Structura doświadczalna białka prionowego
naturalnego (fragment 121-231)
Białko
naturalne
Riek R. i wsp. Nature
382, 180-182 (1996)
Struktury przewidywane teoretycznie na
podstawie sekwencji aminokwasów
Huang Z. et al., Folding and Design 1, 13-19 (1995).
infekcyjne
naturalne
Znaczenie poznanej struktury dla wyjaśnienia
roli mutacji w chorobach dziedzicznych
Mutacje genu mogą ułatwiać przemianę
strukturalną normalnego białka w zakaźne
Podsumowanie
Obie formy białka, normalne i zakaźne mają taki sam skład
chemiczny, różnią się tylko strukturą przestrzenną.
Białko normalne: 42 % helis ,
Białko zakaźne:
30
„
3 % kartek 
43
„
Autokatalityczne
przekształcenia
struktury
kolejnych cząsteczek białka normalnego.
przestrzennej
Mutacje genu mogą ułatwiać przemianę strukturalną normalnego
białka w zakaźne na skutek destabilizacji struktury -helikalnej
na korzyść pofałdowanej -kartki.
Rozwój chorób polega na powstawaniu nierozpuszczalnych
włókien białkowych i ubytków w komórkach ośrodkowego
układu nerwowego. Związana z tym postępująca degeneracja
kończy się śmiercią.
Czy czynnik infekcyjny składa się tylko z białka?
Hipotezy alternatywne
Znane od 30-tu lat:
Problemy (1974)
Scientific American (1974).
I. Mniej ortodoksyjna hipoteza prionowa:
Konwersja białka normalnego w zakaźne zwiększa możliwość
zakażenia nieznanymi wirusami, co jest widoczne w postaci wielu
odmian encefalofatii gąbczastych.
II. Hipoteza “powolnego wirusa”:
Czynnik zakaźny = białko + DNA (lub RNA)
(prionowe)
(wirusowy)
Składnik ”wirusowy” indukuje przekształcenie białka normalnego
w formę zakaźną.
 Wirus występuje w organizmie gospodarza.
 Działa znacznie wolniej niż typowe wirusy.
Podstawowe problemy
Czy istnieje wiele struktur przestrzennych białka
prionowego, które mogłby wyjaśnić różne odmiany
encefalopatii gąbczastych?
Jaki jest mechanizm
naturalnej w zakaźną?
przekształcenia
struktury
Jaką rolę pełni naturalne białko prionowe?
W jaki sposób białka zakaźne przenikają przez
błony międzykomórkowe i dostają się do mózgu?
Czy rysują się perspektywy:
 Diagnostyki przed wystąpieniem objawów choroby ?
 Testowania żywności ?
 Leczenia ?
PODZIEKOWANIA
GERASIM STOYCHEV
JAKUB WLODARCZYK
Doktoranci
ZAKŁAD BIOFIZYKI
UW
ANNA MODRAK-WÓJCIK
Adjunkt
ZAKŁAD BIOFIZYKI
UW
DAVID SHUGAR
JACEK WIERZCHOWSKI
Profesorowie
ZAKŁAD BIOFIZYKI (UW)
AKADEMIA PODLASKA/SIEDLCE
KOMITET BADAŃ NAUKOWYCH (KBN)
FUNDACJA NA RZECZ NAUKI POLSKIEJ (FNP)